DIE DIAGNOSTIK ENTEROHÄMORRHAGISCHER ESCHERICHIA COLI (EHEC) IM LEBENSMITTELN:

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1 DIE DIAGNOSTIK ENTEROHÄMORRHAGISCHER ESCHERICHIA COLI (EHEC) IM LEBENSMITTELN: AKTUELLER STAND M. MANAFI, Hygiene-Institut, Universität Wien. Zu den bekannten Gruppen pathogener E. coli gesellte sich 1982 ein weiterer Vertreter, die enterohämorrhagischen E. coli (EHEC). Damals wurde bei zwei Ausbrüchen von schwerem blutigen Durchfall in den US-Bundesstaaten Oregon und Michigan festgestellt, daß ein bestimmter Serotyp von E. coli (O157:H7) für die Erkrankungen verantwortlich war. Als Quelle des Erregers wurden ungenügend erhitzte Hamburger eruiert. Die Ausbrüche in Japan (1996, etwa Fälle und 10 Tote) und Schottland ( , 470 Fälle mit 18 Toten) sind die größten Epidemien, die beschrieben wurden. Die WHO hat EHEC kürzlich als Erreger mit der größten Ausbreitungstendenz eingestuft. EHEC verursachen das klinische Bild einer hämorrhagischen Kolitis (HC) und des hämolytischen Urämiesyndroms (HUS). Nach einer Inkubationszeit von 3 bis 9 Tage bekommt der Patient Darmkrämpfe und wäßrige Durchfälle, die bei 30% der Erkrankten in hämorrhagischen Kolitis (HC) übergeht. HC äußert sich durch blutige Diarrhöe, die mit Darmkrämpfen und eventuell mit Erbrechen beginnt und, die ohne Behandlung, nach ungefähr einer Woche wieder abklingt. Im Anschluß entwickelt sich in 5-10% ein HUS. Beim HUS kommt es zur hämolytischen Anämie mit Trombozytopenie und schweren Nierenversagen mit häufig letalen Ausgang. Diagnostik: Der kulturelle Nachweis von EHEC, vor allem in Lebensmitteln, wird erschwert zum einen durch die biochemische Ähnlichkeit dieser Erreger mit den kommensalen der Darmflora und zum anderen erfolgt die Ausscheidung von EHEC in nur geringem Maß und intermittierend (1 EHEC auf E. coli der physiologischen Darmflora). Weiters können die auf Bakteriophagen oder Plasmiden liegenden Virulenzgene auf viele E. coli -Serogruppen übertragen werden, so daß die Anzahl der EHEC-Serogruppen ständig steigt (bisher über 160 beim Menschen). Zur Sicherung der Diagnose kann bei HUS-Patienten der Nachweis von Antikörpern gegen das Zellwandantigen Lipopolysaccharid (LPS) angewandt werden. Im Gebrauch sind der Hämagglutinationstest und der Immunoblot mit der Möglichkeit IgM und IgG getrennt nachzuweisen. Bei Temperaturen oberhalb 44,5 C ist das Wachstum von E. coli O157:H7 stark eingeschränkt. Dieses Bakterium kann im Gegensatz zu zahlreichen anderen pathogenen Keimen im sauren Milieu überleben. Es wurde 1993 von einem Krankheitsausbruch berichtet, der mit dem Konsum von frisch gepreßten Apfelsaft in Verbindung gebracht wurde. Ein weiteres Beispiel, daß O157:H7 in sauren Lebensmitteln überleben kann, ist ein Infektionsausbruch nach Konsum von Mayonnaise bzw. von mayonnaisehältigen Saucen und Dressings. Eine weitere Eigenschaft, die bei O157:H7 im Zuge einer Studie entdeckt wurde, ist die Resistenz gegen bestimmte Antibiotika. Frühere Untersuchungen ergaben, daß E. coli O157:H7 Isolate den meisten Antibiotika gegenüber empfindlich sind. Bei einer kürzlichen Untersuchung waren jedoch 7,4% der getesteten Keime resistent gegen Streptomycin, Sulfisoxazol und Tetracyclin. Direkte Nachweisverfahren: Sorbitol-MacConkey-Agar (SMAC): Im Gegensatz zu 95-98% der physiologischen E. coli, sind die typischen Serotypen O157:H7 nicht befähigt, Sorbit innerhalb 24 Stunden zu fermentieren und unfähig beta-glucuronidase (GUD, ein Enzym, der bei 96-98% von E. coli Stämmen vorkommt) zu produzieren. GUD Aktivität und Sorbitfermentation fanden Eingang in die Labortechnik, indem verschiedene Nährmedien mit Sorbitol und chromogenen/fluorogenen enzymsubstraten der GUD supplementiert

2 indem verschiedene Nährmedien mit Sorbitol und chromogenen/fluorogenen enzymsubstraten der GUD supplementiert wurden. Von diesen Typus Medien sind der SMAC, SMAC-MUG und SMAC-BCIG. Typische E. coli 0157:H7 können im Gegensatz zu 96-98% der physiologischen E. coli, Sorbitol nicht fermentieren und somit wegen Nicht-Umschlagens des Indikators als farblose Kolonien erkannt werden. Die Inkubation dieser Nährmedien erfolgt bei C. Sorbitol-negative Kolonien werden anschließend weiteren biochemischen Prüfungen unterzogen und zur Bestätigung mit den spezifischen Antiseren serotypisiert. Es wurden, vor allem in Deutschland und USA, atypische Stämme der Serogruppe 0157:H7 im Stuhl von HUS- Patienten entdeckt, die Sorbitol vergären konnten bzw. ß-Glucuronidase positiv sind. Weiters wurde festgestellt, daß einige Bakterien wie H. alvei, Sorbitfermentierend sind und falsch-positive Ergebnisse auf SMAC geben können (Bis zu 50% bei den Fleischproben!). Der Einsatz von SMAC vor allem ohne Supplement (Cefixim, Novobiocin und Tellurit) muß in Frage gestellt werden. Einige Abwandlungen von SMAC-Agar wurden entwickelt, mit dem Ziel die Selektivität für E. coli O157:H7 zu erhöhen. Es wurde festgestellt, daß der Zusatz von 5-Brom-4-Chloro-3-Indoxyl-beta-D-Glucuronid (BCIG) verglichen mit gewöhnlichem SMAC-Agar die Zahl falsch verdächtiger E. coli O157:H7 um 36% verringert. An einer anderen Stelle wird der Zusatz geringer Mengen Tellurit und Cefixim beschrieben (CT-SMAC), deren wachstumshemmende Wirkung für E. coli O157:H7 bei einer höheren Konzentration liegt als für andere nicht Sorbitolfermenter, wie zum Beispiel Plesiomonas shigeloides., Morganella morganii, Providencia und H. alvei. Es wurde eine Methode entwickelt bei der das Lebensmittel in mtsb-medium angereichert wurde. Nach vollzogener Anreicherung folgte eine immunomagnetische Seperation und Kultivierung auf CT-SMAC-Medium. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, daß nicht Sorbitolfermenter wie H. alvei, die bei Fleischuntersuchungen häufig Probleme verursachen, gehemmt werden. Bei CR-SMAC Medium wurde dem gewöhnlichen SMAC-Agar Cefixim und Rhamnose zugesetzt. Ein positiver Befund auf SMAC muß auf jedem Fall durch Agglutination mit einem Antiserum und Nachweis des Shiga Toxins bestätigt werden. Es wurden einige neue Selektivmedien mit flourogenen oder chromogenen Enzymsubstraten entwickelt, um die Effizienz des O157:H7-Nachweises zu erhöhen. Zu diesen Medien zählen CHROMagar (CHROMagar, France), Rainbow-Agar O157 (RB, Biolog, USA), BCM O157:H7-Agar (BCM, Biosynth, USA) und Flourocult H7-Agar (H7, Merck, Deutschland) und O157:H7 ID Agar (biom rieux, France). EHEC O157:H7 Stämme erscheinen auf CHROMagar als charakteristisch rosarot bis violett gefärbte Kolonien, während physiologische E. coli als blaue oder in seltenen Fällen als farblose Kolonien erscheinen. E. coli O157:H7 Stämme unterscheiden sich auf BCM-Agar durch eine dunkelblaue bis schwarze Färbung der Kolonien deutlich von anderen Bakterien, und sind daher auf diesem Medium sehr leicht nachzuweisen. Ein weiteres Merkmal ist, daß das Nährmedium bei E. coli O157:H7 keinen Farbumschlag zeigt, das heißt der Agar seine rote Farbe behält, während es bei vielen anderen Bakterien auf Grund des Abbaus von Kohlehydraten zu einer Säurebildung kommt, was in einem Farbumschlag des Agars von rot nach gelb sichtbar wird. Rainbow Agar ist neben BCM-Agar ein neuartiges Nährmedium um E. coli O157:H7 nachzuweisen. Dieser Agar enthält zwei chromogene Substrate, welche von den beiden typischen E. coli Enzymen beta-galaktosidase (ein blau-schwarzes chromogenes Substrat) und GUD (ein rotes chromogenes Substrat) abgebaut werden. Physiologische E. coli- Stämme bilden auf diesem Agar rote, fuchsinrote, violette, blaue oder schwarze Kolonien. E. coli O157:H7 bilden auf Rainbow Agar graue oder schwarze Kolonien. Andere verotoxische E. coli, die nicht zu den O157 zählen bilden violette oder blaue Kolonien. Rainbow agar wurde von BETTELHEIM (1998) evaluiert. Bei dieser Studie wurden 585 E. coli verschiedener Serogruppen, unter anderem O157, O111 und O113, auf Rainbowagar kultiviert. EHEC O157 zeigten typisch schwarze Kolonien Vertreter der Serogruppe O113 und einige andere Serogruppen erschienen als rote oder pinke Kolonien und konnten somit von SLT negativen E. coli nicht unterschieden werden. Rainbow Agar BCM Agar Chromagar

3 Die typische E. coli O157:H7 Stämme bilden auf Flourocult E.coli O157:H7-Agar auf Grund mangelnder Sorbitverwertung und fehlender GUD blaugrüne Kolonien ohne Fluoreszenz, während andere E. coli Stämme als fluoreszierende, blaugrüne oder gelbe Kolonien erscheinen. Enterohämolysin-Agar: Durch Anzucht auf diesem bluthaltigen Nährboden kann man den durch EHEC-Hämolysin verursachten enterohämolytischen Phänotyp nachweisen. Die Sensivität dieser Methode ist zu gering, da nicht alle EHEC den enterohämolytischen Phänotyp zeigen, obwohl annähernd 100% die Gene für das EHEC-Hämolysin beherbergen. Weiters ist die Erkennung des Hämolysehofs bei der Kultivierung von Stuhl auf dem nicht selektiven Blutmedium schwierig. Durch die Beimengung von Vancomycin/Cefexim/Cefsulodin zum Blutagar, kann eine höhere Selektivität erreicht werden. Der Nachweis von EHEC mittels immunmagnetischer Separation (IMS) z.b. "System Dynabead" (Dynal, Norway) bietet neue alternative zu den herkömmlichen Methoden. Beim IMS werden magnetische Partikel mit Antikörpern gegen 0157:H7 beschichtet und nach Anlegen eines Magneten die Partikel mitsamt den anhaftenden Stämmen getrennt. BOLTON et al. (1996) beschreiben ein Nachweisverfahren mit immunomagnetischer Seperation und anschließender Kultivierung auf CT- SMAC-Agar. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, daß die immunomagnetische Seperation eine zuverlässige Methode darstellt, um E. coli O157:H7 in Fleischproben nachzuweisen. Die Inkubation der Anreicherung bei 42 C erwies sich als selektiver als bei 37 C, da dadurch nicht Sorbitolfermenter wie H. alvei im Probenmaterial gehemmt werden. H. alvei erwiesen sich auch bei unserer Studie (MANAFI & KREMSMAIER 1999) als problematische Mikroorganismen, da sie auf den einzelnen Selektivmedien häufig falsch positive Ergebnisse zeigten. Toxinnachweis Der Toxinnachweis läßt sich entweder auf dem Nachweis der Toxingene mittels Polymerase Ketten Reaktion (PCR) und Kolonienblot-Hybridisierung mit DNS-Sonden, oder der Toxinexpression mittels ELISA und Zellkultur (Verozell-Test) durchführen. In der EHEC-Diagnostik wird derzeit eine Kombination kultureller und molekularbiologischer Methoden mit anschließender Typisierung der Erreger empfohlen. Eine Bakteriumisolierung sollte in jedem Fall angestrebt werden. Bei einer Studie wurde das Probenmaterial nach Anreicherung auf Agarplatten verteilt und gewachsene Kolonien anschließend auf Nitrocellulosemembranen aufgebracht. Mittels O157 Antiserum wurden anschließend positive Kolonien bestätigt. Diese Immunoblot Methode wurde von DOYLE & SCHOENI (1987) entwickelt. Für den Routinegebrauch ist diese Methode jedoch ungeeignet, da sie sehr viel Zeit und Personal beansprucht. Ein weiterer Nachteil ist eine zu geringe Spezifität, da das verwendete polyklonale O157 Antiserum Kreuzreaktion mit Brucella abortus, Brucella melitensis, Yersinia enterocolitica Serogruppe O:9, Salmonella Serogruppe N und Pseudomonas maltophilia zeigte (CAROFF et al., 1984). Ursache für dieses Phänomen ist eine D-Mannose Komponente, welche sich in den Zellwandlipopolysacchariden befindet. TODD et al. (1988) beschreiben eine sehr ähnliche Methode. Im Gegensatz zu der Methode von DOYLE & SCHOENI (1987) erfolgte hierbei keine Anreicherung des Probenmaterials. Die Probe wurde mit Peptonwasser gemischt, homogenisiert und gefiltert um größere Lebensmittelrückstände zu entfernen. Anschließend erfolgte eine weitere Filtration durch eine hydrophobe Gittermembran. Mit dieser Methode wurden 95% der E. coli O157:H7 nachgewiesen. Ein Latex Agglutinationstest wurde verwendet um vermutliche O157 zu bestätigen. Der angewandte Latex Agglutinationstest zeigte jedoch auch bei anderen Sorbitol negativen Keimen Agglutination, wie bei E. hermanii und E. coli O117:H27. Toxinnachweis mittels ELISA-Verfahren: Der direkte Nachweis von Shiga-Toxinen im Stuhl, Lebensmittel oder bei einem isolierten Erreger mit Hilfe des ELISA (z.b. Premier EHEC, Meridian Diagnostics) stellt eine schnelle Methode dar. Agglutinationstests sind zwar sehr zuverläßige Testsysteme, es wird jedoch viel Zeit für deren Durchführung benötigt. Der Latextest stellt eine schnelle, einfache und ökonomische Nachweismethode dar, es wird jedoch in der Literatur von Fehlidentifikationen berichtet. Gelegentlich werden E. hermanii als E. coli O157:H7 identifiziert. WEERATNA & DOYLE (1991) beschreiben die Entwicklung eines speziellen ELISA-Tests (sandwich enzyme-linked immunosorbent assay) um Verotoxin 1 in Milch und faschierten Fleisch quantitativ nachzuweisen. Bei dieser Studie stellte man fest, daß faschiertes Fleisch ein besseres Medium für die Verotoxin 1-Produktion zu sein scheint als Milch. Eine Ursache stellt einerseits der ph-wert der Medien dar, Fleisch hat bei 37 C einen ph-wert von 8, während Milch einen ph-wert von 5,8 aufweist, andererseits wird die Milch vor dem ELISA Test zentrifugiert, um E. coli Zellen abzutrennen, wobei koagulierte Milch ebenfalls abgetrennt wird. VT1, welches mit koagulierter Milch in Verbindung steht wird mit abgetrennt und kann somit nicht nachgewiesen werden. Die Resultate dieser Studie ergaben, daß der entwickelte ELISA Test sehr schnell Ergebnisse bringt und er VT1 in Lebensmittel und Lebensmittelextrakten mit hoher Sensitivität nachweist.

4 Toxinnachweis mittels Verozellkultur: Im Verozelltest wird Shiga Toxin nachgewiesen. Shiga Toxine führen zu irreversiblen Zellschäden, indem sie in den Zellkulturen die Übersetzung der m-rna in die Aminosäuresequenz an den Ribosomen blockieren. Diese Schäden zeigen sich durch Abrundung und Schrumpfung der Zellen und infolge dessen durch Loslösen aus dem Zellverband. Sichtbar sind diese Veränderungen aber frühestens nach ein bis drei Tagen im Lichtmikroskop. Durch den benötigten Zeit- und Materialaufwand, den diese Untersuchung mit sich bringt, ist die Routinetauglichkeit begrenzt, obwohl Sensitivität und Spezifität sehr hoch liegen. GLISA (Gold labbeld immunosorbent assay; MERCK): Der GLISA-Test ist ein immunchromatographischer Schnelltest mit Gold beschichteten Antikörpern. Die Testeinheit besitzt eine runde Öffnung zum Probenauftrag, ein rechteckiges Testfeld und ein ovales Kontrollfeld. GLISANEGATIV GLISA POSITIV Schlussfolgerungen Die EHEC-Diagnostik ist sehr komplex und noch in Entwicklung. Es ist wichtig, dass bei der Auslegung von Resultaten stets die methodischen Einschränkungen und Schwachpunkte mitberücksichtigt werden (z.b. Einsatz von SMAC Agar). Der Nachweis der Toxingene durch die Anwendung molekularbiologischer Techniken wie PCR ist zur Zeit der sicherste diagnostische Ansatz. Der Einsatz von neuen Medien wie BCM Agar in Kombination mit den GLISA Test oder Premier EHEC sind einfach und relativ kostengünstig. Es darf nicht übersehen werden, daß ein beträchtlicher Teil der EHEC-Erkrankungen durch andere Serotypen als O157:H7 verursacht werden. Es bedeutet, daß man Methoden einsetzen muß um alle EHEC Serotypen zu erfassen. In diesem Sinne geeignet sind die Verotoxine als solche oder aber die DNS-Sequenzen, welche die Information für die Toxinbildung tragen. Eine gezielte flächendeckende Routinediagnostik im Rahmen der primär bakteriologischen Stuhluntersuchungen wäre wünschenswert. Vorbeugend durch das Einhalten von einfachen, aber wirkungsvollen hygienischen Grundregeln kann man das Risiko einer EHEC-Infektion und anderer Darminfektionen drastisch reduzieren. Es soll insbesondere bei den Säuglingen, Kleinkindern, alten und kranken Menschen vorsorglich auf Rohmilch, Rohmilchprodukte und nicht ausreichend durcherhitztes

5 Kleinkindern, alten und kranken Menschen vorsorglich auf Rohmilch, Rohmilchprodukte und nicht ausreichend durcherhitztes Fleisch verzichtet werden. Rohes Fleisch wegen der Gefahr der Bakterienübertragung nicht in Kontakt mit anderen Lebensmitteln bringen und das bei der Fleischzubereitung verwendete Küchengeschirr und die Arbeitsflächen sorgfältig reinigen, bevor sie für weitere Küchenarbeiten verwendet werden. Hände regelmäßig gründlich waschen, insbesondere nach jedem Toilettenbesuch, vor der Küchenarbeit, nach dem Hantieren mit rohem Fleisch und vor dem Essen. Kinder beim Umgang mit Tieren beaufsichtigen, um zu verhindern, daß die Kinder dabei Finger in den Mund nehmen oder gleichzeitig essen. Literatur BETTELHEIM K., A. (1998): Studies of E. coli cultured on Rainbow Agar O157 with particular reference to enterohaemorrhagic E. coli (EHEC). Microbiol. Immunol. 1998; 42, BOLTON F., CROZIER L., WILLIAMSON J. (1996): Isolation of E. coli O157 from raw meat products. Lett. in Appl. Microbiol. 23, CAROFF M., BUNDLE D. R., PERRY M. B. (1984): Structure of the O-chain of the phenol-phase soluble cellular lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica serotype O:9. Europ. J. Biochem. 139, DOYLE M. P., SCHOENI S. L. (1987): Isolation of E. coli O157:H7 from retail fresh meats and poultry. Appl. Environ. Microbiol. 53, TODD E. C. D., SZABO R. A., PETERKIN P., SHARPE A. N., PARRINGTON L., BUNDLE D. (1988): Rapid hydrophobic grid membrane filter-enzyme-labeled antibody procedure for identification and enumeration of Escherichia O157 in foods. Appl. Environ. Microbiol. 54, WEERATNA R., DOYLE P. (1991): Detection and Production of Verotoxin 1 of E. coli O157:H7 in Food. Appl. Environ. Microbiol. 57,