QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch

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1 QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch Verwendungszweck Der QUANTA Lite TM Intrinsic-Factor ELISA ist ein Enzymimmunassay (ELISA) für den halbquantitativen Nachweis von Intrinsic-Faktor-Antikörpern in Humanserum. In Verbindung mit klinischen Befunden und anderen Labortests kann der Nachweis von Intrinsic-Faktor-Antikörpern bei der Diagnose einer perniziösen Anämie helfen. Informationen zum Test Die Perniziöse Anämie (Biermer's Anämie) ist eine chronische Erkrankung und stellt das Endstadium von Typ A (autoimmuner) chronischer atrophischer Gastritis dar Typ A ist seiner Natur nach autoimmun und mit perniziöser Anämie assoziiert. Typ B (nicht-autoimmun) ist mit einer H. pylori-infektion assoziiert. 1,2,3 Im Verlauf einer chronischen atrophischen Gastritis vom Typ A werden Belegzellen, die den Intrinsic-Faktor und HCl produzieren, sowie zymogene Zellen, die Pepsinogen produzieren, zerstört, und die Produktion des Intrinsic-Faktors (IF) und von HCl wird verhindert. Der Intrinsic-Faktor ist von entscheidender Bedeutung für die Resorption von Vitamin B 12 aus dem Darm. Sein Fehlen führt zu Mangel an Vitamin B 12 und megaloblastärer Anämie. Die Diagnose einer perniziösen Anämie ist wichtig für die Behandlung der Anämie selbst und für die Prävention irreversibler neurologischer Schäden. 1,4 Für Patienten mit perniziöser Anämie wurden ein 3-fach erhöhtes Risiko für ein Magenkarzinom, ein 13-fach erhöhtes Risiko für ein Magenkarzinoid sowie ein erhöhtes Risiko für ein Plattenepithelkarzinom des Ösophagus berichtet. 5-7 Zirkulierende Antikörper gegen den Intrinsic-Faktor sind hoch spezifisch und können bei mehr als 50 % der Patienten mit perniziöser Anämie nachgewiesen werden. 1,3 Diese Antikörper treten in 2 Typen auf: Typ 1: Blockierende Antikörper, die die Bindung von Vitamin B 12 an das IF-Molekül verhindern. Typ 2: Antikörper, die die Bindung des Komplexes IF-Vitamin B 12 an den Rezeptor im Ileum behindern. 1,8 Der QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA weist anders als die auf Radioimmunassays basierenden Methoden sowohl die Antikörper vom Typ 1 als auch die vom Typ 2 nach. Zusammen mit weiteren klinischen und Labordaten kann ein positives Ergebnis für den intrinsic-faktor helfen, eine autoimmune perniziöse Anämie von anderen megaloblastären Anämien sowie eine atrophische Gastritis vom Typ A von anderen Formen einer unspezifischen histologischen Gastritis zu unterscheiden. 1,3,9 Testprinzip Gereinigtes rekombinantes humanes Intrinsic-Faktor-Antigen von voller Länge wird unter Bedingungen, die das Antigen in seinem nativen Zustand erhalten, an die Mulden einer Polystyrol-Mikrotiterplatte gebunden. Vorverdünnte Kontrollen und verdünnte Patientenseren werden in verschiedene Kavitäten pipettiert. Die vorhandenen Intrinsic Faktor Antikörper binden an das Antigen. Der Rest der Probe/Kontrolle wird durch Waschen entfernt. Enzymmarkiertes anti-humanes IgG wird in die Kavitäten pipettiert und bindet während einer zweiten Inkubation an den Patienten-Antikörper. Nachdem in einem weiteren Waschschritt das restliche Konjugat entfernt worden ist, wird ein Chromogen-Substrat zugegeben. Die Intensität der entstandenen Farbreaktion wird nach dem Abstoppen mit dem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen. Die quantitative Auswertung erfolgt durch einen Vergleich der Extinktionswerte der Patienten mit dem Wert eines Kalibrators. Inhalt der Testpackung 1. Mit rekombinantem humanen Intrinsic-Faktor beschichtete ELISA-Mikrotiterplatte aus Polystyrol (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter in Folienverpackung und Trockenmittel 2. ELISA Negative Kontrolle, 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum ohne humane Antikörper gegen Intrinsic Faktor antigen, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 3. Intrinsic Factor ELISA Low Positive (Kalibrator), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikörpern gegen Intrinsic Faktor antigen, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 4. Intrinsic Factor ELISA High Positive (positive Kontrolle), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikörpern gegen Intrinsic Faktor antigen, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 5. HRP Probenverdünner, 1 Flasche rosa gefärbt mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, Tween 20, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 50 ml 6. HRP Waschkonzentrat, 1 Flasche mit 40fachem Konzentrat rot gefärbt mit gepufferter Kochsalzlösung und Tween 20, 25 ml. Zur Verdünnung bitte das entsprechende Kapitel in der Anleitung beachten. 7. HRP IgG Konjugat, (Ziege), anti-humanes IgG, 1 Flasche blau gefärbt mit Puffer, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 10 ml 8. TMB Chromogen, 1 Flasche mit Stabilisatoren, 10 ml 9. HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure, 1 Flasche farblos, 10 ml Hinweise 1. VORSICHT: Probenverdünner, Kontrollen und Konjugat enthalten 0,02% Chloramphenicol. Es ist im US-Bundesstaat Kalifornien und allgemein bekannt, daß dieser Stoff Krebs verursachen kann. 2. Alle Reagenzien für die Herstellung dieses Tests wurden auf Antikörper gegen HIV, HBsAg und HCV getestet und für negativ befunden. Dennoch sollten alle humanen Kontrollen wie potentiell infektiöses Humanserum oder Blutproben behandelt werden NaN 3 wird als Stabilisator verwendet. NaN 3 ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen. Vorsichtig handhaben und Kontakt mit Augen und Haut vermeiden! Den 1

2 Kontakt mit Metall, basischen Stoffen oder anderen Komponenten, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Bei der Entsorgung von Reagenzien ist daher mit viel Leitungswasser nachzuspülen, um Ansammlungen im Abwassersystem zu verhindern. 4. Das HRP Konjugat enthält eine verdünnte Chemikalie, die bei Einnahme toxisch wirken kann. Daher den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 5. Das TMB Chromogen enthält ein Reizmittel, das bei Inhalation, Einnahme oder Absorbtion durch die Haut gesundheitliche Schäden verursachen kann. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 6. Die HRP Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Den Kontakt mit Basen, Metallen und anderen Stoffen, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Schwefelsäure ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen hervorrufen. Den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 7. Die vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung während der Arbeit mit Reagenzien tragen. 8. Verschüttete Reagenzien sofort beseitigen. Bei der Entsorgung von Abfällen alle Umweltvorschriften beachten. Vorsichtsmaßnahmen 1. Dieser Test ist für In-Vitro Diagnostik. 2. Die Verwendung anderer als im Testkit vorhandenen Komponenten kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen. 3. Unvollständiges Waschen und ungenügendes Entfernen der Flüssigkeiten aus den ELISA Kavitäten führt zu einer schlechten Präzision und zu hohen Hintergrund-Extinktionen. 4. Die Adaptation dieses Testsystems auf automatische Probenverarbeitung und andere Instrumentierung, ganz oder teilweise, kann unterschiedliche Ergebnisse zur manuellen Durchführung ergeben. Es liegt in der Verantwortung eines jeden Labors, die automatische Bearbeitung so zu überprüfen, daß Testergebnisse innerhalb akzeptabler Bereiche erzielt werden. 5. Eine Reihe von Faktoren beeinflusst das Testergebnis. Hierzu zählen die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Pipettierung, der Typ des verwendeten Photometers, die Temperatur der Reagenzien, die Umgebungs-Temperatur, die Gründlichkeit des Waschens und der Entfernung der Flüssigkeiten aus den Vertiefungen der ELISA-Streifen, und die Einhaltung der Inkubationszeiten. Es ist deshalb sehr wichtig, für gleichbleibende Bedingungen zu sorgen. 6. Die strikte Einhaltung der Testprozedur wird empfohlen. Jede Änderung im Protokoll erfolgt auf Risiko des Anwenders. 7. Das unvollständige Verschließen der Mikrotiterkavitäten und des Trockenmittels führt zu Antigenabbau und schlechter Präzision. 8. Eine unakzeptabel niedrige Absorption kann beobachtet werden, wenn eine Flasche HRP Konjugat bei zwei- oder mehrfachem Gebrauch über einen längeren Zeitraum benutzt wird. Daher ist es wichtig, die Hinweise zum Umgang mit dem HRP Konjugat genau zu beachten. 9. Chemische Kontamination des HRP Konjugates kann durch unzureichendes Reinigen oder Spülen der Ausrüstung oder der Instrumente verursacht werden. Rückstände gebräuchlicher Laborchemikalien wie z.b. Formalin, Bleichmittel, Ethanol oder Spülmittel führen zum Abbau des HRP Konjugates im Verlauf der Zeit. Das gründliche Spülen der gesamten Ausrüstung und Instrumentierung nach Verwendung chemischer Reinigungsmittel ist daher unbedingt erforderlich. Lagerung 1. Lagerung aller Kit-Reagenzien bei 2-8 C. Nicht einfrieren. Die Reagenzien sind stabil bis zum Ende des Haltbarkeitsdatums bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung. 2. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen. 3. Der verdünnte Waschpuffer ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Proben Die Testdurchführung sollte mit Serumproben erfolgen. Werden Azide oder andere Stabilisatoren zu den Serumproben gegeben, können die Ergebnisse nachteilig beeinflusst werden. Mikrobakteriell kontaminierte, hämolytische, lipämische oder durch Hitzeeinwirkung inaktivierte Proben sollten nicht verwendet werden. Nach der Blutentnahme ist das Serum vom Blut zu trennen. Das CLSI (NCCLS) Dokument H18-A3 empfiehlt die folgenden Lagerungsbedingungen für Patientenproben: 1) Proben bei Raumtemperatur nicht länger als 8 Stunden lagern. 2) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 8 Stunden erfolgen, die Proben bei 2-8 C kühl lagern. 3) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 48 Stunden erfolgen ist die Probe bei -20 C oder niedriger einzufrieren. Eingefrorene Proben müssen nach dem Auftauen und vor der Testung gut geschüttelt werden. 11 Testdurchführung In der Testpackung vorhandenes Material 1 Intrinsic Factor ELISA Mikrotiterplatte (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter 1 1,2 ml vorverdünnte ELISA Negative Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle 1 50 ml HRP Probenverdünner 1 25 ml HRP Waschkonzentrat, 40faches Konzentrat 1 10 ml HRP IgG Konjugat (von der Ziege) 1 10 ml TMB Chromogen 1 10 ml HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure 2

3 Zusätzliches benötigtes Material Pipetten für 5, 100, und 500 µl Einmal-Pipettenspitzen Eppendorf-Reaktionsgefäße für die Serumverdünnung, 4 ml Volumen Distilliertes oder deionisiertes Wasser 1 L Gefäß für verdünntes HRP Waschkonzentrat Reader für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter (und 620 nm für eine bichromatische Messung) Methode Testvorbereitung 1. Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur bringen (20-26 o C) und gründlich mischen. 2. Den gesamten Inhalt (25 ml) des Waschkonzentrats mit 975 ml Aqua dest. mischen (1:40 Verdünnung). Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Soll nicht die gesamte Mikrotiterplatte auf einmal verwendet werden, so können für einen Ansatz von 16 Kavitäten 2 ml Konzentrat mit 78 ml Aqua dest. gemischt werden. 3. Serumproben 1:101 verdünnen, indem 5 µl Serum mit 500 µl gebrauchsfertigem Probenverdünner gemischt werden. Verdünnte Proben sollen innerhalb von 8 Stunden getestet werden. Die Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle, die Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle nicht verdünnen. 4. Für die Feststellung der An- oder Abwesenheit von Antikörpern gegen den Intrinsic-Faktor mit beliebigen Einheiten sind zwei Mulden für jede der drei Kontrollen sowie eine oder zwei Mulden für jede Patientenprobe erforderlich. (Es wird empfohlen, alle Proben in Doppelbestimmung anzusetzen, bis die erforderliche Präzision und Reproduzierbarkeit erreicht sind). Testdurchführung 1. ALLE REAGENZIEN UND PATIENTENPROBEN AUF RAUMTEMPERATUR (20-26 C) BRINGEN. Die entsprechende Anzahl Mikrotiterkavitäten abbrechen. Die Kavitäten im Rahmen befestigen. Die unbenutzten Kavitäten wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen, um Verdunstung zu minimieren. 2. Je 100 µl der gebrauchsfertigen Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle, der Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle, der ELISA Negative Kontrolle und der verdünnten Patientenproben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Die Inkubationszeit beginnt nach Zugabe der letzten Probe. 3. Waschen: Den Inhalt aller Kavitäten absaugen. Die Kavitäten vollständig ( µl) mit verdünntem HRP Waschpuffer füllen und dann gründlich absaugen. Diesen Waschschritt noch zweimal wiederholen (Insgesamt: drei Waschschritte). Anschließend die Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen, um restliche Waschflüssigkeit zu entfernen. Die Waschschritte sind in der selben Reihenfolge wie die Pipettierschritte durchzuführen μl des HRP IgG Konjugates in jede Kavität geben. Sterile Pipetten verwenden! Nur das benötigte Volumen an Konjugat aus der Flasche entnehmen. UNBENUTZTES KONJUGAT NICHT IN DIE FLASCHE ZURÜCKPIPETTIEREN. KONTAMINATIONSGEFAHR!! Abgedeckte Streifen bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren, wie in 2. beschrieben. 5. Waschen: Schritt Nr. 3 wiederholen µl TMB Chromogen in jede Kavität geben. 30 Minuten im Dunkeln bei Raum-temperatur inkubieren µl HRP Stopplösung in jede Kavität pipettieren. Bei der Hinzugabe der Stopplösung dieselbe Reihenfolge und Zeitplan wie bei der Hinzugabe des TMB Chromogens einhalten. Die Mikrotiterplatte vorsichtig schütteln. 8. Die optische Dichte (OD) jeder Kavität bei 450 nm innerhalb einer Stunde nach Abstoppen der Reaktion ablesen. Es wird eine bichromatische Messung mit 620 nm als Referenzwellenlänge empfohlen. Qualitätskontrolle 1. Die Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle, die Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden, um sicherzustellen, daß alle Reagenzien und der Testansatz insgesamt ordnungsgemäß funktionieren. 2. Da die Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle, die Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle vorverdünnt sind, entfällt der Verdünnungsschritt der Patientenproben für die Kontrollen. 3. Zusätzliche Kontrollen zur Qualitätssicherung können gemäß den Richtlinien nationaler oder internationaler Regulierungs- oder Akkreditierungsbehörden eingesetzt werden. Geeignete Kontrollen können aus Humanserum gewonnen und bei <-20 C gelagert werden. 4. Um sicher zu sein, daß alle Patientenwerte korrekt sind, müssen die nachfolgenden Kriterien erfüllt werden (Wurden ein oder mehrere Kriterien nicht erfüllt, so ist das Ergebnis als ungültig zu betrachten und der Testansatz ist zu wiederholen). a. Die Absorption der vorverdünnten Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle muß größer sein als die Absorption der vorverdünnten Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle. Die Absorption der Low Positive Kontrolle wiederum muß größer sein als die der vorverdünnten ELISA Negativkontrolle. b. Die Absorption der vorverdünnten Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle muß größer 3

4 als 1,0 sein, die Absorption der vorverdünnten Negative Kontrolle darf nicht größer als 0,2 sein. c. Die Absorption der Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle muß mehr als doppelt so hoch sein wie die der ELISA Negative Kontrolle sein oder über 0,25. d. Die ELISA Negative Kontrolle und die Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle dienen der Sicherstellung der ordnungsgemäßen Funktionsweise des Testansatzes. Die Intrinsic Factor ELISA High Positive Kontrolle stellt die Präzision am Cut-off des Tests nicht sicher. e. Der Anwender sollte unter anderem das CLSI (NCCLS) Dokument Nr. C24-A2 für zusätzliche Hinweise zur zeitgemäßen Qualitätskontrolle beachten. 12 Berechnung der Ergebnisse Zunächst sind die Mittelwerte der OD für die Doppelbestimmungen zu berechnen. Alle weiteren Berechnungen werden dann mit den entsprechenden Mittelwerten durchgeführt. Die Reaktivität jeder Patientenprobe wird bestimmt durch die Division des Mittelwertes der Proben-OD durch den Mittelwert der Low Positive Kontrolle und der Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem chargenspezifischen Wert der Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle. Die chargenspezifischen Werte sind auf dem Fläschchenetikett aufgedruckt. OD der Probe Probenwert = x Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrollwert (Units) Intrinsic Factor ELISA Low Positive Kontrolle OD Wert (Units) Die Reaktivität verhält sich zur Konzentration der vorhandenen Antikörper nicht linear. Zunahme und Abnahme der Antikörperkonzentrationen von Patienten werden durch einen entsprechenden Anstieg oder Abfall der Reaktivität angezeigt, diese Änderungen sind jedoch nicht proportional (d.h. eine Verdoppelung der Antikörperkonzentration führt nicht zu einer Verdoppelung der Reaktivität). Wird eine genauere Quantifizierung der Patientenantikörper gewünscht, sind serielle Verdünnungen der Probe durchzuführen und der Titer der zuletzt als positiv gemessen wurde, sollte als Patienten-Antikörpertiter bewertet werden. Interpretation der Ergebnisse Dieser ELISA-Test ist sehr sensitiv und in der Lage, sogar kleine Unterschiede in Patientenpopulationen zu messen. Die folgenden Werte dienen als Beispiel für die Interpretation der Testergebnisse. Es wird empfohlen, daß sich jedes Labor seine eigenen Normalwerte, basierend auf eigener Technik, Kontrollen, Ausrüstung und Patientenpopulation erarbeitet. Proben werden gemäß der folgenden Tabelle als negativ, fragwürdig oder positiv interpretier: Units Negativ 20 Grenzwertig 20,1 24,9 Positiv >25 1. Ein positives Ergebnis zeigt das Vorhandensein von Antikörpern gegen den Intrinsic-Faktor an und legt die Möglichkeit einer perniziösen Anämie nahe. 2. Ein negatives Ergebnis zeigt die Abwesenheit von Antikörpern gegen den Intrinsic-Faktor bzw. eine Konzentration unterhalb des negativen Grenzwerts des Assays an. 3. Ein negatives Ergebnis für den Intrinsic-Faktor schließt die Diagnose einer perniziösen Anämie nicht aus, da nur 60 % der Patienten mit perniziöser Anämie diesen Antikörper auweisen Eine Probe mit fragwürdiger Konzentration des Intrinsic-Faktor-Antikörpers kann hinsichtlich des Antikörperstatus nicht beurteilt werden. Wenn die Ergebnisse auch bei wiederholten Tests fragwürdig bleiben, sind sie als fragwürdig zu protokollieren, und/oder es sollte zu einem späteren Zeitpunkt eine weitere Probe untersucht werden. 5. Das Vorliegen von Antikörpern gegen Belegzellen kann mit dem Vorliegen von Intrinsic-Faktor- Antikörpern und dem entsprechenden Messwert korrelieren oder auch nicht, und kann zusätzlich oder in Verbindung mit der Messung der Intrinsic-Faktor-Antikörper zur Überprüfung von Patienten herangezogen werden, bei denen perniziöse Anämie vermutet wird Wir schlagen vor, die Laborergebnisse mit folgendem Hinweis zu versehen: Die folgenden Ergebnisse wurden mit dem INOVA QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA erzielt. Intrinsic Factor Werte, die mit Testsystemen anderer Hersteller ermittelt wurden, können nicht untereinander ausgetauscht werden. Die Höhe des gefundenen IgG-Titers kann nicht mit einem Endpunkttiter in Korrelation gebracht werden. Grenzen des Verfahrens 1. Immunkomplexe oder andere Immunoglobulin-Aggregate im Patientenserum können nichtspezifische Bindungen und falsch-positive Ergebnisse hervorrufen. 2. Ergebnisse dieses Testes müssen im Zusammenhang mit klinischen Ergebnissen und anderen serologischen Tests verwendet werden. Patienten mit perniziöser Anämie können Antikörper gegen den Intrinsic-Faktor und/oder Belegzellen-Antikörper aufweisen. Während das Vorhandensein beider Antikörper die Diagnose von perniziöser Anämie bestätigt, können Patienten mit perniziöser Anämie auch nur einen der beiden Antikörper aufweisen. 1,9 3. Die Leistungscharakteristika für andere Untersuchungsmaterialien als Serum wurden nicht bestimmt. 4

5 Erwartungswerte Normalbereich Mit dem QUANTA Lite TM Intrinsic-Factor ELISA-Kit wurde ein Panel von 476 Proben getestet, die von asymptomatischen, gesunden Personen stammten. Das Alter lag zwischen 14 und 78 Jahren (Median 43). Von den 276 Proben, zu denen Alters- und Geschlechtsangaben vorlagen, stammten 150 von Männern und 126 von Frauen. Von den 476 Proben war eine stark positiv bei 103,2 Einheiten, eine grenzwertig positiv bei 25,5 Einheiten und eine grenzwertig fragwürdig bei 20,2 Einheiten. Die Spezifität des Assays lag bei 99,4% (473/476). Die Häufigkeit von perniziöser Anämie wurde auf 0,1-0,2 % geschätzt. Bei Ausschluss des einen stark positiven Ausreißers betrug der Mittel- bzw. Medianwert für die gesunde Kontrollgruppe 5,7 bzw. 5,0 Einheiten. Spezifische Leistungscharakteristika Zur Ermittlung der Empfindlichkeit und Spezifität des Tests wurden mit dem QUANTA Lite TM Intrinsic-Factor ELISA insgesamt 177 Proben von Patienten, bei denen perniziöse Anämie vermutet, angenommen oder bestätigt wurde, wie unten unter Klinische Studien beschrieben, sowie 499 Proben von Gesunden (476) und krankheitsspezifischen Kontrollpersonen (23) getestet. Der Durchschnitts- bzw. Medianwert der nicht von perniziöser Anämie betroffenen Gruppe lag bei 5,9 bzw. 4,9 Einheiten. Klinischen Studien Die Proben wurden in 3 Kategorien unterteilt, um den Zuverlässigkeitsgrad einer Diagnose von perniziöser Anämie zu beschreiben: 1) Vermutete perniziöse Anämie : Positiv auf Antikörper gegen Belegzellen und/oder geringer Vitamin B 12 -Status, aber diskrepante Ergebnisse für Intrinsic-Faktor-Antikörper. 2) Angenommene perniziöse Anämie : Laborergebnisse konsistent mit perniziöser Anämie, insbesondere positiv für Belegzellen-Antikörper, geringer Vitamin B 12 -Status und erhöhtes mittleres Korpuskularvolumen (typisch für perniziöse Anämie). 3) Bestätigte perniziöse Anämie : Laborergebnisse konsistent mit perniziöser Anämie, insbesondere positiv für Belegzellen-Antikörper, geringer Vitamin B 12 -Status und erhöhtes mittleres Korpuskularvolumen (typisch für perniziöse Anämie) sowie hämatologische Bestätigung einer megaloblastären Anämie. Die Empfindlichkeit wurde folgendermaßen berechnet: 1) Zählen der Proben mit bestätigter oder angenommener perniziöser Anämie als positiv für die Erkrankung und der Proben mit vermuteter perniziöser Anämie als negativ für die Erkrankung. 2) Zählen der Proben mit bestätigter, angenommener und vermuteter perniziöser Anämie als positiv für die Erkrankung. Keine der Proben mit vermuteter Anämie lieferte ein positives Ergebnis für Intrinsic-Faktor-Antikörper. Tabelle 1: Sensitivität und Spezifität Von QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA n= pos gw neg Bestätigte (n=43) und angenommene (n=55) perniziöse Anämie* Alle Proben für perniziöse Anämie** Vermutete (n=79), angenommene (n=55) und bestätigte perniziöse Anämie (n=43) Nicht-perniziöse Anämie (Gesunde und krankheitsspezifische Kontrollen) * Proben mit vermuteter perniziöser Anämie als negativ für die Erkrankung gezählt ** Proben mit vermuteter perniziöser Anämie als positiv für die Erkrankung gezählt Sensitivität 1) Gruppen mit angenommener und bestätigter perniziöser Anämie als positiv für die Erkrankung eingeschlossen: 93,9 % (92/98); 95 % Konfidenzintervall (KI): 87,1 %- 97,7 % Hinweis: Fragwürdige Ergebnisse wurden in der Analyse als negativ betrachtet 2) Gruppen mit vermuteter, angenommener und bestätigter perniziöser Anämie als positiv für die Erkrankung eingeschlossen: 52,0% (92/177); 95% Konfidenzintervall (KI): 44,4%- 59,5% Hinweis: Fragwürdige Ergebnisse wurden in der Analyse als negativ betrachtet Spezifität 99,6% (497/499); 95% Konfidenzintervall (KI): 98,8-100% Hinweis: Fragwürdige Ergebnisse wurden in der Analyse als negativ betrachtet Wirkungsgrad 1) Gruppen mit angenommener und bestätigter perniziöser Anämie als positiv für die Erkrankung eingeschlossen: 98,7% 2) Gruppen mit vermuteter, angenommener oder bestätigter perniziöser Anämie als positiv für die Erkrankung eingeschlossen: 87,1% Vergleich mit gleichartigen Produkten Der QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA wurde mit einem von der FDA anerkannten ELISA-Test für Belegzellen-Antikörper (GPA) und mit einem RIA-Test für Intrinsic-Factor (IF)-Antikörper verglichen. Die negative prozentuale Übereinstimmung lag für alle drei Assays zwischen 97,5 und 100 %. Die positive prozentuale Übereinstimmung zwischen dem QUANTA Lite TM Intrinsic-Factor ELISA und dem an Standort 1 durchgeführten IF-RIA betrug 93,3 %, jedoch 30,3 % an Standort 2. Alle positiven RIA-Ergebnisse an Standort 1 stammten von Patienten mit hämatologischem Nachweis perniziöser Anämie. Für die Proben von Standort 2 waren keine klinischen Informationen verfügbar. 5

6 Tabelle 2: Übereinstimmung zwischen QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA und gleichartigen Assays Prädikativer GPA ELISA Prädikativer Intrinsic Factor RIA Stelle 1 Prädikativer Intrinsic Factor RIA Stelle 2 Positiv % QUANTA Lite TM Intrinsic Factor Antikörper ELISA Übereinstimmung Negativ % Übereinstimmung Übereinstimmung insgesamt 29,7% (22/74) 93,2% (41/44) 30,3% (24/79) 97,5% (193/198) 100% (25/25) 100% (26/26) 49,1% (220/278) 95,6% (66/69) 63,3% (50/79) Kreuzreaktivität Seren von 23 Patienten mit Autoimmun- oder von Infektionskrankheiten herrührenden Antikörpern, insbesondere gegen H. pylori, mitochondriale M2, Zytomegalie-Virus, Herpes simplex-virus, ASCA, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, dsdna, Gewebe-Transglutaminase und glomeruläre Basalmembran wurden auf Kreuzreaktivität mit dem QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA getestet. Keine der Proben erwies sich mit dem QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA als positiv. Präzision und Reproduzierbarkeit Die Intra-Assay-Leistung wurde ermittelt, indem 7 Proben mit der stark positiven Kit-Kontrolle (HPC) jeweils 5 mal getestet wurden. Tabelle 3: Intra-assay Leistungsdaten von QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Probe. A (HPC) Probe. B Probe. C Probe. D Probe. E Probe. F Probe. G Probe. H Mittelwert Units 108,1 45,4 115,2 108,7 21,3 17,1 10,6 13,4 SD 2,1 0,8 2,5 3,4 1,7 0,8 0,4 0,7 CV % 1,9 1,8 2,2 3,2 8,0 5,0 4,0 5,3 Die Inter-Assay-Leistung wurde durch Testen im Doppelansatz aus 5 Proben und der stark positiven Kit- Kontrolle (HPC) und negativen Kontrolle (NC) zweimal täglich (einmal morgens und einmal nachmittags) über 3 Tage bewertet. Tabelle 4: Interassay Leistungsdaten des QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. HPC NC Probe. 1 Probe. 2 Probe. 3 Probe. 4 Probe. 5 Mittelwert Units 109,1 1,1 107,9 47,4 13,9 108,0 29,2 SD 6,0 0,2 4,8 1,7 0,7 5,4 2,4 CV % 5,5 14,4 4,5 3,6 5,0 5,0 8,2 6

7 Referenzen 1. Toh, B. H. & Alderuccio, F. Pernicious anaemia. Autoimmunity 37, (2004). 2. Gleeson, P. A. & Toh, B. H. Molecular targets in pernicious anaemia. Immunol Today 12, (1991). 3. Toh, B. H., van Driel, I. R. & Gleeson, P. A. Pernicious anemia. N Engl J Med 337, 1448 (1997). 4. Tefferi, A. Anemia in adults: a contemporary approach to diagnosis. Mayo Clin Proc 78, (2003). 5. Ye, W. & Nyren, O. Risk of cancers of the oesophagus and stomach by histology or subsite in patients hospitalised for pernicious anaemia. Gut 52, (2003). 6. Hsing, A. W. et al. Pernicious anemia and subsequent cancer. A population-based cohort study. Cancer 71, (1993). 7. Mellemkjaer, L. et al. Pernicious anaemia and cancer risk in Denmark. Br J Cancer 73, (1996). 8. Waters, H. M., Smith, C., Howarth, J. E., Dawson, D. W. & Delamore, I. W. New enzyme immunoassay for detecting total, type I, and type II intrinsic factor antibodies. J Clin Pathol 42, (1989). 9. ASCIA. (Australian Society of Clinical Immunology and Allergy in conjunction with the Royal Australian College of Pathologists); November, Consensus Guidelines on Anti-Intrinsic Factor Antibody Testing. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Fourth Edition), CDC/NIH, (HHS Pub#(CDC) ) CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38) CLSI (NCCLS). Feb Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5) Hersteller: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Autorisierter Repräsentant: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service /JAN Revision DEU0 7