Nachweis von Phosphorylierung der Reparaturproteine Nbs1 und Pml nach strahleninduzierten

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1 Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau Nachweis von Phosphorylierung der Reparaturproteine Nbs1 und Pml nach strahleninduzierten DNA-Schäden Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Nina Natalie Bermeiser aus Lauf a.d. Pegnitz

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. J. Schüttler Prof. Dr. R. Fietkau Prof. Dr. G. Grabenbauer Tag der mündlichen Prüfung:

3 1 1 ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlussfolgerungen SUMMARY Background and aims Methods Results and observation Conclusion EINLEITUNG Nicht-Homologes End Joining (NHEJ) Homologe Rekombination (HR) Nbs Pml nuclear bodies MATERIAL UND METHODEN Zellvorbereitung Proteinisolierung D-Quant-Kit... 17

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5 3 10 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ANHANG DANKSAGUNG LEBENSLAUF... 84

6 4 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Ionisierende Strahlung wird in der Medizin in den Bereichen der Diagnostik, der Forschung und der Strahlentherapie genutzt. Um nach Bestrahlung und potentiellem DNA-Schaden das Überleben einer Zelle zu sichern oder bei Bedarf in den gezielten Zelltod (Apoptose) zu gehen, ist die posttranslationale Modifikation eine wichtige Option für die Zelle. Posttranslationale Modifikation bedeutet, dass Proteine nach ihrer Entstehung, zum Beispiel durch Kinasen verändert werden können. So stellen Phosphorylierungen und Acetylierungen einen Teil dieser posttranslationalen Modifikation dar. Ziel dieser Arbeit war es Phosphorylierungen in Abhängigkeit der Bestrahlungsdosis und der Reparaturzeit zu betrachten. 1.2 Methoden Es wurde die normale menschliche Zelllinie Sbl1 und eine NBS -/- - Zelllinie (P122) untersucht. Die lymphoblastoiden Zellen wurden sowohl unbestrahlt als auch mit 5Gy bestrahlt und nach einer Reparaturzeit von 1h, 3h, 8h, 24h, 48h betrachtet. Anfangs wurden die gesuchten Proteine Pml und Nbs1 mittels eindimensionaler Gelektrophorese und anschließender Silberfärbung, bzw. Western Blot detektiert. Danach wurde das Kernprotein mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennt und im Western Blot Pml und Nbs dargestellt. Anschließend wurden die Ergebnisse mit einem Bildanalyseprogramm ausgewertet. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Bei der normalen Zelllinie konnte bei unbestrahltem Pml im Durchschnitt neun negative Ladungen gefunden werden. Die durchschnittlichen Ladungsmaxima mit 14 Ladungen besitzt Pml drei und acht Stunden nach Bestrahlung mit 5Gy. Die durchschnittliche

7 5 Anzahl der Ladungen beginnt nach 24 Stunden zu sinken. Nach 48 Stunden ist ein weiteres Absinken zu beobachten. Bei der NBS -/- - Zelllinie konnte ebenfalls eine Steigerung von zehn Ladungen unbestrahlt auf 16 Ladungen nach Bestrahlung beobachtet werden. Jedoch ist dieses Ladungsmaximum erst nach 24 Stunden Reparaturzeit zu verzeichnen. Nach 48 Stunden kommt es zu einem Absinken der durchschnittlichen Ladungsanzahl. Das Nbs1-Protein der gesunden Zelllinie besitzt unbestrahlt im Durchschnitt zwei Ladungen. Nach Bestrahlung mit 5Gy kommt es zu einem Anstieg auf bis zu sechs Ladungen. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen In der Arbeit konnten Aussagen über die Veränderung der posttranslationalen Modifikationen im Sinne von Phosphorylierungen getroffen werden, welche die Zahl und die Steigerung der Veränderungen beschreiben. Es konnte festgestellt werden, dass durch eine Bestrahlung mit 5Gy eine Hochregulation der Vorgänge in der Zelle erfolgt, diese ist von der Reparaturzeit abhängig. In den NBS -/- - Zellen findet diese Hochregulation jedoch später statt, als in gesunden Zelllinien.

8 6 2 Summary 2.1 Background and aims In medicine ionizing irradiation is used in the areas diagnostic, research and radiotherapy. Posttranslational modification is an important option for the cell to protect its survival after ionizing irradiation and potential DNA damage or, if necessary, to choose the apoptosis. Posttranslational modification means that after their syntethis, proteins are changed for example by kinases. Phosphorylation and acetylation are part of this posttranslational modification. An aim of this work was to analyse phosphorylation against radiation dose and repair time. 2.2 Methods A normal human cell line Sbl2 and a NBS -/- -cell line were examined. Non-irradiated lymphoblastoide cells were observed, as well as treated lymphoblastoide cells, whereas the latter were irradiated with 5Gy and left to repair for 1h, 3h, 8h, 24h and 48h. In the beginning Pml and Nbs were detected by one-dimensional gel electrophoresis and following silver stain or Western Blot respectively. Then the proteins of the nuclei were analyzed with two-dimensional gel electrophoresis and afterwards Pml and Nbs1 were shown in Western Blots. The results were evaluated with an image analysis program. 2.3 Results and observation In normal cell line an average of nine negative charges could be found for unirradiated Pml. Pml has its maximal number of negative charges three and eight hours after irradiation with 5Gy. This maximum is 14 negative charges. The average number of negative charges begins to fall after 24 hours. After 48 hours a further descent could be registered. In the NBS -/- -cell line an increase of ten negative charges unirradiated to 16 negative charges after treatment could be observed. But this maximum of charges can be registered not until 24 hours reparation

9 7 time. After 48 hours there is a descent of the average number of charges. The unirradiated Nbs1-protein of the healthy cell line has got two negative charges. After treatment with 5Gy there is an increase up to six negative charges. 2.4 Conclusion In this work changes in posttranslational modifications through phosphorylation could be shown. Moreover the strength of increase of charges could be described. It could be detected that an irradiation with 5Gy triggers an increase of procedures in a cell, depending on reparation time. In the NBS -/- -cell line this increase occurs later than in normal cell lines.

10 8 3 Einleitung Ionisierende Strahlung wird in der Medizin vielfach eingesetzt. Diagnostik, Forschung und Strahlentherapie stellen die drei Haupteinsatzgebiete dar. Die Strahlentherapie ist Teil eines multimodalen Therapiekonzeptes, um die Remission eines Tumors zu erreichen. Wichtig ist hier vor allem den zytotoxischen Effekt auf den Tumor zu erhöhen, aber gleichzeitig das umliegende gesunde Gewebe so gut wie möglich vor Nebenwirkungen zu bewahren. Es ist daher von herausragender Bedeutung die Auswirkung von ionisierender Strahlung sowohl auf die gesunde, als auch auf die mutierte Zelle, beziehungsweise die Reaktion der Zelle auf Strahlung, zu erforschen. Nur so kann in Zukunft der Strahlenschutz und auch die Nutzung der ionisierenden Strahlung als Therapieform verbessert werden. Direkte Strahlenwirkung und indirekte, in Form von freien Radikalen, schädigen die DNA und führen zu Basenmodifikationen, Basenverlusten, Einzelstrangbrüchen und Doppelstrangbrüchen (DSB). Die Zelle hat verschiedene Möglichkeiten auf ionisierende Strahlung zu reagieren: zum einen den programmierten Zelltod, die Apoptose, und zum anderen verschiedene Reparatursysteme, um die Schäden an der DNA zu beheben und die Apoptose zu vermeiden. Der momentane Stand der Wissenschaft kennt zwei verschiedene Reparatursysteme für Doppelstrangbrüche in Eukarionten: das Nicht- Homologe End Joining (NHEJ) und die Homologe Rekombination (HR). Diese beiden Systeme werden im Folgenden erläutert.

11 9 3.1 Nicht-Homologes End Joining (NHEJ) Während dem NHEJ werden die beiden Enden eines DNA-DSB durch Ligasen verbunden, ohne oder nach einer geringfügigen nukleolytischen Bearbeitung der Enden. Das NHEJ ist deshalb potentiell fehlerbehaftet und kann zu Deletionen und Mutationen führen (Lisby et al. 2004). In humanen Zellen sind bei dem NHEJ folgende Proteine beteiligt: ein Heterodimer aus KU70/KU80, die DNA- Proteinkinase (PK), die ARTEMIS Nuklease und der LigIV/XrccIV Ligasekomplex. Die DNA-PK besteht aus drei Untereinheiten: einer katalytischen Untereinheit (DNA-PKcs), welche mit ARTEMIS einen Komplex bildet, der für die nukleolytische Bearbeitung der Enden eine Rolle spielt und zwei DNA-bindende Untereinheiten KU70 und KU80, die ein stabiles Heterodimer (KU70/KU80) bilden, welches die DNA vor Degradation schützt. Die DNA-LigaseIV ist die DSB-Reparatur-Ligase und bildet mit Xrcc4, welches Stabilität und Aktivität der Ligase beeinflusst, einen Komplex (LigIV/XrccIV) (Koike 2002; Lee et al. 2002; Lees-Miller et al. 2003; Lieber et al. 2003; Ma et al. 2002; Martin et al. 2002; Timson et al. 2000). Das derzeitige Modell des NHEJ wird folgendermaßen beschrieben: im ersten Schritt binden KU70 und KU80 an den Enden der DNA, um sie für die Ligation vorzubereiten und sie vor Zerstörung zu schützten. Außerdem rekrutieren sie die DNA-PKcs zum DSB und aktivieren ihre Kinase Funktion. Autophosphorylierung der DNA-PK bewirkt eine Konformationsänderung, welche Faktoren für die Modifikation der DNA-Enden an die DNA heranlässt. Nun kommt es mit Hilfe von ARTEMIS zum End Processing, bei dem einzelne Nukleotide herausgeschnitten werden können. Ein anderer Kandidat, der am End Processing beteiligt ist, ist der Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) Komplex, denn er besitzt eine Exonuklease-, Endonuklease- und Helikaseefunktion. (Paull et al. 1999; Trujillo et al. 1998) Anschließend folgt die Ligation der DNA mit Hilfe des LigIV/XrccIV Komplex. Am Ende dissoziiert die autophosphorylierte DNA-PK von der DNA und von KU70/80 (Meek et al. 2004).

12 Homologe Rekombination (HR) Im Gegensatz zum NHEJ, das die DNA-DSB einfach miteinander verbindet und deshalb fehlerbehaftet ist, geht das beschädigte DNA Stück bei der HR eine Synapse mit einem unbeschädigtem DNA Molekül ein, welches eine homologe Sequenz (Schwesterchromatid) besitzt, und erhält von diesem die ihm verloren gegangene genetische Information. Dadurch kommt es zu einer fehlerfreien Reparatur. Die HR spielt eine bedeutendere Rolle während der späten S- und G2-Phase des Zellzyklus, da hier die Schwesterchromatiden als Schablone für die Reparatur verfügbar sind, das NHEJ hingegen in der G1/G0- und in der frühen S-Phase (D'Amours et al. 2002; Fukushima et al. 2001; Lee et al. 1997; Rothkamm et al. 2003; Takata et al. 1998). Außerdem reparieren Wirbeltiere DSBs von Zellen, die Meiose ausführen, ausschließlich mit der HR, um die genetische Stabilität zu sichern (Moens et al. 2002; Plug et al. 1998). Auch in einfachen Eukaryonten, wie den Hefen, ist die HR der dominante Weg, wohingegen bei Säugern das NHEJ dominiert (Cromie et al. 2001; Haber 2000). Der erste Schritt der Reparatur ist das Erkennen des DNA Schadens. Der MRN-Komplex scheint, indem er direkt an den DNA Enden bindet, der früheste Sensor von DNA-DSBs zu sein (Carson et al. 2003). Als zweiter Schritt erfolgt eine großzügige 5 Resektion der DNA Enden von einer unbekannten Nuklease, möglicherweise unter der Beteiligung des MRN-Komplex (Leuther et al. 1999), denn die Nuklease Mre11 aus dem MRN-Komplex kann die so genannten dirty ends der DNA zurechtschneiden (Liu et al. 2002; Lobachev et al. 2002). Als dritter Schritt folgt die Homologe Rekombination, durch die Rekombinationsproteine der Rad52 Gruppe (Yuan et al. 2003). Das Rad51 Nukleoprotein Filament und seine paralogen Proteine Rad51B, Rad51C, Rad51D und Xrcc2, Xrcc3 interagieren mit der unbeschädigten DNA und katalysieren, wenn sie ein homologes Stück gefunden haben, den Strangaustausch (Petukhova et al. 1998; Wood et al. 2001). Ein anderes wichtiges Protein, das mit Rad51 interagiert, ist das

13 11 Replikationsprotein A (RP-A), welches die Rad51 vermittelte DNA- Paarung stabilisieren soll (Eggler et al. 2002). Es wurde auch die Interaktion von BRCA1 und BRCA2 an Rad51 gezeigt, die wahrscheinlich zur Lokalisation von Rad51 in den Kern sowie zur Bildung von Foci an beschädigter DNA führt (Chen et al. 1999; Davies et al. 2001; Scully et al. 2000). Das 3 Ende der beschädigten DNA wird nun von einer DNA Polymerase verlängert, welche die Informationen hierfür vom unbeschädigten Schwesterchromatid bezieht. Anschließend wer-den die Enden von einer Ligase verbunden (Haber 2000). Als letzter Schritt kommt es zum Zerfall des Reparaturkomplexes und zur Fort-setzung des Zellzyklus (Lisby and Rothstein 2004). 3.3 Nbs1 Das Nijmegen Breakage Syndrom ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, welche durch eine Mutation im NBS1-Gen entsteht. Die Krankheit zeichnet sich durch Immunschwäche, erhöhtem Risiko für Malignome, gesteigerter Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung, chromosomaler Instabilität und abnormer Zellzykluskontrollpunkte aus (D'Amours and Jackson 2002). Das Genprodukt von NBS kann mit Rad50 und Mre11 einen Komplex (MRN) bilden, der eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von DNA-Schäden und dem Erhalt der chromosomalen Stabilität spielt (Zhang Y et al., 2006). Der Komplex besitzt weiterhin eine Exonuklease-, Endonuklease- und Helikasefunktion. In vitro konnte gezeigt werden, dass über die von Rad50 gebildeten Zinkhaken die DNA Enden eines DSB zusammengehalten werden (de Jager et al. 2001; Dudasova et al. 2004; Hopfner et al. 2002). Das Nbs-Protein besitzt drei funktionelle Regionen: einen N-Terminus, eine zentrale Region und den C-Terminus. Die C-terminale Region bindet an den MRN Komplex. Die N-terminale Region von Nbs1 besitzt eine forkhead-associated domain (FHA) und eine BRCT (BRCA1 C-Terminus) Domäne. In

14 12 eukaryotischen Kernproteinen, die eine wichtige Rolle bei der Zellzykluskontrolle und der DNA-Reparatur spielen, sind FHA und BRCT Domänen weit verbreitet. Über die BRCT Region ist noch wenig bekannt, von der FHA Region nimmt man an, dass sie an der Phosphospezifischen Interaktion zweier Proteine beteiligt ist und die Phosphorylierung am Partnerprotein erkennt. Außerdem zieht sie den MRN Komplex zum Doppelstrangbruch (Kobayashi et al. 2004). Abbildung 1: Graphische Darstellung der Struktur von Nbs1 nach Kobayashi (Kobayashi et al., 2004). Mit freundlicher Genehmigung von Junya Kobayashi. Bis jetzt ist noch unklar, wie Nbs1 den Doppelstrangbruch erkennt und den MRN Komplex zu diesem hinführt. Jedoch wird angenommen, dass Nbs1 an der C-terminalen Region an MRE11 gebunden wird und somit zum Schaden geführt wird. MRE11 stellt also ein Sensorprotein dar, dass als erstes den Doppelstragbruch erkennt (Petrini et al. 2003). Nun wird der MRN-Komplex am N-Terminus von Nbs1 an H2ax gebunden, dieser Weg ist Atm-abhängig, da H2ax von Atm oder anderen Mitgliedern der Atm-Familie phosphoryliert wird. Die phosphorylierte Form von H2ax, γh2ax, rekrutiert dann weitere MRN-Komplexe zu dem DNA-Schaden und initiiert die homologe Rekom-bination. Für die nichthomologe Rekombination selbst scheint Nbs1 nicht unbedingt

15 13 nötig zu sein, es könnte jedoch eine wichtige Rolle in der Erkennung von DNA-Enden während des NHEJ spielen (Kobayashi 2004). Aber auch in der Signaltransduktion der Zellzyklus-Checkpoints in der G2- Phase ist Nbs1 als Substrat von Atm involviert. Wenn dieser Mechanismus außer Kraft gesetzt ist, ist die G2-Kontrolle fehlerhaft und die Zelle kann weiterhin trotz vorhandener Doppelstrangbrüche DNA synthetisieren. Dies nennt man eine radioresistente DNA-Synthese (Petrini 2000). 3.4 Pml nuclear bodies Promyelocytic leukaemia nuclear bodies (Pml NBs), auch Kremer Bodies genannt, sind Multiproteinkomplexe des Zellkerns, deren genaue molekulare und biochemische Funktion noch unbekannt sind. Sie haben einen Durchmesser von circa 0,2-1µm und ihre Anzahl im Zellkern variiert zwischen fünf und 30 (Melnick et al. 1999). Das Pml- Protein ist Bestandteil des Pml NB. In einem Pml NB sind, neben Pml und SP100, über 60 Proteine lokalisiert, welche im Grunde genommen in fast allen nukleären Vorgängen, wie Transkription, DNA-Reparatur, Apoptose und Tumorsuppression involviert sind (Dellaire et al. 2004; Salomoni et al. 2002; Takahashi et al. 2004; Zhong et al. 2000) Trotz der großen wissenschaftlichen Aufmerksamkeit, die den Pml NBs gezollt wird, ist deren genaue Funktion noch unbekannt. Es werden drei mögliche Modelle vorgeschlagen. Im ersten Modell stellen die Pml NBs Aggregate für überschüssige nukleoplasmatische Proteine dar, die bei Bedarf von den Pml NBs freigesetzt werden. Pml NBs würden somit als Regulator für die Konzentration der Zellkernproteine fungieren (Negorev et al. 2001). Im zweiten Modell sind Pml NBs Orte für spezielle Kernaktivitäten, wie zum Beispiel Transkription-Regulation und DNA- Replikation. Beweisend für dieses Modell war die Entdeckung von neu synthetisierter RNA in der Peripherie der Kremer Bodies (Boisvert et al., 2000). Im dritten Modell stellen Pml NBs Orte der postranslationalen

16 14 Modifikation dar. Beobachtungen haben gezeigt, dass p53 am Pml NB phosphoryliert und acetyliert wird (D'Orazi et al. 2002; Hofmann et al. 2002; Pearson et al. 2000). Diese drei Modelle schließen sich nicht unbedingt gegenseitig aus. Das Pml-Protein besitzt mehrere Zinkfinger Domänen, welche als RING oder B-Box bezeichnet werden, und eine α-helikale Form. In früheren Studien nahm man an, dass Pml die Zinkfinger nutzt, um direkt an DNA zu binden und die Genexpression zu verändern (Borden et al. 1995). Heute weiß man aber, dass Pml nicht an Nukleinsäure bindet, sondern die RING und B-Box Domänen nutzt, um mit den Partnerproteinen zu interagieren und die strukturelle Beschaffenheit und nachfolgende physiologische Wirksamkeit der Pml NBs zu gewährleisten (Strudwick et al. 2002). Die Mehrzahl an Pml bildet NBs, es gibt aber auch eine lösliche Form im Zellkern und einige, die im Zytoplasma lokalisiert sind. Durch alternatives Spleißen kommen verschiedene Isoformen hervor, welche an ihrem C-terminalen Ende und in ihrer subzellulären Verteilung variieren (Fagioli et al. 1992; Flenghi et al. 1995; Melnick and Licht 1999). In Bezug auf ihre Beweglichkeit kann man Pml in drei Gruppen teilen: 25% sind stationär, 63% zeigen eine langsame Beweglichkeit und 12% eine schnelle Beweglichkeit von 4,0-7,2µm/s (Borden 2002). Interessant ist, dass Nbs1 über die Interaktion mit Sp100 zu Pml rekrutiert wird. Die Interaktion von Sp100 und Nbs1 erfolgt über die Aminosäure von Nbs1, welche das BRCT Motiv und Atm Phosphorylierungsstellen enthalten. In Säugetierzellen wurden die Komplexbildung von Sp100 mit Nbs1 und die Kolokalisation von Sp100 und Nbs1 in PML gezeigt. Möglicherweise spielt die Lokalisation von Nbs1 im PML durch Sp100 in der Verbindung zu weiterführenden zellulären Antworten, wie Zellzyklusarrest und Apoptose eine Rolle (Naka et al. 2002).

17 15 Um das Überleben einer Zelle zu sichern oder bei Bedarf in den gezielten Zelltod (Apoptose) zu gehen, ist die posttranslationale Modifikation eine wichtige Option für die Zelle. Posttranslationale Modifikation bedeutet, dass Proteine nach ihrer Entstehung, zum Beispiel durch Kinasen verändert werden können. Posttranslationale Modifikationen sind schon lange Bestandteil strahlenbiologischer Forschung. Zur Zeit sind v.a. die Phosphorylierungen, als Teil der posttranslationalen Modifikation, am besten charakterisiert (Bree et al. 2004). Genaue Angaben über die Menge der hinzugekommenen Phosphorylierungen und die zweidimensionale Darstellung sind in der Literatur jedoch selten bis gar nicht aufzufinden. Manche Daten schließen bei den 2D-Ergebnissen von der Veränderung am isoelektrischen Punkt direkt auf die Zahl der Phosphorylierungen. Jedoch sollte man von Ladungsveränderungen sprechen, da Acetylierungen ebenfalls eine gewisse Rolle spielen. Bei den Phosphorylierungen kommen zwei negative Ladungen dazu, wohingegen durch die Acetylierung nur eine negative Ladung erzeugt wird (siehe Anhang Abbildung 30 und 31). Mit Hilfe der zweidimensionalen Gelelektrophorese und spezifischen Antikörpern konnten in dieser Arbeit die Zusammenhänge der Phosphorylierungen näher dargestellt werden. Ziel dieser Arbeit war es, Phosphorylierungen in Abhängigkeit der Bestrahlungsdosis und der Reparaturzeit zu betrachten. Hierbei wurden lymphoblastoide Zellen einer gesunden Person und eine Zelllinie mit dem Nijmegen Breakage Syndrom, also eine Zelllinie mit mutiertem NBS untersucht. Das Interesse lag hauptsächlich bei Pml und Nbs1. Sowohl bei der normalen Zelllinie als auch bei der NBS -/- -Zelllinie konnte ein Anstieg der Ladungen, sprich der Phosphorylierungen verzeichnet werden.

18 16 4 Material und Methoden 4.1 Zellvorbereitung Für die Versuche wurden EBV transformierte lymphoblastoide Zelllinien (LBZ) einer gesunden Kontrolle (Sbl2) und eines Nbs1-defizienten Patienten (p122) in einem LBZ-Medium (80% RPMI1640, 20% FKS, 2% L-Glutamin und 0,2% Gentamicin) bei 37 C im CO 2 -Brutschrank (5% CO 2 ) kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen mit einer Röntgenröhre (Seifert-Isovolt 150) mit 2mm Aluminiumfilter mit 5Gy bestrahlt und je nach Versuch für unterschiedliche Zeitspannen (Fünf Minuten bis 72 Stunden) in den Brutschrank gestellt, um den Zellen Zeit zur Reparatur zu geben. 4.2 Proteinisolierung Um die Zellen in eine Kernfraktion und zytoplasmatische Fraktion aufzutrennen, wurde der NE-Per Nuclear and Zytoplasmatic Extraction Reagents Kit (Pierce, Rockford, USA) verwendet. Nach der Vitalitätskontrolle unter dem Mikroskop werden die Zellen und das Medium aus den Petrischalen in ein 50ml Zentrifugenröhrchen pipettiert und bei 4 C und 173g acht Minuten zentrifugiert. Das Medium wird abgesaugt und die Zellen werden zweimal mit Phosphatpuffer (1x PBS) gewaschen. Der Überstand wird jeweils abgesaugt. Anschließend löst man die Zellen in 1ml 1x PBS und überführt sie in ein 1,5ml Eppendorf- Gefäß. Nach wiederholtem Zentrifugieren und Absaugen wird die Menge der Zellen mit Hilfe einer Waage bestimmt. Hierbei wird angenommen, dass 20mg 10 6 Zellen entsprechen. Nun wird eiskaltes CER1 (NE-Per-Kit Pierce, Rockford, USA) zugegeben, die nötige Menge wird anhand des Zellpellets bestimmt. CER1 wird davor mit den Proteinaseinhibitoren in bekannten Konzentrationen versetzt. Die Proteaseinhibitoren sind 1µg/ml Leupeptin, 1µg/ml Pepstatin, 1µg/ml

19 17 Aprotinin, 1µmol PMSF, die Phosphataseinhibitoren 50 mm NaFluoride und 1mmol NaOrthovanadate. Das Gemisch wird kurz durchmischt und zehn Minuten auf Eis stehen gelassen. Dann wird eiskaltes CER2 dazugegeben. Nach Durchmischung und einminütiger Inkubationszeit wird das Eppendorf-Gefäß fünf Minuten bei 16000g zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein neues vorgekühltes Eppendorf-Gefäß überführt und enthält den zytoplasmatischen Extrakt. Das verbliebene Pellet wird in eiskaltem, mit Proteinaseinhibitoren versetztem NER resuspendiert. Anschließend wird das Eppendorf-Gefäß viermal alle zehn Minuten auf höchster Stufe durchmischt. Nach 40 Minuten Inkubationszeit wird das Gemisch zehn Minuten bei 16000g zentrifugiert. Der Überstand wird in 100µl auf neue vorgekühlte Eppendorf-Gefäße überführt und enthält die Kernfraktion, mit welcher in diesen Versuchen weiter gearbeitet wurde D-Quant-Kit Der 2D-Quant-Kit (GE Healthcare, München) wird benutzt, um den Proteingehalt der Probe zu bestimmen. Der Kit beruht auf der spezifischen Bindung von Kupfer an das Protein. Dazu stellt man zunächst eine Standard-Verdünnungsreihe her. Diese besteht aus sechs Eppendorfgefäßen, welche gemäß der Tabelle mit der im Kit enthaltenen Standardlösung an Rinderserumalbumin (BSA standard solution) zu befüllen sind. Gefäßnummer BSA standard solution 0µl 5µl 10µl 15µl 20µl 25µl Proteinmenge 0µg 10µg 20µg 30µg 40µg 50µg Tabelle 1: Standardverdünnungsreihe für den 2D-Quant-Kit

20 18 Das Gefäß 1 entspricht dem Nullwert und enthält kein Protein. Nun werden die Eppendorfgefäße für die Proben vorbereitet. Der Bereich des Assays liegt bei 0,5µg bis 50µg. Um zu gewährleisten, dass die Probe im erforderlichen Bereich fällt, sind Doppelproben unerlässlich. Somit wurden für eine Probe zwei Eppendorfgefäße hergerichtet und mit je 5µl Proteinprobe versetzt. Zu jedem Eppendorfgefäß, inklusive der Gefäße für die Standardkurve, werden 500µl Vorbehandlungsreagent (Precipitant) hinzugefügt und kurz durchmischt. Anschließend werden sie für fünf Minuten bei 10000g zentrifugiert, um das Protein zu sedimentieren. Die Eppendorfgefäße werden aus der Zentrifuge genommen und der Überstand verworfen. Um die Restflüssigkeit entfernen zu können, wird noch einmal kurz zentrifugiert und der Überstand entfernt. Nun wird in jedes Eppendorfgefäß 100µl der Kupferlösung und 400µl deionisiertes Wasser gegeben. Nach kurzer Durchmischung werden in jedes Gefäß 1ml eines Farbreagenz gegeben. Das Farbreagenz besteht aus 100 Teilen des Farbreagenz A und 1 Teil des Farbreagenz B. Die Eppendorfgefäße werden mit dem Farbreagenz nun 20 Minuten inkubiert und dann bei 480nm Absorptionsspektrum gemessen. Die gemessenen Werte werden in eine Excel-Datei übertragen. Dort wird eine Standardkurve erstellt, indem die Absorption der Standards gegen die Absorption der Proteine aufgetragen werden. Daraus kann dann die Proteinkonzentration abgelesen werden. 4.4 Clean-Up-Kit Der Clean-Up-Kit (GE Healthcare, München) wird verwendet, um die Proteinproben auf die 2D-Elektrophorese vorzubereiten und von störenden Substanzen, wie zum Beispiel, Salzen, Lipiden und Nukleinsäuren zu befreien. Zu den 100µl Kernfraktion pro Eppendorf-Gefäß wird nun 300µl Vorbereitungslösung (Precipitant) zugefügt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend werden 300µl einer zusätzlichen Vorbereitungslösung (Co-Precipitant) dazugegeben, das

21 19 Gemisch durchmischt und bei 12000g für fünf Minuten zentrifugiert. Der abgesaugte Überstand wird verworfen und auf das nun sichtbare Pellet wird 40µl Co-Precipitant pipettiert und erneut zentrifugiert. Nach der Zugabe von 25µl deionisiertem Wasser wird 1ml Waschpuffer und 5µl Wash-addictive zugefügt und solange gerüttelt bis das Pellet vollständig verteilt ist. Probengefäße wird nun bei 20 C für 30 Minuten inkubiert und alle zehn Minuten kräftig durchmischt. Nach den 30 Minuten werden die Proben fünf Minuten bei 12000g zentrifugiert. Der Überstand wird erneut verworfen und das Pellet in Rehydrationslösung resuspendiert. Nach wiederholter Zentrifugation kann der Überstand direkt auf die erste Dimension geladen werden oder bei 80 C für spätere Analysen gelagert werden. 4.5 Probenaufbereitung und Proteinquantifizierung der eindimensionalen Gelelektrophorese Für die eindimensionale Gelektrophorese, welche bei den Zeitkinetikversuchen genutzt wurde, unterscheidet sich der Ablauf etwas. Nach der Kernisolierung werden die Überstände, welche die Kernfraktion beinhalten, nicht in 100µl-Volumen auf mehrere Eppendorfgefäße aufgeteilt, sondern nur in ein Gefäß überführt. Mit dem BCA Protein-Kit kann die Menge des gewonnenen Proteins quantifiziert werden. Die BCA-Methode zeichnet sich durch eine hohe Empfindlichkeit und eine geringe Störanfälligkeit aus. Der Nachweis beruht auf der Biuret- Reaktion. Proteine bilden mit Cu 2+ -Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex. Die Cu 2+ -Ionen werden zu Cu + -Ionen reduziert, welche wiederum mit der Bicinchinon-Säure einen violetten Farbkomplex bilden. Die Mikrotiterplatte wird nach folgender Tabelle (Tabelle 2) pipettiert.

22 µg/ml 2000µg/ml Blank Blank 1/1X 1/1Y 1/1Z µg/ml 1500µg/ml Blank Blank ½ X ½ Y ½ Z µg/ml 1000µg/ml Blank Blank ¼X ¼Y ¼Z 4 750µg/ml 750µg/ml 1/5 X 1/5 Y 1/5Z 5 500µg/ml 500µg/ml 1/10 X 1/10 Y 1/10 Z 6 250µg/ml 250µg/ml 7 125µg/ml 125µg/ml 8 25µg/ml 25µg/ml Tabelle 2: Anordnung auf Mikrotiterplatte als Pipettiervorlage zur Quantifizierung der durch die Proteinisolierung gewonnenen Proteinmenge. Blank: 25µl Ripa-Lysepuffer, X/Y/Z: Zelllinienproben, ½:12,5µl Probe/12,5µl Ripa-Lysepuffer, ¼: 6µl Probe/19µl Ripa-Lysepuffer, 1/5: 5µl Probe/20µl Ripa-Lysepuffer, 1/10: 2,5µl Probe/22,5µl Ripa- Lysepuffer Die Absorption wird bei 562 nm gemessen. Das Eppendorfgefäß mit der Proteinprobe kann nun bei -80 C gelagert werden. Vor der Gelektrophorese wird die Probe ein letztes Mal aufbereitet. Die Proteine werden mit 6x sample loading buffer (Probenladungspuffer) im Verhältnis 5:1 versetzt. Das SDS im sample loading buffer de-

23 21 naturiert die Proteine und kann über seinen unpolaren Molekülteil mit unpolaren Seitenketten der Proteine in Wechselwirkung treten. Die an das Protein assoziierten SDS-Moleküle verleihen allen Proteinen soviel negative Ladung, dass deren Wanderungsgeschwindigkeit im Gel von der Ladung unabhängig und somit von der Molekülgröße abhängig ist. Des Weiteren enthält der sample loading buffer DTT, welches die Disulfidbrücken der Proteine aufspaltet. Um die Proteine vollständig zu denaturieren werden sie für zehn Minuten bei 95 C abgekocht. Jetzt sind die Proteine zum Pipetieren bereit. 4.6 Gelektrophorese Gelgießen Bei den Versuchen wird mit 10% Polyacrylamidgelen gearbeitet. Als Trägermatrix wird standardmäßig Polyacrylamid verwendet. APS wird als Katalysator für die Polymerisation von Acrylamid benötigt. Sie läuft als Radikalkettenreaktion ab. APS bildet dabei im Wasser freie Radikale, die mit Acrylamid reagieren. Das entstandene Acrylamidradikal kann mit einem weiteren Acrylamid-molekül weiterreagieren. TEMED dient als weiterer Katalysator für die Polymerisation, indem es die Radikalbildung des APS erleichtert und dabei selbst eine stabilere Radikalposition einnimmt. Die Polymerisation erfolgt unter Luftabschluss, da Sauerstoff zum Kettenabbruch führen würde. Während der Polymerisation wird Acrylamid zu Polyacrylamid. Je nach Anteil an Polyacrylamid im Gel lassen sich Proteine unterschiedlicher Größe im Gel auftrennen. Polyacrylamid selbst ist eine visköse Flüssigkeit. Geleigenschaften erhält es erst, wenn eine Vernetzung mit Hilfe von Bisacrylamid entsteht. Polyacrylamidgele sind chemisch inert und besonders stabil.. Nach dem Gießen wird das Trenngel mit Methanol übergossen. Nach der Polymerisierung von mindestens einer Stunde Dauer kann entweder das Auftragsgel gegossen werden oder direkt der

24 22 Gelstreifen mit den durch die isoelektrische Fokussierung aufgetrennten Proteinen aufgelegt werden Eindimensionale Gelektrophorese Es wird die Mini-Protean3 Elektrophoresekammer von Bio-Rad (Hercules, USA) verwendet. Die Gele haben eine Größe von 6cmx8,3cm. in die Taschen des Auftragsgels werden die Proteinproben einpipettiert., Die Gele starten mit 50V für 30 Minuten bis die Proben vom Auftragsgel in das Trenngel eingewandert sind. Danach lässt man die Elektrophorese bei 120V für ca. 1,5 Stunden laufen bis das blaue Farbband das untere Ende des Gels erreicht hat. Das blaue Farbband entsteht durch den im SDS gel loading buffer (Ladungspuffer) enthaltene Farbstoff Bromphenolblau. Dieser Farbstoff zeigt keine Interaktionen mit den Proteinen und er hat die Eigenschaft genau so schnell wie Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 5kDa zu wandern. Als weitere Kontrolle wird ein Marker (3µl Santa Cruz und Low Range, beide von Bio-Rad) in dem Gel aufgetrennt Zweidimensionale Gelelektrophorese Die erste Dimension der 2D-Elektrophorese besteht aus der isoelektrischen Fokussierung. Diese Methode trennt die Proteine nach ihren isoelektrischen Punkten auf. Der isoelektrische Punkt (pi) ist der spezifische ph-wert, bei dem die Ladung des Proteins Null ist. Proteine sind positiv geladen bei einem ph-wert unter ihrem pi und sie sind negativ geladen bei einem ph-wert über ihrem pi. Für die erste Dimension ist ein ph-gradient essentiell. Dieser ph-gradient ist Bestandteil der verwendeten Gelstreifen. Er entsteht durch Säure- und Basenpuffer im Polyacrylamidgel des Streifens. Durch unterschiedliche Konzentrationen der Puffer entstehen die verschiedenen ph-bereiche. Mit Hilfe des ph-gradienten und des elektrischen Feldes, wandert das Protein zu der Position auf dem Gelstreifen, an dessen Stelle seine

25 23 Ladung Null beträgt. Ein Protein mit positiver Ladung wandert somit durch den ph-gradienten Richtung Kathode und stoppt, wenn es seinen spezifischen pi erreicht hat. Der Gelstreifen selbst besteht aus einem 3mm breiten Polyacrylamidgel und einem Plastikrücken, auf dem das Gel aufgetragen wurde. Zur einfacheren Handhabung mit der Pinzette sind die Enden des Streifens gelfrei. Hier bei diesen Versuchen wurden 7cm lange Streifen im ph- Bereich 4 bis 7 und 11 cm lange Streifen im Bereich 3 bis 10 verwendet (GE Healthcare, München). Zuerst werden 7cm bzw. 11cm lange Streifen mit der Gelseite nach unten in den Reswelling Tray gelegt. Mithilfe von 125µl beziehungsweise 200µl Rehydrationslösung in welche schon die entsprechende Proteinmenge eingebracht wurde, quellen die Streifen über Nacht auf. 24 Stunden später werden die Streifen aus dem Reswelling Tray genommen und in die Vertiefungen der Fokussierungslade (Strip Aligner) gelegt und an die Elektroden angeschlossen. In drei Schritten werden die Streifen bei 20 C über vier Stunden fokussiert. Für den zweiten Teil der 2D-Elektrophorese löst man zum einen 100mg DTT in 10ml SDS-Equilibrierpuffer und 250mg Iodacetamid in 10ml SDS-Equilibrierpuffer. Die Gelstreifen werden zuerst in der erstgenannten Lösung und danach in der zweiten Lösung für jeweils 15 Minuten equilibriert. Durch die Equilibrierung mit einem Reduktionsmittel werden die Disulfidbrücken aufgespalten und die Quartärstruktur des Proteins aufgelöst. Iodoacetamid alkyliert die Thiolgruppen der Proteine und verhindert dadurch die Reoxidation während der Elektrophorese. Die 11cm langen Streifen müssen nach dem Equilibrieren noch zurecht geschnitten werden, da die verwendeten Gele nur circa neun Zentimeter lang sind. Hierzu werden die Streifen mit einem Skalpell am Anoden-Ende zwei und am Kathoden-Ende ein Zentimeter gekürzt. Nun wird der Streifen zwischen die Platten auf die Oberfläche

26 24 des Gels gelegt und mit einem Plastikspatel so auf das Gel aufgebracht, dass das Stripgel mit dem vertikalen Gel im Kontakt steht. Es ist darauf zu achten, dass der Streifen immer linksbündig anliegt, um bei der späteren Auswertung vergleichbare Resultate bezüglich der Lage der Proteine zu erhalten. Das Gel und der Gelstreifen werden mit Agarose-Lösung überschichtet. In der zweiten Dimension werden die Gele in der Elektrophoresekammer bei 80V gestartet, damit die Proteine vom Streifen der ersten Dimension in das Gel einlaufen können. Mit 120V wird auch diese 2D- Elektrophorese nach 1,5 Stunden beendet. 4.7 Western Blot Beim Blotten werden die Proteine eines SDS-Gels elektrophoretisch auf eine Membran übertragen, zum einen, weil die Membran einfacher zu handhaben ist, und zum anderen, da die Proteine mit spezifischen Bindungseigenschaften sich direkt über Antikörper nachweisen lassen. Die Proteine lassen sich direkt auf der Membran sequenzieren. Der Blott ist also eine wichtige Verbindung zwischen Gelelektrophorese und der Proteinanalyse. Die PVDF-Membran wird kurz mit Methanol befeuchtet. Anschließend wird die Membran zusammen mit den Siebpads und dem Filterpapier in Blotting-Puffer eingeweicht. Der Elektroblotter wird wie folgt aufgebaut: Siebpad, Filterpapier, Gel, PVDF-Membran, erneut Filterpapier und Siebpad. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen entstehen, da sonst die Proteine nicht von Gel zu Membran wandern können und dass der ganze Aufbau richtig der Anode und Kathode entsprechend angeordnet wird. Die Membran muss zur Anode gerichtet sein, da die Proteine durch das SDS im sample loading buffer negativ geladen sind und deshalb zur Anode wandern. Der Elektroblotter wird mit Blotting-Puffer befüllt und der Western Blot wird nun mit 80V und

27 25 300mA für zwei Stunden gestartet. Für diese Zeit wird das Gerät auf Eis gestellt, um übermäßige Hitzeentstehung zu vermeiden. Nach dem Blotten wird die PVDF-Membran für fünf Minuten in 1xTBS gewaschen. Anschließend mit Blocking Solution für mindestens eine Stunde inkubieren. Wird im Anschluss ein nichtphosphorylierter Antikörper (Pml von Santa Cruz, Santa Cruz, USA; Nbs1 von Abcam, Cambridge, UK) verwendet, besteht die Blocking Solution aus 100ml TBS/T und 5g Trockenmilch. Verwendet man jedoch Phospho-Antikörper (Phospho- Nbs1 von Novus, Littleton, USA) benützt man Blocking Solution bestehend aus 100ml TBS/T und 5g BSA (Rinderserumalbumin). Da die Bestandteile der Trockenmilch potentielle Phosphorylierungsstellen besitzen, wird zum Nachweis von Phosphorylierungen der Phospho- Antikörper mit BSA, verwendet. Albumin besitzt nämlich keine potentiellen Phosphorylierungsstellen. Nach dem Blocken wird die Membran dreimal für fünf Minuten mit 1xTBS/T gewaschen. Nun kann der Antikörper im Blocking Solution gelöst werden. Die Membran wird über Nacht bei 4 C in dieser Lösung inkubiert. Die Menge des Antikörpers ist den jeweiligen Konzentrationsvorschlägen der einzelnen Firmen zu entnehmen. Am nächsten Tag wird die Membran dreimal mit 1xTBS/T für fünf Minuten gewaschen. Anschließend wird der Sekundär-Antikörper in Blocking Solution gelöst und die Membran darin eine Stunde inkubiert. Die Art des Sekundär-Antikörper richtet sich nach dem verwendeten Primär- Anti-körper. Bei diesen Versuchen wurde ein gegen Rabbit gerichteter Antikörper (Sheep Anti- Rabbit, HRP- Gekoppelt (Abcam)) im Verhältnis 1:4000 benützt. Das bedeutet, dass 2,5µl Sekundär-Antikörper in 10ml Blocking Solution gelöst werden. Nach der Inkubation wird die Membran erneut dreimal mit 1xTBS/T für fünf Minuten gewaschen und einmal kurz mit Aqua bidest gewaschen. Die fertige Super Signal West Pico Chemiluminiscent Substrat-Lösung (Pierce, Rockford, USA) wird gemischt und die Membran für fünf Minuten eingelegt. Nun wird die

28 26 Membran in einer Filmkassette zwischen zwei Glassichthüllen eingelegt. Der BioMax Light Film (Kodak Stuttgart) wird je nach erzieltem Ergebnis zwischen fünf Sekunden und fünf Minuten aufgelegt. Als Letztes wird der Film in einem Entwicklungsgerät automatisch fertig gestellt Stripping Diese Methode wird angewandt um die Membran nochmals mit einem anderen Antikörper anfärben zu können. Es muss somit der vorherige Antikörper entfernt werden. Die Membran wird zunächst drei Mal in 1xTBS/T gewaschen. Nun inkubiert man die Membran unter Schütteln 15Minuten in Western-Re-Probe (Western Blot Sripping Buffer, Pierce, Rockford, USA). Nach erneutem dreimaligem Waschen in 1xTBS/T, beginnt der Ablauf des Proteinnachweises wieder mit 1h Blocken in der Blocking solution. 4.8 Silberfärbung Bei einigen Versuchen wird neben dem Western Blot auch die Silberfärbung angewandt. Die Silberfärbung ist sehr sensitiv, so können noch 1ng Protein pro Spot nachgewiesen werden. Bei der Silberfärbung bildet das Ag + -Ion Komplexe mit den Glu-, Asp- und Cys-Resten der Proteine. Alkalisches Formaldehyd reduziert das Ag+ der Komplexe zu Ag. Die Silberfärbung erfolgt mit dem Silver Staining Kit (Amersham, München). Das Gel wird nach der zweidimensionalen Gelelektrophose für zwei Stunden fixiert. Anschließend erfolgt 60 Minuten das Sensitizing. Nun wird das Gel fünf Mal acht Minuten lang mit Aqua bidest gewaschen. Hiernach durchläuft das Gel eine Stunde die Silberreaktion. Nach wiederholtem Waschen (4x1 Minute) wird das Gel circa drei Minuten entwickelt. Wenn man auf dem Gel deutliche Spots entdecken kann, wird die Stopplösung zugegeben und das Gel darin für 45 Minuten inkubiert. Nochmals wird das Gel dreimal fünf Minuten

29 27 gewaschen, um nun 20 Minuten in der Preservationslösung zu inkubieren. Hiermit wird das Gel haltbar gemacht. Das Gel kann jetzt eingescannt und ausgewertet werden.

30 28 5 Verbesserte Methoden Um sicher nachweisen zu können, dass die Punkte auf dem Röntgenfilm den gesuchten Proteinen entsprechen, wird zusätzlich eine Art Marker verwendet. Nach dem Gelgießen wird deswegen eine 1cm lange Tasche auf das Trenngel gegossen. Dazu wird 3% Autragsgel verwendet. Diese Tasche befindet sich links auf dem Trenngel. Hierzu wird das Trenngel nach rechts mit Hilfe von Deckgläschen abgedichtet und in den entstandenen 1cm großen Raum das Auftragsgel gegossen und mittels eines 5mm breiten Metallspatels eine Tasche gebildet (siehe Zeichnung). In die Tasche wird nach der Polymerisation 10µl einer Proteinprobe gegeben. Um nun den Gelstreifen auf das Trenngel aufzulegen, muss dieser mit einem Skalpell um 1cm gekürzt werden. Da die aufgetragene Probe in der Gelektrophorese nur nach Größe aufgetrennt wird und mit demselben Antikörper angefärbt wird, wie die Proteine des Gelstreifens, kann damit einwandfrei bewiesen werden, dass es sich bei den Punkten um das gesuchte Protein handelt, wenn sich Punkte und Markerprotein auf derselben Höhe auf dem Röntgenfilm befinden. Indem man kleine Filterpapierstückchen mit einer Proteinprobe benetzt und diese linksbündig an den Gelstreifen anlegt, ergibt sich eine weitere Option eine Probe als Marker zu nützen.

31 Abbildung 2: Darstellung des Polyacrylamidgels mit Geltasche und Gelstreifen 29

32 30 6 Auswertung Die Röntgenfilme mit den Ergebnissen der zweidimensionalen Gelelektrophorese, als auch die Gele der Silberfärbung wurden mit einem Scanner (Mikrotek) eingescannt und ausgewertet. Die Auswertung der Bilder wurde Anhand des Bildanalyseprogramms Biomas durchgeführt (Biomas-Software, Version 3.3, 10/2004, MSAB (Modulare Systeme in der angewandten Biologie), Dr.med.L.Distel, Erlangen, Germany). Die Aminosäuresequenz und der isoelektrische Punkt von Pml und Nbs wurden der Homepage Phosphosite von CellSignal übernommen und entsprechend der Arbeit von Bjellqvist (Bjellqvist et al. 1993) die Verschiebung des isoelektrischen Punktes in Abhängigkeit von den vorhandenen Ladungen berechnet und in einem Diagramm aufgetragen (Abbildung 3 und 4 ). Die erhaltenen Punkte wurden mit einem Polynom 2ten Grades angepasst. f: Qv Q Q 2 Es resultiert die Funktion Q v des isoelektrischen Punktes in Abhängigkeit von den Ladungen Q mit den Termen, und. Term Wert Fehler

33 31 Über die Umkehrfunktion kann dann mit Hilfe des gemessenen pi die Anzahl der vorhandenen Ladungen berechnet werden: Q n 2 4 ( pi) (2 ) pi Pml 90 kda Pml 97 kda Pml 60 kda Anzahl der phosphorylierten Stellen Abbildung 3: Graphische Darstellung der isoelektrischen Punkte auf der y- Achse und die Anzahl der Ladungen auf der x- Achse, Pml ist im Diagramm gekennzeichnet.

34 pi 5 NBS Anzahl der Ladungen Abbildung 4: Graphische Darstellung der isoelektrischen Punkte auf der y- Achse und die Anzahl der Ladungen auf der x- Achse, Nbs1 ist im Diagramm gekennzeichnet.

35 33 7 Ergebnisse Um das Überleben einer Zelle zu sichern oder bei Bedarf in den gezielten Zelltod (Apoptose) zu gehen, ist die posttranslationale Modifikation eine wichtige Option für die Zelle. Posttranslationale Modifikation bedeutet, dass Proteine nach ihrer Entstehung, zum Beispiel durch Kinasen verändert werden können. So stellen Phosphorylierungen einen Teil dieser posttranslationalen Modifikation dar. Ziel dieser Arbeit war es Phosphorylierungen in Abhängigkeit der Bestrahlungsdosis und der Reparaturzeit zu betrachten. Hierbei wurden lymphoblastoide Zellen einer gesunden Person und eine Zelllinie mit dem Nijmegen Breakage Syndrom, also eine Zelllinie mit mutiertem NBS untersucht. Das Interesse lag bei Pml und Nbs1. Zuerst wurden die Proteine in ihrer Gesamtheit betrachtet, um sie dann spezifischer bezüglich ihrer Phosphorylierung zu untersuchen. 7.1 Eindimensionale Gelektrophorese und Western Blot Zuerst sollte untersucht werden, ob sich das Reparaturprotein hauptsächlich im Kern der Zelle befindet oder ob sich auch im Zytoplasma nennenswerte Mengen des Proteins befinden. Weiter sollte überprüft werden, ob sich unter Bestrahlung eine Veränderung der Lokalisation des Proteins ergibt. Die Proteine des Zytoplasmas und Kern wurden mit dem Ner-Per-Kit aufgetrennt. Die Proteine auf den Membranen des Western Blots wurden mit phospho-nbs-serin343 und Gesamt-Nbs1-Antikörpern angefärbt. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass sich im Zytoplasma kein Nbs1-Protein befindet und somit der NerPer-Kit, die beiden Fraktionen zuverlässig trennt. Ebenso ergibt sich unter Bestrahlung keine Veränderung der Lokalisation der Proteine.

36 34 Zeit : h 3h 6h 12h 24h 48h Nbs1 Abbildung 5: Darstellung von Nbs1 im Kernextrakt Somit wurde im Folgenden nur noch der Kernextrakt untersucht. Nun galt es die unterschiedlichen Reparaturzeiten zu betrachten, es wurden Zeiten zwischen fünf Minuten und 72 Stunden gewählt. Die Zellen wurden mit 5Gy bestrahlt, ebenso wurde ein unbestrahltes Zellkollektiv mit untersucht. Nach der Gelelektrophorese und dem Western Blot wurden die Proteine Nbs1 und Pml mittels Antikörper und fluoreszierendem Sekundärantikörper detektiert. Zeit: h 3h 6h 18h 24h 36h 48h Pml Pml ß-Actin Abbildung 6: Darstellung des Pml-Proteins und der Ladungskontrolle ß-Actin nach verschiedenen Reparaturzeiten. Die Abbildung 6 zeigt die Anfärbung der Western Blot Membran mit Pml-Antikörper und β-actin. Im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle kommt es bereits nach 30 Minuten zu einem Anstieg der Proteinmenge. Aber auch jenseits der Achtstundengrenze zeigt sich kein Abfall des Pml-Proteins. Betrachtet man alle Reparaturzeiten ist bis 24 Stunden nach Bestrahlung ein Anstieg der Proteinmenge zu sehen. Erst nach 36 Stunden zeigt sich ein Absinken der Proteinmenge.

37 35 Wenn man nun die Zeitkinetikversuche mit Nbs1 analysiert, ergibt sich auch hier ein Unterschied zwischen den unbestrahlten und den mit 5Gy bestrahlten Zellen. Die Proteinmenge steigt im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle bereits nach fünf Minuten an und nimmt dann konstant zu. Die Menge an Nbs1 beginnt nach 24stündiger Reparaturzeit zu sinken, ein weiteres Absinken ist auch nach 48 Stunden zu beobachten. Zeit: h 3h 6h 12h 24h 48h Nbs1 Nbs1 ß-Actin Abbildung 7: Darstellung von Nbs1 und der Ladungskotrolle ß-Actin nach verschiedenen Reparaturzeiten. Inkubiert man die Western Blot Membran mit phospho-nbs-serin343- Antikörper erkennt man nach Detektion ebenfalls einen Anstieg der Proteinmenge. Im Vergleich zur unbestrahlten Zelllinie ist 30 Minuten nach Bestrahlung mehr Protein vorhanden. Die Menge an Protein nimmt bis 24 Stunden nach Bestrahlung zu und beginnt nach 36 Stunden wieder zu sinken. Zeit: h 3h 6h 18h 24h 36h 72h pnbs1 Abbildung 8: Darstellung von phospho-nbs1 nach verschiedenen Reparaturzeiten.

38 36 Da nun gezeigt werden konnte, dass die Menge an Pml- und Nbs1- Protein nach Bestrahlung zunimmt, lag das Interesse nun bei der Aktivierung, sprich Phosphorylierung der genannten Proteine in Abhängigkeit zu den unterschiedlichen Reparaturzeiten D-Gelektrophorese, Silberfärbung und Western Blot In der eindimensionalen Auftrennung der Proteine erkennt man eine Vielzahl von Banden, die sich überlagern und keine klaren Aussagen über die Lage der Proteine und deren Phosphorylierungsgrad zulassen. Eine bessere Auftrennung wurde mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese erreicht. Die Trennung in der Horizontalen nach isoelektrischem Punkt und in der Vertikalen nach der Größe ergibt eine deutlichere Auftrennung der einzelnen Proteine. Des Weiteren ist eine bessere Zuordnung der einzelnen Proteine nach Größe und isoelektrischem Punkt möglich. Daher wurde die zweidimensionale Gelektrophorese mit anschließendem Western Blot und Detektion der gesuchten Proteine mittels Antikörper angewandt. Die sehr sensible Silberfärbung wurde durchgeführt, um die mit Hilfe der Antikörper gewonnenen Ergebnisse genau zu lokalisieren. Sie erlaubt mit Hilfe des Größenmarkers und der Kenntnisse der Lage der isoelektrischen Punkte eine genaue Lokalisation des Proteins. Die Silberfärbung bietet eine gute Möglichkeit durch Bestrahlung induzierte Proteinveränderungen darzustellen.

39 37 Abbildung 9a): Kernprotein Silberfärbung eines Acrylamidgels; Zelllinie Sbl1; Lage von Pml mit rotem Kreis gekennzeichnet. Abbildung 9b): farbliche Übereinanderlagerung der Ergebnisse einer Silberfärbung und eines Western Blots; Lage von Pml mit schwarzem Kreis gekennzeichnet. Wie oben berichtet wurden aus der Vielzahl der Proteine Pml und Nbs1 ausgewählt, welche nun genauer betrachtet werden sollen. Pml besitzt im unphosphorylierten Zustand einen isoelektrischen Punkt von 6,47 und sein Molekulargewicht beträgt 90kDa. Vom Pml-Protein existieren noch mindestens sechs weitere Isoformen, bei denen jedoch nur von zweien der pi von 5,88 und 6,04 bekannt ist. In Pml sind die Aminosäuren, die phosphoryliert werden können mit Serin 83-mal,

40 38 Threonin 30 Mal und Tyrosin 14 Mal vorhanden. Lysin, das acetyliert werden kann ist 30 Mal vorhanden. SQ-Stellen, die durch ATM und andere Proteien der PIKK-Familie phosphoryliert werden sind drei Mal vorhanden. Insgesamt besitzt Pml mit seinen Isoformen 14 bekannte Phosphorylierungsstellen, drei für Threonin und elf für Serin. Mit zunehmender Zahl der Phosphatgruppen nimmt der pi des Pml ab. Eine Phosphorylierung verändert den pi im Bereich von 6 um 0,06. Sind alle 14 Stellen phosphoryliert, liegt der pi bei 5, Pml Gesunde Zelllinie Sbl1 Abbildung 10: bildliche Darstellung der 2D-Ergebnisse des Western Blots: Pml der Sbl1-Zelllinie. Die Pfeile stellen die Phosphorylierungen dar. In Abbildung 10 kann man die Ergebnisse des Western Blots nach zweidimensionaler Gelelektrophorese betrachten. Die zu erkennenden Punkte stellen das Protein Pml der Sbl1-Zelllinie dar. Der erste Punkt stellt den Anteil des Proteins dar, der nicht phosphoryliert ist und somit keine Ladung trägt. Eine Zunahme der Ladungen kann sich in Form von Phosphorylierungen im Sinne von zwei Ladungen und Acetylierungen, welche eine Zunahme von einer Ladung bewirken können, auswirken.

41 39 Abbildung 11: bildliche Darstellung der 2D-Ergebnisse des Western Blots: Pml der Sbl1-Zelllinie unbestrahlt. Pfeile von links nach rechts entsprechen den pi-werten: 6,4; 6,3; 6,1; 6,0; 5,9; 5,7. In Abbildung 11 ist Pml im unbestrahlten Zustand dargestellt. Im unbestrahlten Zustand trägt Pml im Mittel neun Ladungen, was für vier Phosphorylierungen und eine Acetylierung spricht. Prozentual betrachtet sind 9,4% unphosphoryliert, 9,8% tragen 2 Ladungen, 41,8% tragen sieben Ladungen, 18% tragen 13 Ladungen, 16,1% tragen 17 Ladungen und 4,8% tragen 21 Ladungen. In der unbestrahlten Kontrolle beträgt der pi von Pml 6,47. Abbildung 12a): bildliche Darstellung der 2D-Ergebnisse des Western Blots: Pml der Sbl1-Zelllinie nach Bestrahlung mit 5Gy und einer Reparaturzeit von einer Stunde. Pfeile von links nach rechts entsprechen den pi- Werten: 6,6; 6,5; 6,4; 6,3; 6,1; 6,0.