Diagnostik und Impfungen
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- Berndt Seidel
- vor 8 Jahren
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1 Grundlagen der Immunologie 5. Semester - Dienstags Uhr Ruhr-Universität Bochum, HMA 20 Diagnostik und Impfungen Albrecht Bufe
2 Immundiagnostik (Antikörper-/ Antigennachweis)
3 Antikörpernachweis: Nephelometrie Antigenüberschuß / Äquivalenz / Antikörperüberschuß Präzipitation Licht Hohe Dichte
4 Streulicht (relative Einheit Antikörpernachweis: Nephelometrie Antigenüberschuß / Äquivalenz / Antikörperüberschuß Antikörperkonzentration mg/dl
5 Quantifizierung von Gesamt-Ig-Antikörpern mittels ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Capture-AK (IgG-Anti-IgE) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat
6 Nachweis von spezifischen Ig-Antikörpern mittels ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Antigen (spezifisches Allergen) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat
7 Quantifizierung des Substrats mittels Photometer
8 SDS-PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese)
9 Western Blot (to blot = mit Löschpapier abtupfen) Gefärbtes SDS-PAGE-Gel Blot nach dem Transfer der Proteine Western Blot Banden, mit einem spezifischen Antikörper identifiziert
10 Western Blot (spezifischer Nachweis eines Proteins mittels Antikörper) Hier Verwendung unterschiedlicher Färbemethoden
11 Immundiagnostik (Nachweis von spezifischen Zellen)
12 Antigendarstellung: Fluoreszenz Figure A-17 part 1 of 2
13 Antigendarstellung: Fluoreszenz l=488 nm Laser (Anregung) Fluorochrom l=530 nm Antikörper Photodetektor + angeschlossenes Emission Analysesystem (PC) Häufig verwendete Fluorochrome Anregung (nm) Abstrahlung (nm)
14 Antigendarstellung: Fluoreszenz Medizinische Bedeutung: Nachweis verschiedener Zelltypen in Suspension (Differentialblutbild) und Gewebeschnitten Langerhansschen Inseln im Pankreas) Zellen (orange = Glutamin-Decarboxylase) ß Zellen (grün = Glucagon)
15 Immundiagnostik (Charakterisierung, Sortierung und Präparation spezifischer Zellen)
16 Zellsortierung: Mononukleäre Zellen mit Ficoll- Hypaque-Gradientenzentrifugation verdünntes Blut Ficoll (Dichte = 1,078) Zentrifugation Thrombozyten Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) Erythrozyten Granulozyten Zellkultur in vitro
17 Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Prinzip] Laser (488 nm) Vorwärtsstreuung (FSC) Zellgröße Seitwärtsstreuung (SSC) Granularität
18 Zellanalysen: Durchflußzytometrie (oder: Fluoreszenz assisted cell sorting = FACS) Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak Flüssigkeitsstrom mit Ak-markierten Zellen Photodetektoren grün rot FSC Laser SSC
19 Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Vollblutanalyse mittels Morphologie] SSC Granulozyten R1 Monozyten FSC Zellschrott Lymphozyten
20 Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Fuoreszenzanalyse aus R1] Dot Plot CD3+ CD3+ T-Zellen T-Zellen Histogramm 20% R1 CD64+ Monozyten Quantitativ! 54% FSC
21 Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak Zellsortierung: Flüssigkeitsstrom mit Ak-markierten Zellen Photodetektoren grün rot FSC Laser SSC Ablenkplatten Sortierte Zellen
22 Zellsortierung: Magnetisch Zweck: Isolierung magnetisch markierter Zellpopulationen aus einem Zellgemisch zur funktionellen oder phänotypischen Analyse Prinzip: Anlegen eines Magnetfeldes Entfernen des Magneten Zellgemisch mit Ak, an die paramagnetische Partikel gekoppelt sind Magnetisch markierte Zellen werden zurückgehalten gebundene Zellen werden freigesetzt
23 Impfung
24 Impfung (vaccination): Schutzimpfung: Erzeugung einer Immunität zur individuellen und kollektiven Vorbeugung (Prävention) gegen Infektionskrankheiten
25 Aktive Schutzimpfung: künstliche Erzeugung einer abgeschwächten Erkrankung durch Einverleibung vermehrungsfähiger, virulenzabgeschwächter Krankheitserreger beziehungsweise Impfkeime.
26 Passive Schutzimpfung: Einspritzung von Immunglobulinpräparationen (spezifische Antikörper) oder Serum aktiv immunisierter Menschen bzw. Tiere
27 Tetanus Diphtherie Pertussis Haemophilus influenzae Typ b Poliomyelitis Hepatitis B Pneumokokken Meningokokken Masern, Mumps, Röteln (MMR) Varizellen Influenza Humane Papillomviren Empfehlungen der Ständigen Impfkommission (STIKO); Robert Koch Institut (RKI); Epidemiologisches Bulletin;
28 Welchen Anforderungen muss ein Impfstoffe genügen? Zur Immunisierung gegen extrazelluläre Antigene müssen T-Helfer-Zellen aktiviert werden, die B-Zellen zur Antikörperproduktion stimulieren. Zur Immunisierung gegen intrazelluläre Antigene müssen zytotoxische T-Zellen aktiviert werden.
29 Welchen Anforderungen muss ein Impfstoffe genügen? Zum Schutz vor Toxinen (und manchen intrazellulären Erregern) müssen bereits zu Beginn der Erkrankung Antikörper vorliegen, um eine wirksame Abwehr zu ermöglichen. Gewünscht ist ein besonderer Schutz an der Eintrittsstelle des Pathogens (oft: Schleimhäute Aktivierung von IgA- Antikörpern).
30 Welchen Anforderungen muss ein Impfstoffe genügen? T-Zellen und Antikörper müssen sich gegen die richtigen Erkennungsstellen richten. Sicherheit (geringe Nebenwirkungen), Erzeugung langlebiger Gedächtniszellen, Impfschutz bei einem hohen Prozentsatz der Geimpften, günstiger Preis.
31 Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 1) Konjugatimpfstoffe erleichtern die Kooperation zwischen B- und T-Zellen 2) Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von Impfstoffen 3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen 4) Synthetische Peptide können eine schützende Immunantwort hervorrufen 5) Applikationsweg der Impfung kann für die Wirkung entscheidend sein 6) Neue Strategien: DNA Vakzination
32 Konjugatimpfstoffe: erleichtern die Kooperation zwischen B- und T-Zellen
33 Marginal-Zonen B- Zellen findet man nur in der Milz. Sie werden T-Zell unabhängig vor allem von Kapselpolysacchariden aktiviert. Bei Neugeborenen und Kindern bis zum 2. Lebensjahr sind sie nur in niedrigen Zahlen vorhanden. Klouvenberg et al Clin Dev Immunol
34 Mit der Konjugation der Kapselpolysaccharide umgeht man die Schwäche von Neugeborenen und Kleinkindern, auf die Polysaccharide zu reagieren, indem man das Polysaccharid an eine Protein, z.b. ein Bakterientoxin (oder wie bei der Meningokokken B Impfung an Vesikeln) koppelt und so eine Thymus-abhängige Immunantwort auslöst. Klouvenberg et al Clin Dev Immunol
35 Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von Impfstoffen
36 Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 2) Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von Impfstoffen: Aluminiumsalze (polyvalente Bindung an Proteine) Pertussistoxin Zellwandbestandteile von Mycobakterien Gabe von Cytokinen (IL-12, verstärkt IgG-Produktion)
37 Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen
38 Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen Risiko: Rückmutation, immunschwache Patienten Heute: gezielte Veränderung durch Gentechnologie
39 Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen Heute: gezielte Veränderung durch Gentechnologie (Anwendung auch im Fall von Bakterien)
40 Applikationsweg der Impfung kann für die Wirkung entscheidend sein
41 Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 5) Der Applikationsweg bei der Impfung kann für die Wirkung entscheidend sein subkutan/i.m. oral
42 Neue Strategien: z.b. DNA Vakzination
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