Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte

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1 Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte Nicole Ungerer Heidelberg, August 2005

2 Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte Nicole Ungerer Heidelberg, August 2005

3 Diplomarbeit im Fachbereich Biologie an der Fakultät für Biowissenschaften der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte Vorgelegt von Nicole Ungerer Heidelberg, August 2005

4 Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Zoologie der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg in der Zeit vom 7. Dezember 2004 bis 7. August 2005 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan Frings und Dr. Frank Möhrlen angefertigt. Referent: Prof. Dr. Stephan Frings Korreferent: PD Dr. Harald Herrmann-Lerdon Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Heidelberg, den 07. August 2005 Nicole Ungerer

5 Danksagung Diese Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Physiologie am Institut für Zoologie der Universität Heidelberg angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich bei allen für die freundschaftliche Atmosphäre innerhalb der Arbeitsgruppe bedanken, die sehr zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen hat. Mein besonderer Dank gilt: Prof. Dr. Stephan Frings für die Überlassung des Themas und für das große Interesse an dieser Arbeit Priv.-Doz. Dr. Harald Herrmann-Lerdon (DKFZ, Heidelberg) für die Übernahme des Korreferats Dr. Frank Möhrlen für die tadellose Betreuung und Beratung bei der Durchführung biochemischer Experimente Dipl.-Biol. Ulrich Mayer für die gute Zusammenarbeit und seine Diskussionsbereitschaft Dipl.-Biol. Daniel Klimmeck für viele kreative Ideen und Korrekturlesearbeiten Dr. Uwe Warnken (DKFZ, Heidelberg) für die Durchführung der ESI-Massenspektrometrie und die große Hilfsbereitschaft Dr. Tore Kempf (DKFZ, Heidelberg) für die praktische Hilfestellung beim Protein-Verdau und für viele nützliche Ratschläge Dr. Martina Schnölzer (DKFZ, Heidelberg) für das große Interesse an diesem Projekt Priv.-Doz. Dr. Ingrid Boekhoff für ihre nützlichen Tipps bei der Cilien-Präparation Meinem Lebensgefährten Thomas und meinen Kindern Sebastian und Valerian für ihre große Geduld und ihr humorvolles Wesen.

6 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis i Abkürzungsverzeichnis...I 1 Einleitung Aufbau des olfaktorischen Epithels Die olfaktorische Transduktionskaskade Charakterisierung von Proteinen der Signaltransduktion Protein-Analytik Trennung von Membranproteinen durch Gelelektrophorese Massenspektrometrie Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-Analytik Massen-Analyse und Strategien der Protein-Identifizierung Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToF Ziel dieser Arbeit Material und Methoden Chemikalien und Material Lösungen Lösungen für die Präparation Lösungen für die Cilien-Präparation Lösungen für die Protein-Präparation aus Gesamtepithel Verwendete Protease-Inhibitoren Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-Methode Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase Lösungen für die SDS PAGE Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE Lösungen für die MS-kompatible Silberfärbung Lösungen für die colloidale Coomassie-Färbung Lösungen für die Western Blot-Analyse Lösungen für den tryptischen Verdau der Proteine Größenstandards und Antikörper Größenstandards für die Gelelektrophorese i

7 Inhaltsverzeichnis Größenstandard für die SDS-PAGE Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGE Antikörper für die Western Blot-Analyse Primäre Antikörper Sekundäre Antikörper Tiere Cilien-Präparation aus olfaktorischem Epithel Präparation und Isolierung des Gesamtepithels Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock Methode Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999) PNGaseF-und Benzonase-Behandlung Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz-Methode Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970) Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (verändert nach Navarre et al, 2002) Vorbereitung der Gele Dimension: CTAB-PAGE Dimension: SDS-PAGE Färbung der Proteine im Gel Reversible MS-kompatible Silberfärbung Colloidale Coomassie-Färbung Western Blot-Analyse Transfer und Immobilisierung von Proteinen Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase- Aktivität Massenspektrometrie Ausschneiden der Proteine Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen ( im-gel Verdau ) Nano-LC und interne Kalibrierung Extraktion der Proben ii

8 Inhaltsverzeichnis 3 Ergebnisse Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer Membranen Qualitative Analyse der Präparation Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGE Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-Analyse Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-Kanals Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III) Western Blot-Analyse der α-untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (G α olf ) Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-Analyse Etablierung eines geeigneten gelelektrophoretischen Trennverfahrens Trennung ciliärer Proteine durch 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender colloidal Coomassie-Färbung Qualitätskontrolle der Trennmethodik durch Nachweis cilien-spezifischer Markerproteine Western Blot-Analyse der CNG-A2- und CNG-A4-Untereinheit Western Blot-Analyse der AC III und von G α olf Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung der Proteine Korrelation der MS/ MS-Daten mit den Peptidsequenzen aus Datenbanken Tabellarische Auflistung der Resultate Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis A Anhang iii

9 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abkürzung α AC III AMP API ATP APS BAC CaBP camp CHAPS cm CNG CTAB D Da DTT ECL EDTA EGTA ER ESI ev Fa FAB FAD G αolf Glu gt GTP Erklärung anti- Adenylatcyclase Typ III Adenosin-5'-monophosphat atmospheric pressure ionization Adenosin-5'-Triphosphat Ammoniumpersulfat Benzyldimethylhexadecyl-ammonium chlorid calcium binding protein zyklisches AMP 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat Zentimeter cyclic nucleotide gated channel Cetidyltrimethylammoniumbromid dimensional Dalton Dithiothreithol enhanced chemiluminescence Ethylendinitrilotetraessigsäure Ethylenglycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure Endoplasmatisches reticulum electrospray ionization Elektronenvolt Firma fast atom bombardment Flavinadenindinucleotid α-untereinheit des olfaktorisches G-Protein Glutamat goat Guanosin-5'-Triphosphat I

10 Abkürzungsverzeichnis h Stunde HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethan-Sulfonsäure HPLC High Pressure Liquid Chromatography HRP horseradish-peroxidase IEF isoelektrische Fokussierung IgG Immunglobulin G InsP 3 Inositol 1,4,5-trisphosphat IP isoelektrischer Punkt kda Kilodalton khz Kilohertz kv Kilovolt LC Liquid Chromatography LP Lamina propria M Molar ma Milliampère MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MHz Megahertz ml Milliliter mm Millimeter mm milli-molar M r ms MS relative Molekülmasse milli-sekunde Massenspektrometrie m/ z Masse über Ladung nl Nanoliter OD Optische Dichte OE Olfaktorisches Epithel ORN Olfaktorische Rezeptor-Neurone p probability p.a pro analysi PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS phosphate buffered saline PHB Prohibitin PI isoelektrischer Punkt II

11 Abkürzungsverzeichnis PMF Peptidmassen-Fingerprint PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PLC-β2 Phospholipase C-β2 PVDF Polyvinylidenfluorid Q Quadrupol rb rabbit rpm rounds per minute rt rat SDS Sodium-Dodecylsulfat SH- Sulfhydryl- ToF Time of flight Tris 2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol TRPC transient receptor potential channel u Unit UDP Uridin-Diphosphat µg Microgramm µl Microliter µm Micrometer v/ v volume per volume w/ v weight per volume III

12 1 Einleitung 1 Einleitung Membranproteine verleihen den Membranen von Zellen ihre charakteristischen Eigenschaften und gestatten den Zellen eine gewisse Dynamik. Sie ermöglichen den Transport von Substanzen über die Membran, wirken katalytisch, z.b. bei der ATP-Synthese, oder haben strukturelle Funktionen, indem sie das Cytoskelett der Zelle mit der extrazellulären Matrix oder mit benachbarten Zellen verknüpfen. Als Rezeptoren dienen sie der Weitergabe von Signalen aus der Umgebung in die Zelle. In Riechsinneszellen verwandeln Membranproteine chemische Signale in elektrische Signale, ein Vorgang, den man als chemoelektrische Transduktion bezeichnet. 1.1 Aufbau des olfaktorischen Epithels Das Riechepithel der Landwirbeltiere liegt als Verbund einzelner Zellschichten in der Nasenhöhle. Es besteht aus Riechsinneszellen (Riechzellen, olfaktorische Rezeptor-Neurone, ORN), Stützzellen, Basalzellen und in geringerem Umfang aus Phospholipase C-β2 positiven Zellen (PLC-β2-Zellen; Anholt, 1993; Elsässer et al., 2005). Seine Oberfläche wird von einer dünnen wässrigen Schleimschicht, dem Mukus, feucht gehalten und geschützt. Abb. 1.1 Schematische Darstellung des olfaktorischen Epithels. OE: Olfaktorisches Epithel; LP: Lamina propria; C: Cilien der Riechsinneszellen; MV: Mikrovilli der Stützzellen und PLC-β2 positiven Zellen; SZ: Stützzellen; RZ: Riechsinneszellen; BZ: Basalzellen; BD: Bowman-Drüsen (verändert nach Anholt, 1993). 1

13 1 Einleitung Der Mukus wird von unterhalb des Epithels liegenden Drüsenzellen, den Bowman-Drüsen, sezerniert. Er enthält die für den Riechvorgang notwendigen Elektrolyte und hydrophile, olfaktorische Bindeproteine (Pelosi, 1994), die die Diffusion der überwiegend hydrophoben Duftmoleküle zu den Riechsinneszellen erleichtern (Ache und Restrepo, 2000). Riechzellen sind primäre, bipolare Neurone. Vom Zellkörper ausgehend entsenden sie einen Dendriten zur Oberfläche des olfaktorischen Epithels. Die Axone der Riechzellen münden gebündelt im Riechkolben (Bulbus olfactorius), der ersten Station zentralnervöser Verarbeitung. Jeder Dendrit ist an seinem apikalen Ende knopfartig erweitert und trägt Cilien (Menco, 1983), eine Struktur, die man als dendritischen Knopf bezeichnet. Die Cilien der Säuger besitzen eine Länge von etwa 50µm (Finger et al., 2000). Ihre Membranen sind die Träger der Duftstoff-Rezeptoren und bilden im Mukus eine große chemosensorische Fläche (Menco, 1980; Buck und Axel, 1991). Abb. 1.2 Isolierte Riechzelle aus Rana pipiens. Differential- Interferenz Kontrastbild 1:100; (S.J.Kleene, R.C. Gesteland, 1981). Die Lebensdauer von Riechzellen ist auf etwa 4 Wochen begrenzt (Breipohl et al., 1986; Farbman, 1990). Basalzellen, die unterhalb der Stützzellen liegen, dienen als Stammzellen, aus denen zeitlebens neue Riechzellen hervorgehen (Breipohl et al, 1986; Carr und Farbman, 1993). Olfaktorische Neurone liefern somit ein Beispiel für die adulte Neurogenese von Stammzellen, ein interessantes, aber noch wenig erforschtes Gebiet. Die palisadenartig angeordneten Stützzellen halten die Neurone in einer stabilen Position und begrenzen das Riechepithel zur Nasenhöhle hin. Die lateralen Membranen der am apikalen Pol gelegenen Mikrovilli sind durch tight junctions mit den Membranen der Cilienknöpfe verknüpft und verhindern so eine Durchmischung des Mukus mit der interstitiellen Flüssigkeit. Stützzellen besitzen ähnliche Eigenschaften wie die Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS). Sie phagozytieren abgestorbene olfaktorische Neurone, puffern das extrazelluläre Milieu (Trotier, 1998; Getchell und Mellert, 1991; Getchell und Getchell, 1982) und besitzen elektrische Eigenschaften, messbar als Ionenstrom über der Membran (Vogalis et al., 2004). Bei den PLC-β2-Zellen handelt es sich vermutlich um einen zweiten Typ chemosensorischer Zellen, dessen Existenz und Beteiligung am olfaktorischen Prozess bereits 1975 durch F. Jourdan postuliert wurde. Morphologisch ähneln diese Zellen, die zu etwa 5% zum 2

14 1 Einleitung Riechepithel beitragen, mehr den Stützzellen. Möglicherweise handelt es sich aber um sekundäre bipolare Neurone (Elsässer et al., 2005), deren Axone wahrscheinlich über afferente Neurone mit dem Gehirn in Verbindung stehen. Die PLC-β2-Zellen münden an ihrem anterioren Ende in einem Mikrovilli-Saum mit Rezeptoren für Geruchsstoffe, die einen zum kanonischen Signalweg der Riechzellen alternativen Mechanismus in Gang setzen (Sklar et al., 1986; Boekhoff et al., 1990; Ronnett et al., 1993; Elsässer et al., 2005). 1.2 Die olfaktorische Transduktionskaskade Die olfaktorische Transduktionskaskade (Abb. 1.3) beginnt, wenn Geruchsstoffe aus der Atemluft an die Duftstoff-Rezeptoren der Cilienmembranen binden (Buck und Axel, 1991; Breer et al., 1994; Zufall et al., 1994; Freitag et al., 1998; Schild und Restrepo, 1998). Bei Säugern repräsentieren die Duftstoff-Rezeptoren mit etwa 1000 Vertretern die größte Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Firestein, 2001). Die nach Aktivierung des olfaktorischen G-Proteins (G olf ; Jones und Reed, 1989) dissoziierte α-untereinheit stimuliert eine membranständige Typ III-Adenylatzyklase (AC III; Pace et al., 1985; Pfeuffer et al., 1989; Bakalyar und Reed, 1990). Diese verstärkt das Signal, indem sie die Produktion von cyclischem AMP (camp) aus ATP katalysiert. Durch den schnellen Anstieg der intrazellulären camp-konzentration (Sklar et al., 1986; Breer et al., 1990; Lowe und Gold, 1993) öffnen cyclisch-nukleotid gesteuerte Kationenkanäle (CNG-Kanäle) in der Plasmamembran (Nakamura und Gold, 1987; Firestein et al., 1991; Frings et al., 1992) und leiten neben Natrium-Ionen verstärkt Calcium-Ionen in das ciliäre Lumen (Dzeja et al., 1999). Die höhere Leitfähigkeit des CNG-Kanals spielt eine untergeordnete Rolle bei der Depolarisierung der Membran, entscheidender ist der resultierende Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration [Ca 2+ ] i. Im mikromolaren Bereich bewirkt dieser die Öffnung Ca 2+ - aktivierter Chlorid-Kanäle (Kleene und Gestland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi und Yau, 1993; Hallani et al., 1998) und den Ausstrom von Chlorid-Ionen. In isolierten ORNs trägt dieser Auswärtsstrom bis zu 80% des Rezeptor-Potentials (Lowe und Gold, 1993; Kleene, 1997). Dies ist insofern ungewöhnlich, da Chlorid-Kanäle normalerweise in Nervenzellen durch Einstrom von Cl - inhibitorisch wirken. Die Ursache für den ungewöhnlichen Cl - -Efflux in ORNs liegt in der hohen intrazellulären Cl - -Konzentration im Bereich der Cilien (Reuter et al., 1998). Die Depolarsierung der Cilienmembran durch das Öffnen der CNG-Kanäle wird also zusätzlich durch den Ausstrom von Chlorid verstärkt und führt schließlich zur Auslösung von Aktionspotentialen (Kawai et al., 1997; Duchamp-Viret et al., 1999). 3

15 1 Einleitung Abb. 1.3 Schematische Darstellung der Signaltransduktion in olfaktorischen Rezeptor-Neuronen der Maus. (R): G-Protein gekoppelter Riechrezeptor; (G olf ): olfaktorisches G-Protein; (CaMK): CaM-Kinase II; (AC): Adenylatzyklase Typ III; (A2, A4, B1b): Kanalproteine des CNG-Kanals; (grün): Ca 2+ -gesteuerter Cl - -Kanal; (PDE): Phosphodiesterase; (grüne Pfeile): excitatorische Wege; (rote Pfeile): inhibitorische Wege (siehe Text); (NKCC1): Chloridionen-Transporter; (NCX): Ca 2+ /Na + -Antiporter; (siehe Text; verändert nach: Frings, 2001). Bei der Abschaltung des Signals erfüllt Ca 2+ erneut mehrere Funktionen: Im Komplex mit Calmodulin inhibiert Ca 2+ die Signalkaskade durch negative Rückkopplung, indem es den Abbau von camp durch die Aktivierung der Ca 2+ / Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase (PDE) stimuliert (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995). Zusätzlich führt die Aktivierung der CaM-Kinase II zur Phosphorylierung der Adenylatzyklase, die dadurch inaktiviert wird (Wayman et al., 1995; Wei et al., 1998). Ca 2+ / Calmodulin bindet außerdem mit hoher Affinität an Calmodulin-Bindestellen der CNG-Kanäle, deren Empfindlichkeit für camp dadurch um ein Vielfaches reduziert wird (Chen und Yau, 1994; Liu et al., 1994; Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004). Überschüssiges Ca 2+ wird durch Na + / Ca 2+ -Austauscher entfernt. Das Zusammenwirken dieser Mechanismen bewirkt zunächst eine Adaption der Riechzelle, bis anschließend das Ruhepotential wiederhergestellt ist. In dem zur olfaktorischen Signaltransduktion der Cilien alternativen Mechanismus der PLC-β2-Zellen wird kein Anstieg der intrazellulären camp-konzentration beobachtet (Sklar et al., 1986). Stattdessen steigt die Konzentration an Inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP 3 ) stark 4

16 1 Einleitung an (Restrepo et al., 1990; Fadool und Ache, 1992; Schild et al., 1995; Bruch, 1996; Kashiwayanagi et al., 1996; Kaur et al., 2001; Spehr et al., 2002). Es konnten verschiedene Proteine des InsP 3 -vermittelten Signalwegs in den Mikrovilli-tragenden Zellen innerhalb der Stützzellschicht kolokalisiert werden. Dazu gehören die Phospholipase C (PLC-β2), der InsP 3 -Rezeptor Typ III (InsP 3 R-III) und ein TRP-Kanal (TRPC6, transient receptor potential channel 6). Der Anstieg von [Ca 2+ ] i nach Bindung von Duftstoffen an die Rezeptoren in den Mikrovilli-Membranen wurde durch Ca 2+ -Imaging gezeigt. Es ist bisher noch nicht geklärt, ob bestimmte Duftstoffe nur durch diesen Signalweg rezipiert werden oder ob diese so genannten PLC-β2-Zellen modulatorisch wirken (Elsässer et al., 2005). 1.3 Charakterisierung von Proteinen der Signaltransduktion Molekulare Details und funktionelle Zusammenhänge, die in der Vergangenheit zum Verständnis zellphysiologischer Abläufe beim Riechvorgang beigetragen haben, stammen hauptsächlich aus elektrophysiologischen und molekularbiologischen Untersuchungen. Die Entdeckung, dass Geruchsstoffe camp-vermittelte Signalwege in Gang setzen (Pace et al., 1985), lenkte die Aufmerksamkeit auf das olfaktorische System. Homologe Sequenzen zu den molekularen Komponenten dieses Transduktionsweges waren für die Durchmusterung von cdna-banken längst verfügbar. G olf, AC III und die CNG A2-Untereinheit des CNG-Kanals konnten mit dieser Strategie erfolgreich kloniert werden (Jones und Reed, 1989; Bakalyar und Reed, 1990; Dhallan et al., 1990). Analog wurden 1991 die Gene der Geruchsrezeptoren durch Linda Buck und Richard Axel kloniert, wofür beide 2004 mit dem Nobel-Preis ausgezeichnet wurden. Es scheint, als seien die Hauptkomponenten der olfaktorischen Transduktionskaskade identifiziert und durch Anwendung der Patch-Clamp-Technik (Hamill et al., 1981) an isolierten ORNs konnten bereits viele Eigenschaften der beteiligten Kanalproteine studiert werden. Eine Reihe ungeklärter Fragen bleibt dennoch bestehen und Erkenntnisse werfen erneut Fragen auf. Zum Beispiel ist es auf Grund fehlender Homologien noch nicht gelungen, eine Aussage über die molekulare Struktur des Ca 2+ -gesteuerten Cl - -Kanals zu treffen (Frings, 1999; Eggermont, 2003). Auch die räumliche Anordnung aller Interaktionspartner entlang der Cilienmembran ist nur ansatzweise geklärt (Reisert et al., 2003). Regulatorische Prozesse und die beteiligten Proteine, die bei der Adaptation eine Rolle spielen, sind ebenfalls nur teilweise bekannt. Über die Beteiligung alternativer Transduktionsmechanismen am Riechprozess kann bisher nur auf Grund lückenhafter Identifikation vorhandener Proteine gemutmaßt werden (Boekhoff et al., 1990; Steinlen et al., 1990; Breer und Boekhoff, 1991; Fülle et al., 1995; 5

17 1 Einleitung Schild et al., 1995; Leinders-Zufall et al., 1996; Juilfs et al., 1997; Gold, 1999; Lischka et al., 1999; Meyer et al., 2000; Elsässer et al., 2005; eine Übersicht gibt Frings, 2001). Die Durchführung einer umfassenden Proteom-Studie, die auch die Identifizierung unbekannter Proteine ermöglicht, kann viel dazu beitragen, fehlende Glieder der Signaltransduktionskette aufzuspüren und ein detaillierteres Bild aller beteiligten Prozesse zu entwerfen. 1.4 Protein-Analytik Die massenspektrometrische Identifizierung (MS) von Proteinen, die zuvor durch ein- oder zweidimensionale Gelelektrophorese getrennt wurden, ist mittlerweile eine etablierte Vorgehensweise in Proteom-Studien. Dabei werden die Proteine zunächst im Gel proteolytisch gespalten und die daraus eluierten Peptide anschließend massenspektrometrisch analysiert. Abbildung 1.4 zeigt im Überblick die unterschiedlichen MS-Strategien, die zur Identifizierung und Charakterisierung der Proteine eingesetzt werden. 6

18 1 Einleitung Abb. 1.4 Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Proteinidentifizierung (Erläuterungen im Text). Analyse-Zeiten konnten im Vergleich zur davor üblicherweise durchgeführten Edman- Sequenzierung (Edman, 1967), bei der Proteine schrittweise durch Modifikation und Abspaltung der N-terminalen Aminosäure abgebaut und die einzelnen Aminosäuren schließlich chromatographisch analysiert werden, erheblich verkürzt werden Trennung von Membranproteinen durch Gelelektrophorese Aufgrund der besseren Auflösung sind zweidimensionale Verfahren bei der gelelektrophoretischen Auftrennung komplexer Proteingemische zu bevorzugen. Die klassische Methode der isoelektrischen Fokussierung (IEF), bei der Proteine in der ersten Dimension entlang eines ph-gradienten bis zur Stelle ihres isoelektrischen Punktes (IP) wandern (O Farrell, 1975), ist jedoch zur Analyse von Membranproteinen meistens nicht geeignet (Hartinger et al., 1996; Santoni et al., 2000; Navarre et al., 2002; Rais et al., 2004). Ursache dafür ist, dass viele Membranproteine aufgrund der Hydrophobizität ihrer transmembranen Regionen nur schwer löslich sind und deshalb insbesondere bei ihrem IP präzipitieren. Eine Möglichkeit, Membranproteine dennoch quantitativ im Gel darzustellen, eröffnet sich durch die Wahl geeigneter Detergenzien. Im denaturierenden System hat sich besonders der Einsatz kationischer Detergenzien in saurem Milieu bewährt (Macfarlane, 1983; Macfarlane, 1989; Hartinger et al., 1996; Navarre et al., 2002). Auf Grund des sauren ph-wertes (ph 3-4) werden einige lösliche Proteine noch im Probenpuffer gefällt und Membranproteine können neben ihrer verbesserten Löslichkeit angereichert werden. Im nativen System kann die Auftrennung ganzer Proteinkomplexe, inklusive aller Interaktionspartner, durch Einsatz nichtionischer Detergenzien erreicht werden (Hames, 1990). Schägger und Jagow konnten diese Methode auch erfolgreich für die Aufreinigung von Membranprotein-Komplexen etablieren (Schägger und Jagow, 1991; Schägger, 2003). Bei dieser Methode ist zu berücksichtigen, dass der Trennerfolg wesentlich von der Art des Detergenz und dem Detergenz-zu-Protein-Verhältnis abhängt und nicht für alle Komplexe eines Proteingemischs eine Wahl gleichermaßen geeignet ist. 7

19 1 Einleitung Massenspektrometrie Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zur Detektion von Molekülmassen im Hochvakuum. Im Massenspektrometer werden die zu analysierenden Probe-Moleküle durch Ionisierung geladen und in einem Massenanalysator gemäß ihres Quotienten aus Masse zu Ladung aufgetrennt. Der Detektor verstärkt in der Regel das Signal und liefert ein Massenspektrum, das die Massen der unterschiedlichen Ionen abbildet. Abbildung 1.5 zeigt die grundlegenden Funktionseinheiten eines Massenspektrometers. Abb. 1.5 Funktionseinheiten eines Massenspektrometers mit Anwendungsmöglichkeiten (verändert nach Waters, Massachusetts, USA; Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-Analytik J.J. Thomson hat nach seiner Entdeckung des Elekrons, Voraussetzung für die Anwendung der Elektronenstoß-Technik, bereits 1899 den ersten Massenspektrometer entwickelt. Es handelt sich also um ein recht altes Verfahren. Die Analyse von Makromolekülen, zu denen auch die Proteine gehören, gelang allerdings erst ab 1976 nach Einführung massenspektrometrischer Desorptionsmethoden (MacFarlane, Torgerson, 1976), bei denen Analyte schonender durch Beschuss mit beschleunigten Primärteilchen (z.bsp Cäsium-Ionen, Argon, Photonen) ionisiert werden. Vorher standen keine geeigneten Ionisierungstechniken zur Verfügung. Die Chemische- oder Elektronenstoß-Ionisation konnte erfolgreich nur auf Moleküle bis 400Da angewendet werden, Makromoleküle jedoch zerfielen unter diesen Bedingungen. Mit der Einführung der Fast Atom Bombardment-Technik (FAB, Barber, 1981) wurden bei der Ionisation erstmals Matrizes in kristalliner oder schwerflüchtiger flüssiger Form 8

20 1 Einleitung eingesetzt. Die Proben werden mit einer Matrix-Substanz (z. B. Glycerin, 4-Nitrobenzylalkohol) gemischt. Die hohe kinetische Energie beim Beschuss dieser Mischung mit Primärteilchen führt zu einer Kollisionskaskade der Moleküle. Dabei werden Sekundärpartikel erzeugt, die in die Gasphase diffundieren. Unter diesen Sekundärpartikeln befinden sich unter anderem Protonen und die zu analysierenden Probe-Ionen. Die Matrix unterstützt bei diesem Vorgang einerseits die effektive Energieübertragung und stellt die zur Ionisierung notwendigen Protonen zur Verfügung, andererseits absorbiert sie einen Großteil der kinetischen Energie der Primärpartikel und verhindert dadurch die Zersetzung der Probe. Ihren Höhepunkt fand diese Art der schonenden Ionisierungstechnik mit der Etablierung der Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI, Abb. 1.6) 1988 durch Tanaka und gleichzeitig unabhängig durch Karas und Hillenkamp. Abb. 1.6 Schematische Darstellung der MALDI-Technik, bei der die Probemoleküle fest in das Kristallgitter der Matrix integriert werden. Durch die Energie eines gepulsten Lasers werden Matrix- und Probemoleküle in die Gasphase überführt, in der schließlich die Ionisation stattfindet. MALDI bildete zusammen mit der durch Fenn et al eingeführten Electrospray Ionisation (ESI) großer Biomoleküle die Voraussetzung für die Etablierung der Massenspektrometrie als eine der wichtigsten Analyse-Methoden in der Peptid- und Proteinanalytik. Bei der ESI (Abb. 1.7), der zur Zeit mildesten Ionisierungstechnik (Cole, 1997), können Analyte bis 100kDa ionisiert werden. Die sanfte Ionisierung konnte besonders deutlich bei der Detektion nichtkovalenter Wechselwirkungen durch Ganem, 1991 und Katta, 1991 demonstriert werden. Die Methode zeichnet sich durch eine erhöhte Sensitivität aus, da im Gegensatz zu MALDI keine einfach, sondern mehrfach geladenen Ionen erzeugt werden, die 9

21 1 Einleitung leichter analysiert werden können (Westermeier, 2002). Substanzen können auch aus komplexen Gemischen in sehr geringer Konzentration nachgewiesen werden. Bei der Ionisierung befindet sich die gelöste Probe in einer wenige µm dicken Kapillare. Die Ionenbildung erfolgt bei Atmosphärendruck direkt aus der Lösung. Dazu wird zwischen der Spitze der Kapillare und dem Eingang zum Massenanalysator eine Hochspannung von etwa 3,5 kv angelegt. Gelangt die Analyt-Lösung in dieses starke elektrische Feld, dispergiert sie in kleine geladene Tröpfchen, ein Vorgang, der durch einen scherenden Gasstrom aus Stickstoff oder synthetischer Luft, der kontinuierlich aus einer koaxialen Stahlkapillare austritt, zusätzlich unterstützt wird. Ein zweiter wärmender Gasstrom, meist Stickstoff, dient als Trocknungsgas. Um die Spitze der Kapillare beobachtet man einen konusförmig erweiterten Teilchenstrom, eine Erscheinung, die "Taylor cone" bezeichnet wird. Die eigentliche Ionenbildung ist noch nicht vollständig verstanden und beginnt, wenn die geladenen Tröpfchen des Aerosols auf dem Weg zum Massenanalysator durch Verdampfung des Lösemittels zunehmend an Größe verlieren. Dadurch steigt die Ladungsdichte an der Oberfläche. Die abstoßenden Coulomb-Kräfte zwischen gleichnamigen Ladungen bewirken den Zusammenbruch der Oberflächenspannung. Dieser explosionsartige Prozeß führt dazu, dass Ionen austreten. Abb. 1.7 Vereinfachte Darstellung der Ionenbildung durch die Electrospray-Methode (ESI). Die Ionisierung erfolgt bei Atmosphärendruck ("atmospheric pressure ionization", API), die Massenanalyse im Vakuum. Detailierte Beschreibung, der Abläufe: siehe Text Massen-Analyse und Strategien der Protein-Identifizierung Als besonders schnell und weitgehend automatisierbar hat sich der heute häufig gebrauchte "Peptidmassen-Fingerprint" (PMF) herausgestellt (Henzel et al.,1993; Mann et al., 1993; Yates et al., 1993). Nach dem tryptischen Verdau werden die erhaltenen Peptide durch 10

22 1 Einleitung MALDI-MS analysiert. Die experimentell ermittelten Massen werden dann mit den theoretischen Massen tryptischer Fragmente von Proteinen aus Datenbanken verglichen. Allerdings können nur bekannte Proteine mit dieser Methode zuverlässig identifiziert werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass möglichst viele Peptide eines Proteins analysiert werden müssen, um eine genügend hohe Treffsicherheit bei der Datenbank-Recherche zu gewährleisten. Dies setzt voraus, dass die Probe möglichst rein und nicht zu komplex ist, da in einem Gemisch mengenmäßig unterrepräsentierte Proteine hinter den starken Signalen prominenter Proteine verschwinden. MALDI-Ionenquellen sind mehrheitlich an Time of Flight (ToF) Analysatoren (Stephens, 1946) gekoppelt. Die Ionen werden durch Anlegen einer Hochspannung in den Massenanalysator beschleunigt. Die Geschwindigkeit eines Ions bei einer konstanten Beschleunigungsspannung ist umgekehrt proportional zu der Masse des Ions. Die Flugzeit T ergibt sich aus dem einfachen Zusammenhang: 1 m v 2 2 = z e U 2 L T = 2 e U m z L v = T m = Masse v = Geschwindigkeit z = Ionen Ladung e = Elementarladung U = Beschleunigungsspannung L = Flugstrecke Die Ursache für die vergleichsweise geringe Sensitivität bei der ToF-Analyse liegt in der geringen Ladung der Fragmente (vgl ) und in der beschränkten Detektionskapazität aller gleichzeitig eintreffenden Signale. Wie in Abbildung 1.5 bereits angedeutet, werden nicht nur Flugzeit-Analysatoren zur Ionentrennung verwendet. Auch Massenfilter, so genannte Quadrupole (Paul, Steinwedel, 1953) können eingesetzt werden. Ein Quadrupol (Q) besteht aus vier parallelen, zylindrischen Metallstäben (Abb. 1.8a). An den Stäben liegt eine Gleichspannung und eine Wechselspannung im Hochfrequenz-Bereich (3kHz- 300MHz) an, wobei gegenüberliegende Stäbe die gleiche Polarität der Gleichspannung und die gleiche Phase der Wechselspannung besitzen. Ionen gleicher Masse und gleicher Ladung, so genannte resonante Ionen, beschreiben auf der feldfreien z-achse eine komplizierte oszillatorische Flugbahn und passieren die Öffnung der Quadrupollinse. Nichtresonante Ionen dagegen kollidieren mit den Quadrupol-Stäben. Ob ein Ion resonant oder nichtresonant ist, hängt von seiner Masse und von der angelegten Gleich- und Wechselspannung ab. Durch Variation der Wechsel- Spannung können verschiedene Ionen auf die richtige Flugbahn in Richtung Detektor 11

23 1 Einleitung gebracht werden. Je nach Betriebsmodus (Abb. 1.8b) können diese Ionen gleicher oder verschiedener Massen sein. a b Abb. 1.8a Darstellung eines Quadrupol-Massenanalysators mit der Flugbahn eines resonanten und nichtresonanten Ions. Resonante Ionen passieren die Quadrupollinse (blau) und werden detektiert. Abb. 1.8b Betriebsmodi eines Quadrupols: Im mass scanning-modus wird das ganze Ionenspektrum (verschiedenfarbig) dargestellt. Im single mass transmission-modus erreicht nur ein Ionen-Typ (mint) den Detektor. Kombiniert mit ToF-Analysatoren werden Quadrupole zusammen mit ESI-Quellen zur Sequenzierung von Proteinen genutzt. Die Ionenbildung aus der Lösung ( ) ermöglicht zudem eine Vortrennung durch HPLC (High Performance oder High Pressure Liquid Chromatography). Kapitel beschreibt eine besonders effiziente massenspektrometrische Methode, die es ermöglicht, unbekannte Proteine auch in geringen Mengen aus komplexen Gemischen zu identifizieren Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToF Bei der Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Analyse wird die gelöste Probe bei besonders niedrigen Flussraten im Nanoliter-Bereich (20-250nL/ min) der Ionenquelle zugeführt, man spricht deshalb auch von Nanospray-Ionisation (Wilm, Mann, 1996). Durch die verlängerte Messzeit können Probenmengen im µl-bereich analysiert werden. Auch Proteine, die nur in geringen Mengen im Gemisch vertreten sind, werden durch Streckung des Messvolumens in einem ausreichend großen Zeitfenster erfasst. Die Sensitivität der Messung ist im Vergleich zur Peptidmassen-Fingerprint-Methode deutlich erhöht (Emmett, Caprioli, 1994). Die niedrigen Flussraten werden durch das Pumpensystem einer vorgeschalteten HPLC- Anlage gewährleistet (Nano-LC). Zur Vortrennung der Protein-Gemische werden Reverse Phase-Säulen mit apolarem Füllmaterial benutzt. Das Füllmaterial, die so genannte stationäre 12

24 1 Einleitung Phase, besteht üblicherweise aus porösen Silica-Kugeln (Silicagele), die an ihrer Oberfläche aliphatische C18-Ketten tragen und deren Porenweite zur Protein-Aufreinigung idealerweise 30nm beträgt. Das Lösemittel der Probe wird bei chromatographischen Trennverfahren als mobile Phase bezeichnet. Üblich sind Wasser/ Acetonitril-Gradienten mit steigender Hydrophobizität. Zu Beginn werden also apolare Proteine von der stationären Phase zurückgehalten, während polare Proteine in der mobilen Phase verbleiben. Ein Anstieg der Hydrophobizität in der mobilen Phase bewirkt, dass zunehmend hydrophobe Proteine von der Säule eluiert werden, so dass apolare Proteine zuletzt den Massenspektrometer erreichen. Die Sequenzierung von Proteinen kann nur in so genannten Tandem-Massenspektrometern durchgeführt werden. Solche Massenspektrometer besitzen mehrere Analysatoren und eine interponierte Kollisionszelle, die mit einem inerten Stoß-Gas, meist Argon, befüllt ist. Abbildung 1.9 zeigt den Aufbau des Tandem-Massenspektrometers, wie er in dieser Arbeit zur Protein-Identifizierung verwendet wurde. Abb. 1.9 Schematische Darstellung des Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Spektrometers. Die Ionen werden zur Kathode am Eingang des Spektrometers beschleunigt und gelangen in den Massenanalysator Q 0 und dann in Q 1, wo bestimmte Ionen herausgefiltert werden, die dann in der Kollissionszelle Q 2 fragmentiert werden. Die Fragmente werden erneut beschleunigt und treten durch eine Quadrupollinse in den ToF-Analysator ein, der mit einem Reflektor ausgestattet ist und die Ionen vor der Detektion umlenkt (Erläuterung: Text). L/s: Sog-Leistung der Vakuum-Pumpe; (verändert nach Waters, Massachusetts, USA; 13

25 1 Einleitung Die Ionen gelangen aus der ESI-Quelle durch eine Öffnung im Zentrum der Gegenelektrode in den Analysatorteil des Massenspektrometers. Durch Q0, der ausschließlich im mass scanning-modus (Abb 1.8b) arbeitet, werden die Ionen kollisionsfrei auf die richtige Bahn zum eigentlichen Massenfilter Q1 weitergeleitet. Q1 filtert im single mass transmission- Modus Ionen mit einem konstanten Masse zu Ladungs-Quotienten heraus. Nur diese Vorläufer-Ionen ("Precursor") werden zu einem bestimmten Zeitpunkt in die Kollisionszelle beschleunigt, wo sie durch Kollision mit Argon-Atomen in viele verschiedene "Tochter- Ionen" fragmentiert werden (Abb. 1.10). Bei einer Kollisions-Energie von eV dissoziieren die Vorläufer-Ionen vorrangig zwischen Carbonyl-Kohlenstoff und Amid-Stickstoff entlang des Peptidrückgrats und bilden sequenzspezifische Ionenserien (Roepstorff und Fohlman 1984). Abb Mögliche Bruchstellen des Peptid-Rückgrats der Precursor-Ionen; (rot) am häufigsten betroffen, es resultieren Ionen des b-oder y-typs; (a, c, x, z) Ionentypen, die seltener entstehen (verändert nach: Die meisten Ionen sind vom b-oder y-typ. Verbleibt nach der Spaltung die Ladung am N- terminalen Ende des Fragmentions, entsteht ein b-typ Ion. Verbleibt sie am C-Terminus, wird ein y-typ Ion gebildet. Die so gebildeten Fragment-Ionen werden erneut beschleunigt und gelangen in den vertikal zur Kollisionszelle angeordneten ToF-Analysator, wo sie durch ein elektrisches Pulsfeld umgelenkt werden. Da die Ionen nicht auf gleicher Höhe in den Analysator gelangen, werden sie nach halber Flugstrecke von einem Reflektor (Abb. 1.9) gespiegelt, der als Ionensammler dient, so dass Fragmente gleichen Typs von dort aus zur gleichen Zeit in Richtung Detektor aufbrechen und gemäß ihres Masse zu Ladungs-Quotienten auch zur gleichen Zeit dort eintreffen. Durch diese Fokussierung wird die Auflösung des 14

26 1 Einleitung ToF-Analysators deutlich verbessert und dadurch auch die Genauigkeit der Messung, da sogar gleiche Ionen verschiedener Isotope im Spektrum durch einen separaten Peak dargestellt werden. Die Genauigkeit der Messung liegt im Bereich von +/- 0,1 Da. Zur Detektion wird ein Mehrkanal-Detektor verwendet. Beim Auftreffen geladener Teilchen auf die unter Hochspannung stehenden Platten des Detektors werden Elektronenströme erzeugt, die sich lokal fortpflanzen und das Signal verstärken. 1.5 Ziel dieser Arbeit Das Ziel dieser Arbeit ist die Isolierung ciliärer Membranen vom olfaktorischen Gesamtepithel der Ratte und die Etablierung einer gelelektrophoretischen Trennmethode um die dort lokalisierten Membranproteine vollständig und in hoher Auflösung darzustellen. Mit dieser Methode soll es im Anschluss durch MS-Analyse möglich sein, unbekannte Proteine zu identifizieren und dadurch ein verfeinertes Bild aller beteiligten Prozesse der Signaltransduktionskaskade zu entwerfen. 15

27 2 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Chemikalien und Material Die Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, in p.a.-qualität von den Firmen Amersham Biosciences (Freiburg), AppliChem (Darmstadt), Carl Roth GmbH (Karlsruhe), Fluka Chemie GmbH (Buchs, CH), Grüssing (Filsum), J.T. Baker (Deventer, NL), MBI Fermentas GmbH (St. Leon-Rot), Merck KGaA (Darmstadt), Riedel de Haen (Seelze), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg) und Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) bezogen. Zum Ansetzen der Lösungen wurde ausschließlich Wasser aus der Milli-Q UF Plus-Anlage der Fa. Millipore verwendet, für die nano-hplc und Massenspektrometrie Wasser in HPLC- Qualität. Die Gelelektrophorese wurde in den Kammern PerfectBlue TM Vertical Electrophoresis System, Model Twin S und Twin M der Fa. peqlab Biotechnologie GmbH (Erlangen) durchgeführt. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren mit der Blot-Apparatur SV20- SDB der Fa. Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim) auf porablot PVDF-Membranen mit einer Porengröße von 0,2µm der Fa. MACHEREY-NAGEL (Düren). Die Aktivität der Meerrettich-Peroxidase wurde durch ECl TM Plus detektiert und die Filme (Hyperfilm TM ECl TM ) im Hyperprocessor TM Automatic Film Processor, sofern nicht anders angegeben, entwickelt. Das Detektionssystem, die Filme und die Entwickler-Maschine stammen von der Fa. Amersham Biosciences (Freiburg). 16

28 2 Material und Methoden 2.2 Lösungen Lösungen für die Präparation Lösungen für die Cilien-Präparation Stamm-Lösung P 120mM NaCl 5mM KCl 1,6mM K 2 HPO 4 25mM NaHCO 3 7,5mM D-Glucose ph 7,4 Calciumchlorid-Stammlösung 2M CaCl 2 x 2H 2 O Lösung A Protease Inhibitor M (Tab. 2.1): 1/ 100 des Gesamtvolumens in Stamm-Lösung P kurz vor Gebrauch angesetzt Lösung B Saccharose-Lösung 10mM CaCl 2 x 2H 2 O in Lösung A kurz vor Gebrauch angesetzt 45% (w/ v) Saccharose Lösungen für die Protein-Präparation aus Gesamtepithel Puffer A 20mM NaCl 1mM EDTA 0,1mM EGTA 1mM DTT 20mM HEPES ph 7,4 Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2) 1Tablette/ 50ml 0,02% (w/ v) o-phenanthrolin 17

29 2 Material und Methoden Puffer B Puffer C (M) 500mM NaCl 1mM EDTA 0,1mM EGTA 1mM DTT 20mM HEPES ph 7,4 Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2) 1Tablette/ 50ml 0,02% (w/ v) o-phenanthrolin 150mM NaCl 1mM EDTA 0,1mM EGTA 1mM DTT 20mM HEPES ph 7,4 Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2) 1Tablette/ 50ml 0,02% (w/ v) o-phenanthrolin Verwendete Protease-Inhibitoren Die bei den Präparationen verwendeten Lösungen ( und ) enthielten Protease- Inhibitoren um den proteolytischen Abbau von Proteinen durch freiwerdende endogene Proteasen zu verhindern. Bei der Cilienpräparation wurde der EDTA- und EGTA-freie Protease-Inhibitor Mix M (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Tab. 2.1) verwendet um die Chelatierung von Calcium-Ionen auszuschließen. Der Complete Protease Inhibitor Cocktail in Tablettenform stammte von der Fa. Roche Diagnostics (Penzberg). Metalloproteasen wurden zusätzlich durch o-phenanthrolin gehemmt, das bevorzugt bivalente Schwermetall-Ionen (u.a. Zn 2+ ) komplexiert. 18

30 2 Material und Methoden Inhibitor Zielproteasen AEBSF-HCl viele Serin-Proteasen (u.a. Thrombin) Aprotinin viele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase) Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B) E-64 Papain (Cystein-Protease) Leupeptin u.a. Phospholipase D Pepstatin A Aspartat-Proteasen (u.a. Pepsin, Renin) Tab. 2.1 Inhibitoren und Zielproteasen des Protease Inhibitor Mix M (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg). Inhibitor Zielproteasen APMSF-HCl Serin-Proteasen (u.a. Trypsin) Aprotinin viele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase) Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B) 3,4-Dichloroisocumarin viele Serin-Proteasen (u.a. Elastase) E-64 Papain (Cystein-Protease) Leupeptin u.a. PhospholipaseD Pefabloc SC Serin-Proteasen (u.a. Thrombin) Phosphoramidon Thermolysin, Collagenase Tab. 2.2 Inhibitoren und Zielproteasen des Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Penzberg) Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-Methode Tris/ SDS-Lösung 1M Tris/ HCl ph 7,5 1% (w/ v) SDS Färbe-Lösung 0,5% (w/ v) Amidoschwarz B10 45% (v/ v) Methanol 10% (v/ v) Essigsäure Entfärbe-Lösung 90% (v/ v) Methanol 2% (v/ v) Essigsäure Elutions-Lösung 50% (v/ v) Ethanol 25mM NaOH 50µl EDTA 19

31 2.2.3 Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase 2 Material und Methoden PB-Puffer Puffer C 10mM Tris 100µM PMSF 10mM β-mercaptoethanol 3mM MgCl 2 x 6H 2 O ph 8,0 10mM Tris 3mM MgCl 2 x 6H 2 O 2mM EGTA ph 7, Lösungen für die SDS PAGE 5x-Probenpuffer 20x DTT 10% (v/v) Glycerol 2% (w/v) SDS 0,01% (w/v) Bromphenolblau 62,6mM Tris ph6.8 2M DTT Lagerung: -20 C Gebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N - Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1 Sammelgelpuffer 1M Tris/ HCl, ph 6,8 Trenngelpuffer 1M Tris/ HCl, ph 8.8 SDS-Lösung APS-Lösung 10% (w/v) SDS 10% (w/v) Ammoniumperoxodisulfat Gebrauchsfertige 99% Tetramethylendiamin-Lösung (TEMED) 10x Elektrodenpuffer 0,25M Tris 1,92M Glycin 2% (w/v) SDS ph

32 2 Material und Methoden Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE 2x Probenpuffer 6M Harnstoff 0,2% (w/v) CTAB 10% (v/v) Glycerol 75mM DTT 0,05% (w/v) PyroninY kurz vor Gebrauch angesetzt Gebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N - Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1 Stabilisierte, gebrauchsfertige, 2%ige N,N -Methylenbisacrylamid-Stammlösung Sammelgelpuffer 0,3M KH 2 PO 4 ph 4.1 Trenngelpuffer 0,3M KH 2 PO 4 ph 2.1 Ascorbinsäure-Lösung CTAB-Lösung Eisensulfat-Lösung H 2 O 2 -Lösung 1x Elektrodenpuffer (CTAB) 80mM Ascorbinsäure kurz vor Gebrauch angesetzt 250mM CTAB kurz vor Gebrauch angesetzt 25mM Fe(II)SO 4 x 7H 2 O kurz vor Gebrauch angesetzt 0,03% (v/v) Wasserstoffperoxid 150mM Glycin 0,1% (w/v) CTAB 50mM H 3 PO 4 SDS-Lyse-Puffer 1/ 5 des Endvolumens 5x Probenpuffer (2.2.3) 37,5mM DTT 1mM PMSF 18mM Tris, ph 6.8 kurz vor Gebrauch angesetzt 21

33 2 Material und Methoden SDS-PAGE-Lösungen (siehe 2.2.3) Lösungen für die MS-kompatible Silberfärbung Fixier-Lösung 30% (v/v) Ethanol 10% (v/v) Essigsäure Sensitisationslösung 9,9mM K 2 O 6 S 4 0,5M Kaliumacetat 30% (v/v) Ethanol Silbernitrat-Lösung 11,8mM AgNO 3 Entwickler-Lösung 0,22M K 2 CO 3 5µM Na 2 S 2 O 3 x 5H 2 O 0,011% (v/ v) Formaldehyd Stopp-Lösung 0,33M Tris 2% (v/ v) Essigsäure Lösungen für die colloidale Coomassie-Färbung Fixier-Lösung Inkubationslösung 50% (v/v) Methanol 2% (v/v) Essigsäure 34% (v/v) Methanol 2% (v/v) H 3 PO 4 17% (w/v) (NH 4 ) 2 SO 4 Färbe-Lösung 34% (v/v) Methanol 2% (v/v) H 3 PO 4 17% (w/v) (NH 4 ) 2 SO 4 0,066% (w/v) Coomassie G

34 2 Material und Methoden Lösungen für die Western Blot-Analyse Transferpuffer 1x PBS Milchpulver-Blocklösung 25mM Tris 0,19M Glycin 20% (v/v) Methanol ph 8,3-8,4 8,1mM Na 2 HPO 4 x 2H 2 O 1,9mM NaH 2 PO 4 x H 2 O 0,13M NaCl ph 7,4 5% (w/v) Milchpulver in 1x PBS Lagerung: 4-8 C; 0,02% NaN 3 Milchpulver-Verdünnungslösung 1% (w/v) Milchpulver in 1x PBS kurz vor Gebrauch angesetzt Wasch-Puffer 0,1% (v/v) Triton X-100 in 1x PBS ECL-Plus Detektionslösung Lösung A zu Lösung B im Verhältnis 40:1 kurz vor Gebrauch angesetzt, lichtempfindlich Lösungen für den tryptischen Verdau der Proteine Acetonitril/ H 2 O 50% (v/v) Acetonitril Bicarbonat-Puffer 40mM NH 4 HCO 3 DTT Iodacetamid 10mM DTT 55mM Iodacetamid in Bicarbonat-Puffer kurz vor Gebrauch angesetzt, lichtempfindlich 23

35 2 Material und Methoden Trypsin-Stocklösung Trypsin-Gebrauchslösung Lyophilisat + 40µl 1mM HCl 1Woche bei -20 C haltbar 10µl Trypsin-Stocklösung 290µl Bicarbonat-Puffer 2.3 Größenstandards und Antikörper Größenstandards für die Gelelektrophorese Größenstandard für die SDS-PAGE Sowohl für die eindimensionale als auch für die zweite Dimension der zweidimensionalen Gelelektrophorese dienten rekombinante, in E.coli exprimierte Farbstoff-gekoppelte Proteine des PageRulerTM Protein Ladder (ready to use) SM0671 mit Molekulargewichten von ~ bis Da (Dalton) der MBI Fermentas GmbH (St. Leon-Rot). Die Konzentrationen der einzelnen Proteine liegen zwischen 0,1-0,2mg/ ml. Abb. 2.1 SM0671 Für Gele der Größe 5,5 x 8,5cm wurde ein Volumen von 5µl eingesetzt, 7µl bei einer Gelgröße von 11 x 14cm. Die Dicke der Gele in beiden Kammersystemen TwinS und TwinM (2.1) betrug 1,5mm. 24

36 2 Material und Methoden Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGE Für die CTAB-PAGE wurde der High MolecularWeight Marker (HMW-Größenstandard) SDS-6H der Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet. Die Proteine des Lyophilisats wurden in 0,75ml H 2 O gelöst und mit 0,75ml 2x Probenpuffer (2.2.4) versetzt. Die Gesamtkonzentration der Lösung betrug 2mg/ ml. Molekulargewicht (Da) Protein Myosin beta-galactosidase Phosphorylase B Rinderserum Albumin Ovalbumin Carboanhydrase Tab. 2.3 Proteine und Molekulargewichte HMW-Größenstandards SDS-6H. Vor dem Einsatz wurde der Marker 5min bei 70 C im Heizblock erwärmt, gevortext und mit g zentrifugiert. Ein Volumen von 8µl aus dem Überstand pipettiert erwies sich als ideal bei einer Gelgröße von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm. 25

37 2 Material und Methoden Antikörper für die Western Blot-Analyse Die verwendeten Antikörper dienten ausschließlich dem immunologischen Nachweis von Markerproteinen ( Präparationsmarkern ) bei der Western Blot-Analyse (2.10) Primäre Antikörper Name Antigen Größe Spender Isotyp Spezifität Hersteller α- ACIII α-cng A2 α-cng A4 α-g α s/ olf α- Occludin α- Prohibitin C-Terminus Adenylatcyclase III der Ratte C-terminal R CNG- A2 der Ratte C-Terminus CNG- A4 der Ratte C-Terminus α s -UE olfaktorisches G- Protein der Ratte N-Terminus Occludin des Menschen Mitochondriales Gesamtprotein der Ratte 128,9kDa Glykosylierung möglich 76,2kDa Glykosylierung möglich Kaninchen Kaninchen Polyklonale, affinitätsgereinigte IgG Polyklonale, affinitätsgereinigte IgG rt, ms, hm rb, ms, rb 65,6kDa Maus Monoklonal rt 44,2kDa 65kDa Phosphorylierung möglich Kaninchen Ziege Polyklonale, affinitätsgereinigte IgG Polyklonale, affinitätsgereinigte IgG ~30kDa Kaninchen Polyklonale IgG Tab. 2.4 Spezifikation der Erst- Antikörper für die Western Blot-Analyse. rt, ms, hm rt, ms, hm rt, ms, pg, ch, hm Santa Cruz Biotechn. Inc.,Heidelberg Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim California Institute of Technology, Pasadena Santa Cruz Biotechn. Inc.,Heidelberg Santa Cruz Biotechnologies Inc., heidelberg Abcam Limited, Cambridge Sekundäre Antikörper Die Antigen-Antikörper Komplexe wurden mit Zweit-Antikörpern nachgewiesen, die an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt waren. Name Antigen Spender Isotyp Spezifität Hersteller Polyklonale Sigma-Aldrich Kaninchen IgG,gereinigt durch Kaninchen Ziege Chemie GmbH, IgG Ionenaustausch- IgG Steinheim Chromatographie α-rb IgG HRP konjugiert α-gt IgG HRP konjugiert α-ms IgG HRP konjugiert Ziegen IgG Maus IgG Kaninchen Ziege Polyklonale, affinitätsgereinigte IgG Polyklonale, affinitätsgereinigte IgG Ziege IgG Maus IgG Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Tab. 2.4 Spezifikation der Meerrrettich-Peroxidase konjugierten Zweit-Antikörper für die Western Blot- Analyse. 26

38 2 Material und Methoden 2.4 Tiere Für die Präparation des olfaktorischen Epithels wurden 8-12 Wochen alte weibliche Wistar- Ratten (Rattus norvegicus) verwendet. Die Ratten stammten aus dem Zentralen Tierlabor (ZTL) der Universität Heidelberg, wo sie unter standardisierten Bedingungen bei einem künstlichen Tag-Nacht-Rhytmus gehalten werden. Lieferant des ZTL ist die Fa. Charles River Laboratories Inc. (Bad Königshofen). 2.5 Cilien-Präparation aus olfaktorischem Epithel Die in der nachfolgend beschriebenen Methode verwendeten Lösungen und Gefäße wurden stets eisgekühlt oder vor Beginn der Präparation im Kühlraum bereitgestellt Präparation und Isolierung des Gesamtepithels Zur Charakterisierung ciliärer Proteine musste zunächst das Gesamtepithel isoliert werden. Dazu wurden die Ratten in CO 2 getötet und anschließend dekapitiert. Die Köpfe wurden kurz in eiskalter Stamm-Lösung P gekühlt und von Blut befreit. Das Fell wurde mit der Präparier-Schere entfernt. Durch das Hinterhauptsloch wurde entlang der koronalen Naht ein Schnitt vom posterioren Ende nach anterior (Abb. 2.2) bis knapp vor das Stirnbein geführt und die Nase sagittal in der Ebene des Septums aufgebrochen. Abb. 2.2 Schädel der Ratte. Mit der Präparier-Schere wurde ein Schnitt entlang der koronalen Naht geführt. Das Riechepithel liegt scheibchenförmig im Dach der Nasenhöhle und hebt sich auf Grund seiner gelbbraunen Pigmentierung und seiner stapelartigen Anordnung in den Konchen gut 27

39 2 Material und Methoden von seiner Umgebung ab (Abb. 2.3). Die Scheibchen wurden direkt mit einer feinen Pinzette entnommen, in Stamm-Lösung P durch kurzes Eintauchen gewaschen und so von eventuell noch anhaftenden Haaren und Blutresten befreit. Dann wurden sie in ein 8ml Schnappdeckel- Glas (neolab, Heidelberg) mit Lösung A überführt. Abb. 2.3 Sagittalschnitt durch den Kopf der Ratte. Das olfaktorische Epithel (OE) hebt sich mit seiner gelbbräunlichen Pigmentierung deutlich von der Umgebung ab. Rechts davon befinden sich Bulbus olfactorius (BO) und Siebbein (SB). Davor respiratorisches Epithel (RE) Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock Methode Die Decilierung der Riechzellen wurde durch die Calcium-Schock Methode (Gibbons, 1967) erreicht. Der Calcium-Schock ist eine von mehreren Methoden (Sandoz, 1988), die durch mechanischen Stress die Abschnürung ciliärer Membranen verursacht. Es ist unbekannt, ob der Einfluss von Calcium-Ionen den Zusammenbruch der Cilienstruktur direkt durch Depolymerisation der Mikrotubuli bewirkt. Möglich ist auch die Aktivierung spezifischer Proteasen, die durch Hydrolyse Bestandteile des tubulären Systems destabilisieren (Sandoz, 1988). Pro Schnappdeckel-Glas wurden die Epithelien von fünf Ratten in 3ml Lösung A gewaschen. Der Überstand wurde vorsichtig und möglichst vollständig mit einer 5ml Gilson-Pipette abgenommen und das Epithel in 4ml Lösung B, die 10mM Calcium-Ionen enthält, aufgenommen. Die Herstellung von Lösung B gehört zu einem der kritischen Schritte der Präparation: Die Zugabe der Calcium-Stammlösung zu einem Teil von Lösung A sollte sehr langsam und unter heftigem Rühren erfolgen, da sonst schwerlösliches (Ca) 3 (PO 4 ) 2 präzipitiert und freies Ca 2+ nicht mehr für den Calcium-Schock zur Verfügung steht. 28

40 2 Material und Methoden Anschließend wurde 30min bei 4 C und Stufe 4 (IKAMAG RH, Janke und Kunkel KG, Staufen) Rührfisch, Grösse 12 x 5mm (neolab, Heidelberg) gerührt (Abb. 2.4). Abb. 2.4 Calcium-Schock der Olfaktorischen Epithelien unter Rühren im Schnappdeckel-Glas. Danach wurde der gesamte Ansatz in ein 10ml Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen (neolab) überführt und mit 7700g 5min bei 4 C zentrifugiert (Hermle-Kühlzentrifuge, HERMLE- Labortechnik, Wehingen). Der Überstand mit den Cilien wurde in ein 15ml Falcon-Röhrchen überführt und das Pellet erneut in 2ml Lösung B resuspendiert und mit 7700g 5min bei 4 C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem Überstand der vorherigen Zentrifugation vereint. Der letzte Zentrifugationsschritt wurde noch einmal wiederholt, die Gewebepellets wurden bei -20 C gelagert. Die vereinten Überstände wurden in einem 12ml Ultrazentrifugen-Röhrchen (Beckman Coulter GmbH, Krefeld) auf 4ml 45% Saccharose-Lösung geschichtet und mit g 30min bei 4 C ultrazentrifugiert (Beckman L-70 Ultra-Zentrifuge, SW40 Ti-Rotor). Die Cilienbande befindet sich nach der Ultrazentrifugation sichtbar als dichter, dunkler Nebel auf der Saccharose des Stufengradienten. Abb. 2.5 Die dunkle Cilienbande befindet sich auf der Saccharose des Stufengradienten. 29

41 2 Material und Methoden Die Cilienbande wurde mit der 1ml Gilson-Pipette abgenommen und im UZ-Röhrchen mit dem zehnfachen Volumen Lösung B verdünnt und erneut 30min bei g und 4 C ultrazentrifugiert. Das als weisser Fleck mit gelblichem Ring deutlich sichtbare Cilienpellet wurde bei -20 C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Die Grösse des Pellets und somit die Ausbeute an Protein richtet sich nach dem Alter der Ratten. Ratten im Alter von acht Wochen erzielen nur 50% der Proteinausbeute 12-wöchiger Ratten Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999) Die Isolation des Gesamtepithels entspricht der in beschriebenen Vorgehensweise. Die Riechepithelien von 2 Ratten wurden in einem 15ml Falcon-Röhrchen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Nach dem Auftauen wurde das Gewebe in einen 20ml Glashomogenisator überführt und in 10ml Puffer A (hypoton) homogenisiert. Anschließend wurde mit 300g 5min bei 4 C in der Hermle-Kühlzentrifuge (2.5.2) zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 10ml UZ-Röhrchen überführt und 30min bei g (Beckman L-70 Ultrazentrifuge, SW40 Ti- Rotor) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10ml Puffer A resuspendiert und erneut 30min bei g (SW40 Ti) zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 10ml Puffer B (hyperton) resuspendiert und nochmals unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Das Protein-Pellet aus Gesamtgewebe wurde in 100µl Puffer C(M) aufgenommen. 2.6 PNGaseF- und Benzonase-Behandlung Zur Entfernung von N-Glykosiden wurde PNGaseF (500Units/ml, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) verwendet. Benzonase (25000Units/ml, Merck KgaA, Darmstadt) ist eine rekombinant in E.coli exprimierte Endonuklease aus Serratia marcescens, die alle Formen von Nukleinsäuren abbaut. Behandelt wurden die Cilien-Präparationen, deren Proteine für Gele mit anschließender Massenspektrometrie (2.10) verwendet wurden. Je nach Größe des Cilienpellets wurde dieses mit Hilfe des Ultraschallbades (Transsonic 460, neolab, Heidelberg) in einem Volumen von µl PB-Puffer resuspendiert und mit jeweils 4µl PNGaseF und 4µl Benzonase versetzt, gemischt und 30min bei 37 C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz in ein UZ-Röhrchen überführt, mit Puffer C auf 10ml aufgefüllt und 30min bei g und 4 C pelletiert. Das Pellet wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20 C gelagert. 30

42 2 Material und Methoden 2.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz- Methode Die Amidoschwarz-Methode, auch Schaffner/ Weissman-Methode (Schaffner und Weissman, 1973) genannt, zeichnet sich gegenüber gängigen Methoden der Protein-Bestimmung dadurch aus, dass gelöstes Protein durch Zugabe von Säure ausgefällt und das Präzipitat mit dem Farbstoff Amidoschwarz angefärbt wird. Dies hat den Vorteil, dass Störsubstanzen, wie Detergenzien oder Lipide, durch die Säurefällung entfernt werden und macht die Methode in zweierlei Hinsicht besonders für die Bestimmung der Konzentration von Membranproteinen wertvoll: Zum einen enthalten Lösungen von Membranproteinen stets Lipide der Herkunftsmembranen. Da diese außerdem auf Grund ihrer oftmals ausgedehnten hydrophoben Bereiche nur schwerlöslich sind, ist der Einsatz von Detergenzien unverzichtbar um Membranproteine möglichst quantitativ in Lösung zu bringen. Als Proteinstandard wurde 1mg/ ml BSA in 0,02M Na 3 PO 4 -Puffer verwendet. Die für die Gelelektrophorese (2.8) in Puffer C (2.2.3) aufgenommenen Proben und die Standards (1-10µg) wurden mit H 2 O auf ein Endvolumen von 200µl gebracht, mit 20µl 10% (w/ v) SDS versetzt und gründlich gemischt um die Proteine zu solubilisieren. Anschließend wurden 30µl 1M Tris/ HCl mit 1% SDS zugegeben. Nach dem Mischen wurden die Proteine durch Zugabe von je 60µl 100% (w/ v) TCA gefällt. Dazu wurden die Proben 30min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einen Membranfilter (Nitrocellulose, Porengröße 0,45µm, Millipore, Schwalbach) aufgetragen, der zuvor mit 3ml 6% (w/ v) TCA gewaschen worden war. Der Membranfilter befindet sich dazu auf einer speziellen Filterfritte (Millipore), die über einen Gummikonus auf einer Saugflasche sitzt, so dass während des Auftragens mit Hilfe des Vakuums eine zu starke Dispersion der Probe vermieden werden kann. Der Filter wurde anschließend 3min in eine 9cm Petrischale mit Färbe-Lösung gelegt, danach kurz mit H 2 O gespült und schließlich dreimal je 2min mit Entfärbe-Lösung behandelt. Der Filter wurde an der Luft getrocknet, die gefärbten Bereiche ausgeschnitten und in ein 2ml Eppendorf-Gefäß, das 1ml Elutions-Lösung enthält, gegeben. Anschließend wurde 20min bei Raumtemperatur zur Elution der gefärbten Proben rotiert. Dazu wurde ein mechanischer Rührer, wie er in der präparativen Chemie verwendet wird, vertikal an einem Stativ angebracht. An dessen Drehrührer wurde ein Ständer für Eppendorf-Gefäße befestigt. Nach der Elution wurde die optische Dichte bei λ=630nm (OD 630 ) gemessen. Im linearen Bereich der Eichkurve (1-10µg) entspricht eine OD 630 von 0,03 etwa 1µg Protein. 31

43 2.8 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese 2 Material und Methoden Proteine wurden durch ein- und zweidimensionale Gelektrophorese getrennt. Je nach Größe des Pellets wurden die Cilienmembranen vor der Elektrophorese in µl Puffer C (2.2.3) aufgenommen Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970) Zur Identifikation ciliärer Markerproteine, zur Durchführung der Negativkontrollen (Ausschluss von Proteinen des decilierten olfaktorischen Restepithels) und zur Darstellung verschiedener Bandenmuster wurde in modifizierter Form das klassische eindimensionale System nach Laemmli verwendet. Anstelle von β-meraptoethanol als Reduktionsmittel im 5x Probenpuffer wurde 2M Dithiotreithol (2M) eingesetzt. Als Kammersystem diente das Modell Twin S (2.1) mit einer Gelgröße von 5,5 x 8,5cm und einer Geldicke von 1,5mm. Es wurden 10%ige Trenn- und 3,8%ige Sammelgele verwendet. Bei der Probenvorbereitung wurde das entsprechende Volumen von 10µg Probe mit 1/ 5 des Endvolumens 5x Probenpuffer und 1/ 20 des Endvolumens 20x DTT versetzt. Nach dem Mischen wurden die Proben 10min bei 90 C im Heizblock erhitzt, anschließend gründlich gevortext und 1min bei g in der Eppendorf-Tischzentrifuge (Modell 5415D, Eppendorf AG, Wesseling-Berzdorf) zentrifugiert. Die Proben wurden aus dem Überstand pipettiert. Die bei der Präparation der Cilien nach der sequentiellen Zentrifugation anfallenden Gewebepellets wurden in 0,5ml Puffer C auf Eis homogenisiert, bei g und 4 C 5min in der Hermle-Kühlzentrifuge abzentrifugiert und das entsprechende Volumen des proteinhaltigen Überstands analog mit Probenpuffer versetzt und weiterbehandelt. Zur Durchführung der Negativkontrollen diente als positive Referenz die Protein-Präparation aus Gesamtgewebe (2.5.3). Ein entsprechendes Volumen, das 10µg Protein entspricht, wurde analog behandelt. Bei einer Stromstärke von 20mA im Sammel- und 35mA im Trenngel betrug die Elektrophoresedauer etwa 3h. Die Gele wurden anschließend geblottet (2.9). Zur Darstellung colloidal Coomassie-gefärbter Cilienproteine im Gel wurde das Kammersystem Twin M (2.1), mit einer Gelgrösse von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm, verwendet. Dazu wurden etwa 80µg Protein wie oben beschrieben behandelt. 32

44 2 Material und Methoden Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (verändert nach Navarre et al, 2002) Um im Gel eine bessere Auflösung zu erzielen, wurde insbesondere im Hinblick auf die massenspektrometrische Analyse (2.11) zusätzlich ein zweidimensionales Trennverfahren eingesetzt. Für beide Dimensionen wurden 1,5mm dicke Gele der Grösse 11 x 14cm und das Kammersystem Twin M verwendet. Um eine zu starke seitliche Diffusion der Proben im Gel zu vermeiden, wurde sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension bei 18 C gekühlt. Arbeitsflächen, Glasplatten, Spacer, Probenkämme und Glasgeräte zum Ansetzen der Gel-Lösungen beider Dimensionen wurden mit Aceton und 1% (w/ v) SDS vorgereinigt um Fette und Protein-Verunreinigungen, wie Keratine, die auf Grund ihrer Menge in der Massenspektrometrie (2.10) andere Proteine vollständig überlagern können, zu entfernen Vorbereitung der Gele Bei der Vorbereitung der Gel-Lösungen für das Sammel- und Trenngel der CTAB-PAGE (Tab.2.5) wurde zuerst Harnstoff in der angegebenen Menge H 2 O gelöst. Um Luftblasen im Gel zu vermeiden, wurde im Exsikkator mit einer Vakuumpumpe (Vacuubrand PC101, Brandtech Scientific, Essex, USA) entgast. 25mM FeSO 4 x 7H 2 O und 0,03% H 2 O 2 wurden erst nach dem Entgasen, kurz vor dem Gießen zugegeben, da diese Substanzen den Polymerisationsvorgang einleiten. Die Polymerisationsdauer betrug 16h. Sammelgel (8%) Trenngel (8%) Harnstoff Acrylamid/ Bisacrylamid (30/0,8) Bisacrylamid (2%) 300mM KH 2 PO 4 ph mM KH 2 PO 4 ph mM Ascorbinsäure 250mM CTAB H 2 O 25mM FeSO 4 x 7H 2 O 0,03% (v/ v) H 2 O 2 Gesamtvolumen 1,66M 5,34ml 1,87ml - 8,30ml 1,00ml 0,22ml 3,27ml 0,01ml 0,80ml 20,00ml ENTGASEN 3M 10,68ml 434µl 10ml - 2,00ml 0,45ml 14,80ml 0,02ml 1,60ml 40,00ml Tab. 2.5 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels der CTAB-PAGE. 33

45 2 Material und Methoden In der zweiten Dimension wurden die in beschriebenen 10%igen Trenn- und 3,8%igen Sammelgele verwendet. Im Sammelgel wurde anstelle des Probenkamms ein speziell angefertigter Präparativer Kamm (Abb. 2.6 ), dessen große Tasche in der Breite der Gel- Länge von 11cm entspricht, verwendet. Zu beiden Seiten der grossen Tasche befinden sich für den Marker (2.3.1) noch zwei kleinere Taschen von 5mm Breite. Abb. 2.6 Präparativer Kamm. In die lange Tasche wird nach der ersten Dimension der Gelstreifen geschoben Dimension: CTAB-PAGE Bei der Probenvorbereitung für die erste Dimension wurde ein Volumen das etwa 150µg Protein entspricht mit dem gleichen Volumen 2x Probenpuffer versetzt. Der 2x Probenpuffer wurde zunächst ohne Harnstoff hergestellt, da das anschließende Erhitzen der Probe in Anwesenheit von Harnstoff zur Carbamoylierung von Lysinen führt, die als Schnittstelle von Trypsin dienen. Die Maskierung würde den vollständigen tryptischen Verdau der Proteine für die massenspektrometrische Analyse verhindern. Die Proben wurden 15min bei 70 C im Heizblock erhitzt. Währenddessen wurde in separate Eppendorf-Gefäße, die dem Probevolumen entsprechende Menge Harnstoff (3M) eingewogen und im 30 C Wasserbad erwärmt. Anschließend wurden die Proben gevortext und quantitativ in das Eppendorf-Gefäß mit dem Harnstoff überführt. Harnstoff erhöht die Löslichkeit von Proteinen. Die Proben wurden nach Zugabe erneut gründlich gevortext und dann für 5min bei 30 C im Heizbad belassen, 1min mit g in der Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert und aus dem Überstand pipettiert. Überschritt das Probevolumen inklusive 2x Probenpuffer die Menge von 150µl, musste die Probentasche des Sammelgels mit einem Micro-Spatel trichterförmig erweitert werden (Abb. 2.7). Bei einer Stromstärke von 25mA im Sammel- und 45mA im Trenngel dauerte die Elektrophorese etwa 6,5h. Die Elektroden wurden so gepolt, dass die Elektrophorese in Richtung Kathode abläuft, da CTAB als kationisches Detergenz den Proteinen eine positive Ladung verleiht. 34

46 2 Material und Methoden Nach der ersten Dimension wurde das Sammelgel entfernt und das Gelstück mit der Probe und die Markerbanden als ca 1,5cm breiter Streifen mit dem Skalpell ausgeschnitten. Der Gelstreifen wurde 4 x 5min in H 2 O gewaschen und 4 x 15min in SDS-Lyse-Puffer äquilibriert. Die Markerbanden wurden in Fixier-Lösung (2.2.6 und 2.2.7) überführt. Abb. 2.7 Elektrophoresekammer "Twin M", wie sie zur Durchführung der Gelelektrophorese verwendet wurde. Die Probentasche wurde mit dem Mikrospatel trichterförmig erweitert (siehe Text) Dimension: SDS-PAGE Der Gelstreifen wurde nach der Äquilibrierung in die Aussparung des Sammelgels geschoben. Ein Teil der zweiten Dimension wurde über Nacht bei einer Stromstärke von 10mA durchgeführt. Erst nach etwa 11h passierten die Proben die Trenngelgrenze. Am nächsten Tag konnte die Stromstärke deshalb im Trenngel auf 45mA erhöht werden. Insgesamt dauerte die Elektrophorese etwa 16h. 2.9 Färbung der Proteine im Gel Es wurden reversible Färbeverfahren mit möglichst niedriger Nachweisgrenze gewählt Reversible MS-kompatible Silberfärbung Arbeitsschritt Lösung (2.2.6) Dauer Fixierung Sensitisation Wässerung Imprägnation Spülen Entwicklung Stoppen Waschen Fixier-Lösung Sensitisationslösung Bidest Silbernitrat-Lösung Bidest Entwickler-Lösung Stopp-Lösung Bidest 1-3d 45min 6x 10min 1-2h max 15s 5-40min 45min 2x 30min Tab. 2.6 Protokoll für die reversible, MS-kompatible Sillberfärbung. 35

47 2 Material und Methoden Colloidale Coomassie-Färbung Arbeitsschritt Lösung (2.2.7) Dauer Fixierung Wässerung Inkubation Färbung Entfärbung Fixier-Lösung Bidest Inkubationslösung Färbe-Lösung Bidest 1-3d 3x 30min 60min 3-5d 6h - 3d Tab. 2.6 Protokoll für die colloidale Coomassie-Färbung Western Blot-Analyse Transfer und Immobilisierung von Proteinen Die Proteine wurden eindimensional durch SDS-PAGE (2.8.1) und zweidimensional durch CTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) aufgetrennt und in Anlehnung an Towbin et al. (1979) auf PVDF- Membranen (2.1) transferiert. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren. Dazu wurden pro Gel 16 Whatman -Papiere (3mm Chromatography paper, Whatman International Ltd.,Brentford, UK) und eine Membran auf die Größe des Trenngels zugeschnitten. Das Gel und die Whatman -Papiere wurden 5min in Transfer-Puffer äquilibriert. Die PVDF-Membran wurde zunächst 5min in Methanol aktiviert, anschließend ebenfalls in Transfer-Puffer äquilibriert. Auf die Anode der Blot-Apparatur (2.1) wurden dann 8 Filterpapiere, die Membran, das Gel und abschließend 8 Filterpapiere in dieser Reihenfolge, blasenfrei, zum sogenannten Blot-Sandwich aufgetürmt. Für einen optimalen Stromfluss wurde die Anodenplatte um das Sandwich getrocknet. Pro cm 2 Gelfläche wurde mit 2,0mA, jedoch insgesamt mit nicht mehr als 450mA, 90min geblottet Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase- Aktivität Nach dem Transfer wurden zunächst unspezifische Bindestellen auf der Membran durch Inkubaton mit Milchpulver-Blocklösung besetzt. Geblockt wurde über Nacht bei 4 C oder 60min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde 90min mit Erst-Antikörper ( ) in Milchpulver-Verdünnungslösung inkubiert. Für Blots von Gelen der Größe 5,5 x 8,5cm waren 2ml Antikörper-Verdünnung ausreichend, wohingegen für Blots der Größe 11 x 14cm 4ml Lösung benötigt wurden. Die Inkubation erfolgte in 15ml bzw 50ml Falcon-Röhrchen, die mit 36

48 2 Material und Methoden dem Falcon-Ständer an einem mechanischen Rührer, wie er in der präparativen Chemie verwendet wird, angebracht wurden. Der Rührer wurde vertikal an einem Stativ befestigt. Danach wurden die Membranen 3 x 5min auf dem Schüttler mit Wasch-Puffer und 1 x 5min mit 1x PBS gewaschen. Die Inkubation mit Zweit-Antikörper ( ) erfolgte 60min in 10ml Antikörper-Verdünnung mittels der gleichen apparativen Vorrichtung. Dann wurde wieder 3 x 5min in Wasch-Puffer gewaschen, dann 1 x 5min mit Wasser. Die Membranen wurden anschließend in einer Film-Entwicklerkassette (Hypercassette, Amersham Biosciences, Freiburg) in feuchte Frischhalte-Folie eingeschlagen. Die Aktivität der Zweit-Antikörper-gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurde mit dem ECl TM Plus-System (Amersham Biosciences, Freiburg) detektiert. Das Detektionsreagenz enthält zyklisches Diacylhydrazid (Lumigen PS-2), das in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) und mit Hilfe der Meerrettich-Peroxidase, die als Katalysator der Reaktion fungiert, zu einem Acridinium Ester umgesetzt wird (Abb. 2.9). Durch die weitere Umsetzung des Esters (Oxidation) werden Teilchen energetisch angeregt, die eine Weile auf höheren Energie-Niveaus verweilen und schließlich ihre Energie durch Abgabe von Lichtquanten (Photonen) verlieren. Man bezeichnet diesen Vorgang als Chemilumineszenz. Im Falle des ECl TM Plus-Systems dient der Acridinium Ester als eine Art Lichtspeicher und so können Lichtquanten noch 24 Stunden nach Beginn der Reaktion detektiert werden. Abb. 2.9 Oxidation von Lumigen PS-2. Die Reaktion wird von der an Zweit-Antikörper gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP) katalysiert. 37

49 2 Material und Methoden Pro cm 2 Membran wurden 40µl Detektionsreagenz angesetzt. Dazu wurden die Reagenzien A (enthält Lumigen PS-2) und B (enthält H 2 O 2 ) des ECl TM Plus- Systems im Verhältnis 40 : 1 (A : B) gemischt. Die Membranen wurden dünn betropft und danach 5min im Dunkeln inkubiert. Die Lösung wurde anschließend vom Rand der Membranen mit einem Papiertuch weggesaugt. Die Frischhalte-Folie wurde faltenfrei eingeschlagen, die Filme (2.1) bei geeignetem Rotlicht auf den Blots platziert und die Entwicklerkassette geschlossen. Anschließend wurden die exponierten Filme in der Entwickler-Maschine (2.1) entwickelt Massenspektrometrie Proteine, die massenspektrometrisch analysiert wurden, wurden zuvor durch zweidimensionale CTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) getrennt und anschließend colloidal Coomassie-gefärbt (2.9.2). Für die Protein-Identifizierung wurde der Massenspektrometer Q- Tof Ultima API der Firma Waters (Massachusetts, USA) verwendet. Das Gerät ist standardmäßig mit einer HPLC-Anlage ausgestattet. Es wurde die Kapillarsäule Modell Atlantis der Firma Waters benutzt, mit den Maßen 150mm (Länge) x 75µm (Durchmesser). Der Durchmesser der Silica-Kugeln betrug 3µm, die Porengröße 300Å (30nm). Der Aufbau (Abb. 1.9) und das Funktionsprinzip des ESI-Tandem-Massenspektrometers wurde ausführlich in Kapitel beschrieben. Für die Datenbank-Recherche wurde das Programm "MASCOT" von verwendet. Die Probenvorbereitung wurde unter einer Plexiglas-Scheibe durchgeführt um Verunreinigungen, insbesondere durch Keratine, zu vermeiden Ausschneiden der Proteine Die gefärbten proteinhaltigen Bereiche wurden mit dem Skalpell ausgeschnitten, in kleine Stücke zerteilt und die Gelstückchen anschließend in ein 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt. Dazu wurde das Gel auf einer Glasplatte platziert. Auf Papier wurde ein Raster angefertigt und unter die Glasplatte gelegt. Unter dieser Anordnung befand sich eine Leuchtplatte, so dass das Raster deutlich durch das Gel hindurch zu erkennen war (Abb. 2.10). Den ausgeschnittenen Gelstückchen konnten deshalb eindeutige Nummern zugeteilt werden, die den Tetragonen des Rasters entsprachen. 38

50 2 Material und Methoden Abb Anordnung beim Ausschneiden der gefärbten Bereiche des Gels. Das Raster (vergrößert dargestellt) wurde in 3 Bereiche A, B, C untergliedert, die Tetragone des Rasters durchnummeriert (nicht dargestellt). Auf dem Raster befindet sich eine Glasplatte (dunkelblau) auf der das Gel (türkis) liegt Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen ( im-gel Verdau ) Vor der massenspektrometrischen Analyse müssen die Proteine entfärbt und proteolytisch gespalten werden. Als Protease wurde Trypsin verwendet, das Proteine C-Terminal hinter Lysin (K) und Arginin (R) hydrolysiert, sofern es sich bei der darauf folgenden Aminosäure nicht um Prolin (P) handelt. Die meisten Proteine besitzen genügend Spaltstellen, so dass die tryptischen Fragmente eine optimale Größe aufweisen. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung von Trypsin ist, dass alle Autolyse-Produkte bekannt sind und bei der MS-Analyse deshalb von vornherein ausgeschlossen werden können. Die Gelstückchen wurden nach dem Auftauen mit 400µl H 2 O versetzt und 5min bei 37 C und 600rpm im Thermomixer (Modell Compact, Eppendorf AG, Wesseling-Berzdorf) inkubiert. Um organische Verunreinigungen zu entfernen, wurde 5min bei 600rpm und 37 C in 50% (v/ v) Acetonitril gewaschen. Zur Reduktion der Disulfidbrücken wurden die Gelstückchen mit 250µl 10mM DTT 1 Stunde bei 56 C und 600rpm behandelt. Anschließend wurde 5min auf einem zweiten Thermomixer bei 600rpm und 25 C mit 400µl H 2 O gewaschen. Danach wurden die Proben mit etwa 250µl 55mM Iodacetamid versetzt und 30min bei 600rpm inkubiert. Iodacetamid maskiert durch Alkylierung die nach der Reduktion freiwerdenden SH-Gruppen der Cysteine und verhindert so deren erneute Oxidation. Um die zusätzliche Alkylierung der Methionine zu verhindern, sollte diese Reaktion unbedingt im Dunkeln und bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Anschließend wurde im Wechsel je dreimal 10min bei 37 C und 600rpm mit 400µl H 2 O und 50% (v/ v) Acetonitril gewaschen. Die ersten beiden Male wurden die Proben dabei abgedunkelt. Die Gelstückchen wurden dann zweimal mit jeweils 400µl 100% Acetonitril bei Raumtemperatur etwa 1min dehydratisiert. Der Endpunkt dieses Vorgangs ist deutlich erkennbar, da die Gelstückchen nach Abschluss eine 39

51 2 Material und Methoden schneeweiße Farbe annehmen. Das Acetonitril wurde anschließend abgenommen und die Gelstücke bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wurde zunächst in je 20µl Trypsin-Gebrauchslösung verdaut. Die Proben wurden dazu etwa 10min bei 37 C inkubiert. Dabei quellen die Gelstückchen auf. Teilweise sind diese nicht mehr bedeckt und fehlendes Volumen wurde deshalb durch die erneute Zugabe von etwa 10µl Trypsin-Gebrauchslösung ergänzt. Nach weiteren 10min wurden die Proben ein zweites Mal überprüft und eventuell durch die Zugabe von Bicarbonat-Puffer vollständig bedeckt. Danach wurden sie über Nacht im Inkubator bei 37 C verdaut Nano-LC und interne Kalibrierung Die Peptid-Proben befinden sich nach dem Verdau in der Flüssigkeit, die die Gelstückchen umgibt. Die Injektion der Proben erfolgte automatisiert über eine Dosierschleife, die das reproduzierbare Einbringen von definierten Injektionsvolumina in das HPLC-System ermöglicht. Kleinste Mengen der Proben (20nl/ min) wurden so in den konstanten Volumenstrom (5µl/ min) der mobile Phase ( ) gebracht. Als mobile Phase wurde ein konvexer Hochdruck-Gradient aus H 2 O/ Acetonitril (Tab. 2.7) verwendet. Der Pumpendruck betrug 3600psi ( parts per square inch, entspricht 248,2bar). Zeit (min) H 2 O (%) Acetonitril (%) Fließgeschwindigkeit (µl/ min) 0, , , , , , , , Tab. 2.7 Zeitprofil des konvexen Gradienten der mobilen Phase. Für die Kalibrierung des Massenspektrometers wurde der Fibrinogen B [Glu 1 ]-Standard der Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet. 40

52 2 Material und Methoden Extraktion der Proben Proben, die sich nach der Analyse im Spektrum als sehr komplex herausgestellt hatten, wurden ein zweites Mal gemessen. Dazu mussten die Peptide aus den Gelstückchen extrahiert werden. Mit Acetonitril wurden die Gelstückchen erneut dehydratisiert. Die austretende Flüssigkeit wurde abgenommen, in ein neues 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt und in der Savant SpeedVac (Selby Biolab, Australien) eingeengt. Das resultierende Volumen wurde in 15µl Bicarbonat-Puffer aufgenommen, 5µl wurden für die Analyse verwendet, das restliche Volumen bei -20 C gelagert. 41

53 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse In dieser Arbeit sollten ciliäre Membranproteine aus dem Riechepithel der Ratte isoliert und in hoher Auflösung durch 2D-Gelelektrophorese dargestellt werden. Das Ziel war dabei die Etablierung einer Methode, die die massenspektrometrische Analyse des gesamten ciliären Proteoms ermöglicht. Der folgende Ergebnisteil gliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 3.1 beschreibt die Isolation ciliärer Membranen aus dem Riechepithel der Ratte. Der immunologische Nachweis von Markerproteinen, die Aufschluss über die Qualität der Präparation geben, ist Bestandteil von Abschnitt 3.2. Die zweidimensionale gelelektrophoretische Trennmethode der solubilisierten Membranproteine ist in Abschnitt 3.3 beschrieben und deren qualitative Analyse in Abschnitt 3.4. Abschließend werden die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse in Abschnitt 3.5 vorgestellt. 3.1 Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer Membranen Die Präparation von Cilien-Membranen wurde bereits von mehreren Autoren beschrieben (z.b. Bönigk et al., 1999; Delgado et al., 2002; Washburn et al., 2002). Die dort beschriebenen Vorgehensweisen lieferten, bezogen auf die Reinheit und Protein-Ausbeute, jedoch keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Es war deshalb zunächst notwendig, diese Präparationstechniken im Hinblick auf die 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie zu optimieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun eine Präparation ausgearbeitet werden, die durch die Kombination der verschiedenen Beschreibungen eine neue Methode darstellt, die diesen Anforderungen genügt. Dazu wurde das Riechepithel aus jeweils Ratten präpariert. Für den nachfolgenden Calcium-Schock zur Ablösung der Cilien vom Epithel erwies sich das 30minütige Rühren im Schnappdeckel-Glas gegenüber dem Taumeln im 15ml Falcon-Röhrchen als viel effektiver, so dass die Ausbeute an Cilien-Membranen wesentlich gesteigert werden konnte. Bei 7700g bewirkte die Anwendung der sequenziellen Zentrifugation anstelle eines einzelnen Zentrifugationsschrittes eine zusätzliche Anreicherung ciliärer Membranen. Dabei erscheinen die Cilien nach dem ersten Zentrifugationsschritt noch als gelber Ring (Abb. 3.1, links) um das decilierte Restepithel, der im Zuge der folgenden Zentrifugationsschritte verschwindet. Zur besseren Abtrennung gelöster Proteine und nicht-ciliärer Membranen anderer Organellen, wie von Mitochondrien oder Zellkernen, wurde zudem ein Saccharose-Stufengradient 42

54 3 Ergebnisse eingeführt. Die Cilienbande erscheint nach der Ultrazentrifugation deutlich sichtbar als dunkler Nebel an der Phasengrenze des Gradienten (Abb. 2.5). Die Ausbeute an isolierten Membranen wurde für jeden Reinigungsschritt indirekt über die Proteinmenge bestimmt. Da Membranproteine für eine quantitative Bestimmung zunächst aus der Membran gelöst und solubilisiert werden müssen, ist der Einsatz von Detergenzien unumgänglich. Die Bestimmung der Proteinmenge musste deshalb über die Amidoschwarz- Methode erfolgen. Die Abbildung 3.1 (rechts) zeigt das Cilienpellet nach der zweiten Ultrazentrifugation am Ende der Präparation. Die hier etablierte Methode lieferte jetzt im Vergleich eine deutlich höhere Ausbeute. Abb. 3.1 Links dargestellt ist das Pellet der Riechepithelien von 5 Ratten nach der ersten Zentrifugation bei 7700g. Der gelbliche Rand (Pfeil) um das decilierte Restepithel besteht aus den Cilien der ORNs. Rechts: Membranpellet am Ende der Präparation. 43

55 3 Ergebnisse 3.2 Qualitative Analyse der Präparation Kennzeichnend für die hohe Qualität der Präparation ist die vorherrschende Präsenz ciliärer Proteine. Für die Praxis bedeutet dies, dass analysiert werden muss, ob folgende Voraussetzungen erfüllt sind: Der gelelektrophoretische Vergleich der Cilienproteine mit den Proteinen des olfaktorischen Gesamtepithels zeigt, dass cilienspezifische Proteine angereichert werden In der Präparation können ciliäre Markerproteine nachgewiesen werden Epitheliale oder mitochondriale Markerproteine werden nicht oder in geringer Menge in der Cilienpräparation nachgewiesen Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGE Um sich einen groben Überblick zu verschaffen, ob bestimmte Proteine in der Präparation besonders stark angereichert werden, wurden etwa gleiche Mengen der Cilienproteine und des olfaktorischen Gesamtepithels (OE; 2.5.3) durch denaturierende SDS-PAGE (2.8.1) getrennt und anschließend colloidal Coomassie (2.9.2) gefärbt. Abb. 3.2 Vergleich des Bandenmusters ciliärer Proteine mit dem von Proteinen des decilierten Restepithels. Links im Bild: Molekulargewichte in kda. (I): 20µg Cilienproteine; (II): 20µg Proteine des olfaktorischen Gesamtepithels. Abbildung 3.2 zeigt das Ergebnis der Färbung: In der Tat scheinen einige Proteine durch die Präparation stark angereichert zu werden. Besonders deutlich ist dies etwa im Bereich von 55kDa zu erkennen. Im oberen Drittel sind im Größenbereich zwischen 70 und 120kDa viele Banden erst nach der Anreicherung erkennbar. Möglicherweise handelt es sich um cilienspezifische Proteine, die in der großen Proteinvielfalt des gesamten olfaktorischen Epithels nicht als Banden sichtbar werden. Insgesamt ist die Auflösung der Banden viel zu gering um die Komplexität der Präparation vollständig zu erfassen. In einer Bande können zahlreiche Proteine enthalten sein. 44

56 3 Ergebnisse Ersichtlich ist, dass es sich bei den Proteinen der Präparation um ein komplexes Gemisch handelt. Ob es sich dabei ausschließlich um ciliäre Proteine handelt, kann erst beurteilt werden, nachdem die Anwesenheit anderer Proteine experimentell widerlegt wurde und Cilienproteine nachgewiesen wurden Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-Analyse Adenylatcyclase Typ III (AC III), das olfaktorische G-Protein (G olf ) und die Untereinheiten des cyclisch-nukleotid gesteuerten Kationenkanals (CNG-Kanal) sind heute anerkannte cilienspezifische Markerproteine, für die Antikörper für immunologische Nachweis- Verfahren im Handel erhältlich sind. Cilienproteine, Proteine des decilierten Restepithels und des olfaktorischen Gesamtepithels wurden nach der SDS-PAGE auf PVDF-Membranen immobilisiert. Zum immunologischen Nachweis der Markerproteine wurden Antikörper gegen die A2-Untereinheit des CNG- Kanals (α-cng-a2), gegen die A4-Untereinheit des CNG-Kanals (α-cng-a4), gegen AC III (α-ac III) und gegen die α-untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (α-g αs/olf ) verwendet Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-Kanals Abbildung 3.3 zeigt den immunologischen Nachweis von CNG-A4 (linker Blot) und CNG- A2 (rechter Blot). Beide Untereinheiten wurden in der Cilien-Präparation (I) nachgewiesen, aber nicht im decilierten Restepithel (II) und nicht im olfaktorischen Gesamtepithel (III). Deutlich sichtbar ist bei CNG-A2 nur die glykosylierte Variante bei etwa 125kDa. Die unscharfe Bande lässt auf unterschiedliche Glykosylierungszustände schließen, die überwiegend während der Präparation entstehen. Die nicht glykosylierte Variante bei 76kDa ist nur sehr schwach erkennbar, möglicherweise deutet dies auf ein schonendes Präparationsverfahren hin, da das Protein überwiegend in seiner höhermolekularen Form auftritt und das, obwohl große Proteine im Vergleich zu kleineren erfahrungsgemäß schwerer auf Membranen zu transferieren sind. Bei etwa 58kDa ist schwach ein wiederholt auftretendes Abbauprodukt der CNG-A2 Untereinheit zu erkennen. 45

57 3 Ergebnisse Abb. 3.3 Western Blot-Analyse von CNG-A4 (linker Blot) und CNG-A2 (rechter Blot). Pro Spur wurde 10µg Protein aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kda. (I): Cilien; (II): deciliertes Restepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-cng-a4, 1: 20; α-ms IgG, 1: 30000; α- CNG-A2, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; Expositionsdauer der Membranen: 12min. Die CNG-A4 (linker Blot) Untereinheit ist ebenso wie CNG-A2 nur in den Cilien nachweisbar. Sie ist nicht glykosyliert und erscheint in nur einer Variante bei 66kDa. Da beide Untereinheiten nicht im decilierten Restepithel nachgewiesen werden, ist eine hohe Ausbeute an Cilienmembranen bei der Präparation anzunehmen. Der Anteil an CNG- Proteinen bezogen auf die gesamte Protein-Vielfalt des olfaktorische Epithels ist zu gering um CNG-A2 und CNG-A4 in den aufgetragenen Mengen noch nachweisen zu können. Beide Untereinheiten werden demnach stark bei der Präparation angereichert Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III) Bei der Analyse der AC III (Abb. 3.4) wurden nicht nur in der Cilienpräparation (I) Signale detektiert, sondern schwach auch im decilierten Restepithel (II) und im olfaktorischen Gesamtepithel (III). Prominent ist auch hier die glykosylierte Form des Proteins, die typischerweise bei etwa 220kDa erscheint. Ein Abbauprodukt, das häufig detektiert wird, erscheint in mittlerer Intensität in der Cilien- Präparation bei etwa 72kDa (zum Vergleich siehe Bönigk et al., 1999). 46

58 3 Ergebnisse AC III scheint sehr stark in den ORNs exprimiert zu werden und ist deshalb auch im decilierten Restepithel noch schwach nachweisbar. Ersichtlich ist aber, dass AC III, ebenso wie die CNG-Untereinheiten, durch die angewandte Präparationstechnik deutlich angereichert wird. Abb. 3.4 Western Blot-Analyse der AC III. (Zahlen): Molekulargewichte in kda. Pro Spur wurde 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertes Restepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-ac III, 1: 200; α-rb IgG, 1: 80000; Exposition: 3min Western Blot-Analyse der α-untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (G α olf ) Die α-untereinheit des olfaktorischen G-Proteins besitzt eine Größe von 44,2kDa und wird in allen Spuren sehr stark detektiert, jedoch besteht immer noch eine Tendenz zur Anreicherung in der Cilien- Präparation (I), wohingegen im decilierten Restepithel (II) eine Abreicherung zu beobachten ist. Möglicherweise bestehen die Signale aus zwei Banden, da häufig auch die etwas kleinere Spleiß-Variante α2 (40kDa) detektiert wird. Abb. 3.5 Western Blot- Analyse von G α olf. (Zahlen): Molekulargewichte in kda. Pro Spur wurden 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertes Restepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-g α olf, 1: 2000; α-rb IgG, 1: 80000; Exposition: 20s Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-Analyse Die Reinheit der Präparation wurde durch Ausschluss mitochondrialer und epithelialer Markerproteine überprüft. Als Marker dienten Occludin der tight junctions und Prohibitin, das in der inneren Mitochondrien-Membran lokalisiert ist. 47