A. Rolfs, Zwischenbericht für die Tom-Wahlig-Stiftung

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1 Zwischenbericht 1. Material und Methoden 1.1. Organismen und Vektoren Bakterienstämme Vektoren 1.2. Mikrobiologische Methoden Zellkultivierung Transfer von DNA in E.coli und Selektion 1.3. Allgemeine DNA-Methoden PCR Aufreinigung von PCR-Produkten und DNA-Fragmenten Präparation von Plasmid-DNA Restriktion und Ligation Konstruktaufbau Expression des Fusionsproteines 2. Ergebnisse 2.1. Amplifikation von SPG1, SPG4 und TTX Kontrollrestriktion von SPG1 und SPG Expressionssystem 2.4. Charakterisierung des His-EGFP-TETX Bindung von His-EGFP-TETX450 an neuronale Membranen Internalisierung des His-EGFP-TETX450 durch neuronale Zellen Applikation des His-SPG4-TTX450-Produktes in vivo 1

2 1. Material und Methoden 1.1. Organismen und Vektoren Bakterienstämme Der in dem Projekt bislang verwendete Organismus für die Amplifikation ist E.coli (JM109) Vektoren Tab.1 Vektoren Vektor relevantes Merkmal Größe (bp) Herkunft pask-iba13 P/Oteta,N.-term.-Strep Laborsammlung TagII, ApR pqe-30 P T5, laco, N-term Laborsammlung 6xHis-tag, ApR PQETriSystemHis.Stre2 ATG, N-term.-Strep-Tag, Qiagen, Hilden C-term.-8xHis-Tag pdest26 PCMV, N.-term.-6xHis Invitrogen Tag PTOPO Topoisomerase Invitrogen Tab.2 rekombinante Vektoren Vektor relevantes Merkmal Insertgröße Herkunft (bp) pqe-30-spg4 pqe-30 mit SPG4 über BamHI und 1355 Aktuelles Projekt SalI einkloniert pask-iba13-ttx164 pask-iba13 mit TTX190 über SalI 527 Laborsammlung und HindIII einkloniert pask-iba13-ttx183 pask-iba13 mit TTX190 über SalI 584 Laborsammlung und HindIII einkloniert pask-iba13-ttx190 pask-iba13 mit TTX190 über SalI 605 Laborsammlung und HindIII einkloniert pask-iba13-spg4-ttx164 pask-iba13 mit SPG4-TTX190 über 1882 Aktuelles Projekt BamHI und HindIII einkloniert pask-iba13-spg4-ttx183 pask-iba13 mit SPG4-TTX190 über 1939 Aktuelles Projekt BamHI und HindIII einkloniert pask-iba13-spg4-ttx190 pask-iba13 mit SPG4-TTX190 über 1960 Aktuelles Projekt PQETriSystemHis.Strep2- SPG4-TTX164 PQETriSystemHis.Strep2- SPG4-TTX183 PQETriSystemHis.Strep2- SPG4-TTX190 BamHI und HindIII einkloniert pqetrisystemhis.strep2 mit SPG4- TTX190 über BamHI und HindIII einkloniert pqetrisystemhis.strep2 mit SPG4- TTX190 über BamHI und HindIII einkloniert pqetrisystemhis.strep2 mit SPG4- TTX190 über BamHI und HindIII einkloniert PQETriSystemHis.Strep2-SPG1 pqetrisystemhis.strep2 mit SPG1 übersmai und BglII einkloniert PQETriSystemHis.Strep2- pqetrisystemhis.strep2 mit TTX190 TTX190 über BglII und HindIII einkloniert PQETriSystemHis.Strep2- SPG1-TTX190 pqetrisystemhis.strep2 mit SPG1- TTX190 über SmaI und HindIII einkloniert 1882 Aktuelles Projekt 1939 Aktuelles Projekt 1960 Aktuelles Projekt 3783 Aktuelles Projekt 605 Aktuelles Projekt 4391 Aktuelles Projekt 2

3 1.2. Mikrobiologische Methoden Zellkultivierung Für die Vermehrung von E.coli wurde das Fertigmedium LB Broth Base und LB-Agar der Firma Invitrogen, Karlsruhe verwendet. Diejenigen Bakterien, die Plasmide aufgenommen haben, besitzen eine Resistenz gegenüber eines Antibiotikums und konnten über dieses Antibiotikum selektiert werden. Das jeweilige Antibiotikum wurde zuvor steril filtriert. Das Antibiotikum Ampicillin hatte eine Arbeitskonzentration von 100µg/ml. In dem mit Ampicillin versetzten LB-Medium wurde E.coli JM109 bei 37 C und ca. 200 Upm in einem Schüttelschrank herangezüchtet Transfer von DNA in E. coli und Selektion Als Transformationskontrolle dienten 50ng pqe-30, als Negativkontrolle 5µl Wasser. Für die eigentliche Transformation wurden 50µl kompetente E.coli JM109 Zellen auf Eis aufgetaut und mit ng des entsprechenden Vektors bzw. der Hälfte eines Ligationsansatzes versetzt. Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis, wurden mittels Hitzeschock bei 70 C für s die Ansätze für 5min auf Eis verwahrt. Danach erfolgte die Zugabe von µl steril filtriertem S.O.C.-Medium (Invitrogen, Karlsruhe) auf die Ansätze mit anschließender 1,5 stündiger Inkubation bei 37 C im Thermomixer. Von jedem Ansatz wurden jeweils 100µl auf vorher vorbereitete Agarplatten mit Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37 C im Brutschrank aufbewahrt. Am nächsten Tag wurden einzelne Klone gepickt und in jeweils 5ml LB-Medium über Nacht bei 37 C im Schüttelschrank inkubiert. Zur Plasmidgewinnung wurde das QIAprep Spin MiniKit von Qiagen nach Herstellerprotokoll angewandt. Zur Kontrolle wurden die Proben einem Restriktionsverdau unterzogen Allgemeine DNA-Methoden PCR und Primerdesign Mit Hilfe der PCR werden selektiv bestimmte Abschnitte der DNA exponentiell amplifiziert. Um für die spätere Klonierung und Expression der entsprechenden Sequenzen ein möglichst mutationsfreies Amplifikat zu erhalten, wurde eine proofreading Polymerase mit 3-5 Exonuclease Aktivität verwendet: für die Generierung von SPG1 und SPG4 wurde daher das Expand Long Template PCR System der Firma Roche genutzt. Als Ausgangsmaterial für die PCR von SPG1 (3783bp) und SPG4 (1355bp) wurde cdna aus dem Gehirn der Maus verwendet. Die Amplifikation von TTX164 bzw. TTX183 bzw. TTX190 (für SPG1 in den pqe-trisystemhis.strep2 Vektor) erfolgte aus dem Laborplasmid pqe-60-ttx450. Die Wahl der Primer wurde aus den bekannten Sequenzen für SPG1 und SPG4 abgeleitet, wobei die Primer zur Einfügung der entsprechenden Restriktionsschnittstellen für die spätere Klonierung in das gewünschte Expressionssystem verwendet wurden. Die spezifischen Primer wurden für die Stammkonzentration auf 100µM verdünnt und bei -20 C gelagert. Die Arbeitskonzentration betrug 10µM. Zur Erfolgsüberprüfung wurden die PCR-Produkte nach Beendigung des jeweiligen PCR- Programmes auf ein 1-2%-iges Agarosegel aufgetragen und mittels DNA-Größenmarker identifiziert. 3

4 Aufreinigung von PCR-Produkten und DNA-Fragmenten Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem Gelextraction-Kit von Qiagen bzw. mit dem Qiaqick PCR- Purification-Kit (Qiagen) angewandt werden. Das Prinzip dieser Reinigung beruht auf einer Bindung der DNA an eine Silikagel-Membran. Beide Kits wurden nach Herstellerangabe der Firma Qiagen eingesetzt Präparation der Plasmid-DNA Für die Isolierung der Plasmid-DNA aus E.coli wurde das QIAprep Spin MiniKit von Qiagen nach Herstellerprotokoll verwendet. Der Erfolg der Klonierung der zu untersuchenden Sequenz im Vektor wurde durch einen Restriktionsverdau der isolierten Plasmid-DNA gezeigt. Die Lagerung erfolgte bei -20 C Restriktion und Ligation Die Restriktion erfolgte mit 5U Enzym pro 1 µg DNA mit den jeweils vom Hersteller empfohlenen Puffern. Der Restriktionsansatz wurde zwischen 2 und 16h bei der für das jeweilige Enzym optimalen Temperatur inkubiert. Zur Kontrolle wurde ein Teil der Restriktionsansätze auf 1-2%ige Agarosegele aufgetragen. Um eine Religation von linearisierten Vektoren zu verhindern, wurden die Vektoren vor der Ligation mittels alkalischer Phosphatase (Promega) dephosphoryliert. Im Anschluß an die Dephosphorylierung wurden die DNA-Fragmente durch Ligation zusammengefügt. Hierzu wurde das Enzym T4-DNA-Ligase (Promega) eingesetzt. Für die Ligation wurden 50ng linearisierter und dephosphorylierter Vektor in einem Verhältnis von 1:3 mit den entsprechenden DNA-Fragmenten nach Herstellerprotokoll ligiert Aufbau des Konstruktes Die Sequenzen für SPG1 bzw. SPG4 wurden vor und in einem parallelen Ansatz hinter die TTX190-Sequenz ligiert Expression des Fusionsproteines Die Expression der Fusionsproteine erfolgt parallel in HEK296 bzw. HEK296-2 bzw. HCB- 41 Zellen. 2. Ergebnisse 2.1. Amplifikation von SPG1, SPG4 und TTX190 Die PCR zur Generierung von SPG1, SPG4 und TTX190 (für SPG1 in pqe- TriSystemHis.Strep2) wurden unter den jeweils optimal angepassten Bedingungen durchgeführt. Durch das Auftragen der PCR-Produkte auf 1-2%-ige Agarosegele und anschließender Gelelektrophorese konnten SPG1 und SPG4 anhand eines Größenstandard dargestelt werden (Abb.1.), ebenso die Amplifikation von TTX164, TTX183 bzw. TTX190 für die Fusion mit SPG1 und SPG4 im pqe-trisystemhis.strep2 System. 4

5 Abb. 1; 1%-igesAgarosegel; Bande1= 0.5µl Marker 7; Bande 2 = 3µl SPG1 (3.783bp); Bande 3 = 0.5µl Marker 9; Bande 4 = 3µl SPG4 (1355bp) 2.2. Kontrollrestriktion von SPG1 und SPG4 Der Restriktionsverdau von SPG1 und SPG4 mit NcoI belegte die Identität der Amplifikate; das dargestellte Restriktionsmuster von SPG1 und SPG4 stimmt mit dem theoretischen Restriktionsmuster überein (Abb.2a, b,c und d). Sowohl SPG1 als auch SPG4 wurden in den verschiedenen Fusionsprodukten sequenziert und es ließ sich die exakte Wildtyp-Sequenz nachweisen; Mutationen während der Klonierungsschritte kamen nicht zur Darstellung. 1 2 Abb. 2a. 1%-iges Agarosegel; Kontrollrestriktion von SPG1(Bande2) mittels NcoI, Bande 1 (MarkerVII) 1 2 Abb 2b. 1%-iges Agarosegel, Kontrollrestriktion von SPG4 (Bande 2), Bande 1 (Marker IX) Abb. 2c Theoretisches Restriktionsmuster von SPG1 2478bp NcoI (555) NcoI (3033) 555bp SPG1 NM bp 748bp Abb. 2d Theoretisches Restriktionsmuster von SPG4 NcoI (561) 561bp SPG4 mouse XM bp 801bp 5

6 2.3. Expressionssystem Der prokaryotische Expressionsvektor pqe-80 (Qiagen) wurde für die Klonierung genutzt. Durch die auf dem Vektor codierten laci-repressor wird das Basallevel der Expression sehr niedrig gehalten. Als Selektionsmarker dient Ampicillin bei einer Konzentration von 100 µg/ml. Der Vektor verfügt über den starken T5-Promotor für ein hohes Expressionslevel bei einer Induktion mit 1 mm IPTG. Die mit diesen Vektor exprimierten Proteine werden N- terminal mit einem 6x-His-Tag fusioniert was eine einfache und effiziente affinitätschromatographische Aufreinigung (IMAC) des rekombinanten Proteins ermöglicht. NH 2 6x His-Tag SPG4 bzw. SPG1 TTX450 COOH Abb. 3 Schematische Darstellung des Fusionsproteins: das Fusionsprotein wurde N-terminal mit einem 6xHis-Tag versehen. Beispielweise das TTX450-Fragment (neben anderen TTX-Fragmenten, siehe oben) wurde C-terminal mit SPG1 bzw. SPG4 fusioniert Expression und Aufreinigung der rekombinanten Proteine E.coli JM109 (Promega) wurde kultiviert und die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mm IPTG bei einer OD 600 von 0,5 gestartet. Die Zellen wurden für 20 h bei 20 C auf einem Rundschüttler inkubiert und 8 min bei 5000 Upm pelletiert und für 1 h in Lysepuffer (300 mm NaCl, 50 mm NaH 2 PO 4, 1 % [v/v] Triton X-100, 1 % [v/v] Tween 20, 5 mm Imidazol, 1 mg/ml Lysozym, 20 µg/ml RnaseA, 0,25 U/ml DnaseI und Proteasehemmern (Complete, Boehringer) ph 8.0 inkubiert. Für den vollständigen Aufschluß schloß sich ein Zyklus von 5x Frieren/Tauen in flüssigen Stickstoff an. Die Lysate wurden 30 min bei Upm und 4 C zentrifugiert und mit der Ni-NTA-Sepharose Matrix (Qiagen) nach Herstellerangaben im Gravity-Flow Verfahren aufgereinigt kda 1 Prestained Gold IV (peqlab) 2 leer 3 lösliche Fraktion 4 unlösliche Fraktion Abb. 4 SDS-PAGE, Coomassie-gefärbtes Gel 7-14 %: es zeigt sich eine große Bande in der löslichen Fraktion (Pfeil). Das Protein ist in der restlichen, inlöslichen Fraktion kaum vorhanden. Die Expression in E.coli liefert ein Protein mit einer Größe, die mit der theoretisch erwarteten am Beispiel des SPG4-TTX190-Konstrukts - von etwa 79 kda übereinstimmte. Es liegt zum 6

7 Großteil in löslicher Form vor (s. Abb.2) und läßt sich daher effektiv nativ aufreinigen. Abb.5 zeigt, daß das Fusionsprotein den Hauptanteil an Protein im Eluat darstellt. M v.s. FT W1 W2 W3 W4 E1 E2 E3 E4 E5 E6 M 72 kda Abb.5: Gravity-Flow Aufreinigung des EGFP-TTX450 Fusionsproteins: M-Marker IV Gold; v.s.- Lysat vor Säulenauftrag; FT-flow through; W-Waschung; E-Elution mit 250 mm Imidazol Nachweis der Fusionsproteine mittels Western Blot Um das Protein spezifisch nachzuweisen, werden der His-Tag mit NI-NTA-AP-Konjugat nachgewiesen sowie ein Antikörper-gerichtet gegen die letzten 15 C-terminalen AS des Tetanus-Toxins- eingesetzt. Der Nachweis mit NI-NTA-AP-Konjugat erfolgt gemäß den Herstellerangaben. Für den Nachweis von TTX wird die Membran ü.n. bei 4 C in PBS mit 0,1 % [v/v] Tween20, 1 % [w/v] BSA inkubiert und mit dem spezifischen Antikörper (rabbit) 1:5000 verdünnt 1h in der selben Lösung inkubiert. Die Membran wird 4x 5 min mit PBS gewaschen und in PBS mit 0,1 % [v/v] Tween20 zusammen mit dem AP-gekoppelten Sekundäratikörper (Goat-antirabbit) 1 h inkubiert. Nach 4x 5 min waschen mit PBS erfolgt die Entwicklung der Farbreaktion. A B C 72 kda Abb.3 Abb.4 Abb.5 Abb. 6: Detektion des Fusionsproteins im Western Blot: A) Gesamtlysat, mittels Ni-NTA-AP- Konjugat B) Gesamtlysat, mittels Anti-TTX-AK, C) aufgereinigt, mittels Anti/TTX/AK Das Fusionsprotein am Beispiel des SPG4-TTX190-Konstrukts - konnte auf der richtigen Höhe mit dem Ni-NTA-AP-Konjugat sowie mit dem Anti-TTX-Antikörper nachgewiesen werden (Pfeil). Auf der Membran erschien es stets als deutlich prominente Bande entsprechend der Höhe im Coomassie-gefärbten Gel. 7

8 Die Expressionsanalysen der unterschiedlichen TTX-SPG4 bzw. TTX-SPG1 Klone erfolgte auf die gleiche Weise wie in Abbildung 6 dargestellt. In allen Fällen ließ sich eine Expression auf hohem Niveau erkennen. Bei den induzierten Ansätzen erschienen im SDS-Gel Banden mit der erwarteten Größe zwischen 51 kda für die kleinsten TTX-Fragmente und 80 kda für HisSPG4/SPG1-TETX450-Fragmente. Jedoch war im Gel His-SPG4/SPG1-TTX190 nicht in sichtbarer Menge in der löslichen Fraktion vorhanden. His-SPG4/SPG1-TTX329 bzw. 389 dagegen wurde in hohem Maße in löslicher Form produziert. Im Fluoreszenzmikroskop zeigten beide Klone eine starke Fluoreszenz. In weiteren Expressionsreihen wurde versucht, die Aggregation des His-EGFP-TETX190 zu unlöslichen Formen durch Veränderung der Versuchsparameter zumindest teilweise zu verhindern. Dazu wurde die Expression bei RT anstatt bei 37 C durchgeführt, die Induktorkonzentration reduziert, in T7-Minimalmedium inkubiert und der Expressionsstamm [XL-1 Blue MRF ], [M15], [SG13009] oder [BL21] gewechselt. Weder die Senkung der Temperatur als auch Änderung des Mediums und der Expressionsstämme hatte einen positiven Effekt auf die Löslichkeit. Beispielhaft ist in Abbildung 7 der Einfluß verschiedener Induktorkonzentrationen auf die Expression bei RT im Western Blot mit Ni-NTA AP-Konjugat dargestellt. Bei dieser Darstellung ließ sich der Einfluß auf die Expression im Gegensatz zum SDS-Gel besser erkennen kda 49 kda 35 kda 0 mm 1 mm 0,1 mm 0,01 mm 0,001 mm Abb. 7. Ni-NTA-Western Blot: Einfluß verschiedener Induktorkonzentrationen auf die Expression von SPG4/SPG1-TETX190His [JM109] Die löslichen und Gesamtextrakte wurden im 4-15 %-igen PA-Gel aufgetrennt und rekombinantes Protein mittels Ni-NTA AP-Konjugat detektiert. Es wurden jeweils zweimal die lösliche Fraktion und Gesamtextrakt aufgetragen. mm- IPTG-Konzentration. Spur 1: Broad-Range Standard; Spur 2,3: lösliche Fraktion SPG4-TTX190His/0 mm IPTG; Spur 4,5: Gesamtextrakt SPG4-TTX190His/0 mm IPTG; Spur 6-21: analog s.o. Zur weiteren Kontrolle der exprimierten Produkte wurden die überexprimiertes Protein massenspektrometrisch identifiziert. Dazu wurden von einer 100 ml-kultur die Proteine durch 8 M Harnstoff denaturierend solubilisiert und an Ni-NTA-Agarose affinitätschromatographisch aufgereinigt. 8

9 kda 49 kda 35 kda 29 kda 21 kda Abb. 8: Aufreinigung von His-SPG4-TTX190 unter denaturierenden Bedingungen Das SDS-PA-Gel (4-15 %) wurde Coomassie gefärbt. Der Pfeil deutet auf eluiertes His-EGFP- TETX190. Spur 1,14: Broad-Range Standard; Spur 2: geklärtes Lysat; Spur 3: Durchfluß; Spur 4-6: Waschfraktionen 1-3; Spur 7-13: Elutionsfraktionen 1-7 Die Proben wurden mit Trypsin verdaut und die resultierenden Peptide über eine nano-hplc gekoppelte ESI-TOF MS gemessen und N-terminal sequenziert. Dabei wurden beispielsweise das SPG4 und der C-Terminus des Tetanustoxin-Precursors zweifelsfrei identifiziert. In Abb. 9 sind beispielsweise die Ergebnisse für das Kontroll-Fusionsprodukt EGFP-TTX190 dargestellt. Protein# 1: Match to: GFP_AEQVI; Score: 392 (P42212) Green fluorescent protein. Matched peptides shown in Bold Red 1 MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFICTT 51 GKLPVPWPTL VTTFSYGVQC FSRYPDHMKQ HDFFKSAMPE GYVQERTIFF 101 KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV 151 YIMADKQKNG IKVNFKIRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY 201 LSTQSALSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT HGMDELYK Protein# 2: Match to: TETX_CLOTE; Score: 287 (P04958) Tetanus toxin precursor (EC ) (Tentoxylys 1101 EKLYTSYLSI TFLRDFWGNP LRYDTEYYLI PVASSSKDVQ LKNITDYMYL 1151 TNAPSYTNGK LNIYYRRLYN GLKFIIKRYT PNNEIDSFVK SGDFIKLYVS 1201 YNNNEHIVGY PKDGNAFNNL DRILRVGYNA PGIPLYKKME AVKLRDLKTY 1251 SVQLKLYDDK NASLGLVGTH NGQIGNDPNR DILIASNWYF NHLKDKILGC 1301 DWYFVPTDEG WTND Abb. 9: Ergebnis der massenspektrometrischen Untersuchung. Dargestellt sind die gesamten AS des GFP sowie die C-terminalen 215 AS des Tetanustoxins. Identifizierte AS sind rot markiert. 9

10 2.4. Charakterisierung des His-EGFP-TETX Bindung von His-EGFP-TETX450 an neuronale Membranen In den folgenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen His- TETX450-Klone mit SPG4 bzw. SPG1 bzw. EGFP spezifisch an neuronale Zellen binden. Dazu wurden Primärkulturen aus corticalen Zellen von E14 Wistar Ratten verwendet (Vgl. KISSA et al., 2002). Des Weiteren wurde ein Subklon der PC12-Zelllinie eingesetzt (HERREROS et al., 2000). Als Negativkontrolle wurde die epitheliale HeLa-Zelllinie genutzt, von der bekannt ist, dass sie keine TTX-Rezeptoren exprimiert (KNIGHT et al., 1999; SCHNEIDER et al., 2000). Die Proteine wurden in den jeweiligen serumfreien Medien verdünnt (30 µg/ml), die Zellen darin für 2 h bei normalen Waschstumsbedingungen weiter inkubiert. Um die Notwendigkeit der TTX-Domäne für die Zellbindung zu zeigen, wurde Strep-EGFP als Negativkontrolle eingesetzt. A B C D Abb. 10: Bindung von Strep-EGFP und His-EGFP-TETX450 an die Zelloberfläche von HeLa Zellen. Der neuronale Tropismus wurde durch Inkubation der Zellen für 2 h mit 30 µg/ml Strep- EGFP (A und B) und His-EGFP-TETX450 (C und D) untersucht. Es sind Phasenkontrastbilder (A und C) mit entsprechenden Fluoreszenzbildern (B und D) gezeigt. Balken = 100 µm. 10

11 A B C D C E F Abb. 11: Bindung von Strep-SPG4 und His-SPG4-TETX450 an die Zelloberfläche primärer corticaler Zellen. Die Zellen wurden für 2 h mit 30 µg/ml Strep-SPG4 (A und B) oder His-SPG4- TTX450 (C-F) inkubiert. Es sind Phasenkontrastbilder (A, C und E) mit entsprechenden Fluoreszenzbildern (B, D und F; Anti-His-Antikörper, Fluorescein markiert) gezeigt. Balken = 100 µm (A-D) und 25 µm (E,F). 11

12 A B C D Abb. 12: Bindung von Strep-SPG4 und His-SPG4-TTX450 an die Zelloberfläche undifferenzierter Neuroscreen-1 Zellen. Die Zellen wurden für 2 h mit 30 µg/ml Strep-SPG4 (A und B) und His-SPG4-TTX450 (C und D) inkubiert. Es sind Phasenkontrastbilder (A und C) mit entsprechenden Fluoreszenzbildern (B und D) gezeigt. Balken = 10 µm. Strep-SPG4 wurde erwartungsgemäß weder durch HeLa-Zellen noch durch primäre corticale Zellen oder Neuroscreen-1 Zellen gebunden und folglich auch nicht internalisiert. Im Gegensatz zu HeLa Zellen, bei denen die fehlenden Fluoreszenzsignale die fehlende Internalisierung belegen (Abb.10 A/B), konnte die Bindung an primären corticalen Neuronen sowie Neuroscreen-1 Zellen nachgewiesen werden (Abb. 11 B/D und 12 B/D). Diese zeigte sich durch starke Fluoreszenz entlang der gesamten Zellkörperoberfläche. Die Bindung von His-SPG4-TTX450 an NGF-differenzierte Neuroscreen-1 Zellen war jedoch bedeutend stärker als an nicht differenzierten Zellen. 12

13 A B C D Abb. 13: Bindung von Strep-SPG4 und His-SPG4-TTX450 an die Zelloberfläche NGFdifferenzierter Neuroscreen-1 Zellen. Die Zellen wurden für 2 h mit 30 µg/ml Strep-SPG4 (A und B) und His-SPG4-TTX450 (C und D) inkubiert. Es sind Phasenkontrastbilder (A und C) mit entsprechenden Fluoreszenzbildern (B und D) gezeigt. Balken = 10 µm. 13

14 Internalisierung des His-SPG4-TTX450 durch neuronale Zellen Um zu zeigen, dass an der Plasmamembran gebundenes Protein auch internalisiert wurde, wurden dieselben Ansätze mit einem Konfokal-Laser-Scanning Mikroskop untersucht. A B1 B1 B2 Abb. 14: Internalisierung von SPG4-TTX450 durch corticale neuronale Zellen. Die Zellen wurden für 2 h mit 30 µg/ml His-SPG4-TTX450 inkubiert. Es sind ein DIC-Bild (A) und die entsprechenden konfokalen Fluoreszenzbilder (B1 und B2) gezeigt. B2- vergrößerter Ausschnitt von B1. Bild B1 zeigt eine neuronale Zelle mit internalisiertem Fusionprotein (weißer Pfeil), direkt daneben eine Fluoreszenz-negative nicht-neuronale Zelle (A, schwarzer Pfeil). 14

15 A B Abb. 15: Internalisierung von His-SPG4-TTX450 durch Neuroscreen-1 Zellen. Undifferenzierte (A) und NGF-differenzierte Zellen (B) wurden für 2 h mit 30 µg/ml His-SPG4-TTX450 inkubiert. Die Pfeile deuten auf internalisiertes Protein in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Es zeigten sich die typischen vesikulären Strukturen im gesamten Zytoplasma primärer corticaler Neurone (Abb. 14 B1, B2) und der Neuroscreen-1 Zellen (HERREROS et al., 2001). Dies belegt, dass gebundenes Protein auch effektiv internalisiert wird. Es wird durch undifferenzierte Neuroscreen-1 Zellen weniger Protein gebunden und internalisiert als durch NGF-differenzierte Zellen (Abb. 15 A/B) Applikation des His-SPG4-TTX450-Produktes in vivo Es erfolgte die Applikation von ca. 100µg bzw. 200µg His-SPG4-TTX-Protein sowie entsprechende Kontrollen (106 µl PBS) in die Zunge von 21 d alten weiblichen Sprague- Dawley-Ratte. Dazu wurden die Tiere kurzfristig mit mit Ketanest/Faustan betäubt. Nach 24 h wurden die Tiere mit Chloroform betäubt und getötet, die Zunge und Hirn entnommen. Die Zunge wurde in 40 µm Schnitten aufgearbeitet, das Mittelhirn in 12µm Schnittdicke. Abb. 16: Darstellung des internalisierten His-SPG4-TTX-Fusionsproduktes mittels anti His- Antikörper in der Zunge von Sprague-Dawley Tieren 15

16 Abb. 17: Darstellung des im Mittelhirn um den 4. Ventrikel nachweisbaren His-SPG4-TTX450 Fusionsproduktes nach 24h zuvor erfolgter Applikation in die Zunge von 21d alten Sprague-Dawley Ratten. 16