Schlussbericht zur Studienwoche Biologie und Medizin vom März 2013

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1 Schlussbericht zur Studienwoche Biologie und Medizin vom März 2013 Projekt: Zellbiologie: Expression und Reinigung der onkogenen Kinase Abl an der Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, EPFL Teilnehmer: Kevin Geier Betreuer: Sina Reckel, Sandrine Georgeon, Oliver Hantschel EPFL Fragestellung In unserem Projekt untersuchten wir eine Kinase namens Abl und deren Einfluss auf die Krebserzeugung. Kinasen sind Proteine, die Phosphorylierungen machen. Unter einer Phosphorylierung versteht man das umkehrbare Anhängen einer Phosphatgruppe an ein organisches Molekül. Abl ist an vielen zellulären Prozessen beteiligt. Wenn ein Abl-Gen mit einem BCR-Gen fusioniert, entsteht BCR-Abl, besser bekannt als Philadelphia-Chromosom, was zu Leukämie führt. Um die Proteine zu untersuchen, führten wir zwei Experimente durch. Eines mit Säugetierzellen (weisse Blutzellen von Mäusen) und ein zweites mit E. Coli-Bakterien. Aus den Bakterien exprimierten wir Abl und YopH. YopH ist auch ein Protein und löst die Phosphorylierung auf, um die Giftigkeit in den Bakterien zu vermeiden. Vorgehen und Methoden Ich werde zuerst das Vorgehen beim Experiment mit den E. Coli-Bakterien erläutern und anschliessend dasjenige bei den Säugetierzellen. Für das entsprechende Experiment verwendeten wir die DH5a E. Coli-Bakterien, die bereits von unseren Betreuern vorbereitet worden sind. Diese Zellen wurden verwendet, da diese die Eigenschaft besitzen, die DNA schnell sehr oft vermehren zu

2 können. Eine Lösung mit diesen Bakterien wurde zuerst zentrifugiert und anschliessend musste der Überstand entfernt werden. Nun mussten die Plasmide vom Rest getrennt werden. Zuerst wurden dafür die Bakterien zerstört. So erhielt man ein Bakterienlysat. Anschliessend konnten die Plasmide gereinigt werden, um die Plasmide zu erhalten, die die Proteine Abl und YopH enthielten. Die Konzentration der hergestellten Plasmide musste mit einem Gerät, das Nanodrop hiess und an einen Computer angeschlossen war, ermittelt werden. Danach wurden diese Plasmide in BL21 E. Coli-Zellen implantiert. Diese Zellen liess man über Nacht nach Zugabe eines selektiven Antibiotikums bis zu einer optischen Dichte von 1.2 wachsen. Später wurde IPTG hinzugefügt. IPTG ist ein Zucker und macht, dass die Polymerase, die die gewünschten Proteine abliest, sehr schnell abläuft. Anschliessend musste das Medium zentrifugiert und der Überstand entfernt werden. Der Rest wurde verwendet und von diesem wurden die Zellen zerstört, um durch eine Nickel-Affinität-Chromatographie die Abl- Proteine reinigen zu können. Diese Chromatographie gelingt, da jedes Abl-Protein ein tag (Überbleibsel) besitzt. Diese tags binden an Ni 2+ -Ionen. Demnach gibt man Nickelionen zum Bakterienlysat. Dabei binden die Ionen an die Proteine und man kann so die Proteine vom Rest trennen. Nun wurde die Bakterienkonzentration vom Lysat gemessen. Abschliessend mussten die Proteine der Grösse nach mithilfe einer Gelelektrophorese getrennt werden. Bei dieser Methode wanderte eine Mischung von den zu trennenden Proteinen unter Einfluss eines magnetischen Feldes durch ein Gel, welches in einer ionisierenden Pufferlösung liegt. Aufgrund der Grösse der Proteine bewegen sie sich unterschiedlich weit. Die kurzen Proteine wandern weiter als die langen Proteine und waren dann durch eine Färbung sichtbar. Für das Experiment mit den Säugetierzellen waren drei verschiedene Kulturen bereits vorbereitet. Die 3 Kulturen waren eine elterliche-, eine p185- und eine p210-kultur. Die elterliche Kultur war gesund und die beiden anderen Kulturen enthielten BCR-Abl, das heisst beide waren an Leukämie erkrankt (je nach Grösse des Proteins BCR-Abl heisst es p185 oder p210). Als erstes mussten die Zellen geerntet und zentrifugiert werden. Die Überstände wurden wiederum entfernt. Die Zellen, die nach Entfernung der Überstände übrig geblieben waren, wurden mit PBS gewaschen. PBS ist eine Art salziges Wasser und es wurde verwendet, damit die Zellen, die ein bisschen Salz hatten, aussen mehr Salz hatten als sie ihnen enthielten. Damit konnte erreicht werden, dass die Zellen nicht explodieren. Nach einer erneuten Zentrifugierung wurden die Zellen mit einem IP lysis Puffer zerstört und wieder zentrifugiert. Der Überstand, der dann entfernt wurde, enthielt Proteine, DNA, etc. Die Proteinkonzentration des Lysats sollte anschliessend mithilfe des Bradford-Tests ermittelt werden. Dafür wurde dieses mit verschiedenen Lösungen verglichen, dessen Proteinzahl bekannt war. So fand man auch diese Konzentration heraus. Danach mussten die Proteine durch eine

3 Gelelektrophorese der Grösse nach aufgetrennt werden. Anschliessend sollte ein Western Blot für den Proteinnachweis gemacht werden. Es mussten 2 Western Blots gemacht werden, einen für Abl (Proteinexpressionsniveau) und einen für Phospho- Tyrosin (Proteinaktivierungsniveau). Dafür wurden die Proteine vom Gel in eine Membran übertragen und durch Hinzufügen von Antikörpern (von Maus) konnten Abl oder Phospho-Tyrosin gebunden werden. Anschliessend mussten gefärbte Anti- Maus-Antikörper hinzugefügt werden, um die Proteine sichtbar zu machen. Zum Schluss wurden die Membrane mit Abl-Proteinen und Phospho-Tyrosin mit einer Licor-Maschine gescannt. Resultate E. Coli-Bakterien Die Konzentrationen der Abl-Plasmide und der YopH-Plasmide, die am Anfang vom Experiment mit den E. Coli-Bakterien zu ermitteln waren, fielen wie folgt aus: Abl- Plasmid: 57 ng/µl und YopH-Plasmid: 184 ng/µl. Zur Visualisierung der Resultate bei der Proteinexpression bei den E. Coli-.Bakterien nachfolgendes Scanning:

4 absorance at 595 nm Säugetierzellen Die Proteinkonzentrationen der Lysate der elterlichen, der p185- und der p210- Kulturen sahen so aus: y = x R² = protein 15 conc ( g/ l) SAMPLE ID Abs (595nm) c ( g/ L) BaF3 parentals BaF3 p BaF3 p Die Resultate des Anti-Abl Western Blots für BCR-Abl-Lysate und die Anti-Phospho- Tyrosine Western Blots für BCR-Abl-Lysate können der nachfolgenden Abbildung entnommen werden: Anti Phospho-Tyrosin Western Blot Anti Abl Western Blot

5 Diskussion Wir konnten erfolgreich die Proteine in den Säugetierzellen sichtbar machen und die unterschiedlichen Proteine (Abl und BCR-Abl) auf der Membran erkennen. Wie erwartet befand sich in der elterlichen Kultur der Säugetierzellen kein BCR-Abl, das heisst, dass diese gesund waren. In den anderen beiden Kulturen, in denen wir annahmen, dass die Zellen das krebserregende BCR-Abl enthält, konnten wir tatsächlich die Verbindungen finden. Demnach ist uns das Experiment mit den Säugetierzellen ohne grössere Probleme gelungen. Beim Experiment mit den E. Coli-Bakterien hatten wir einige Schwierigkeiten. Wir konnten nicht sehr viel lösliches Abl aufreinigen und das meiste vom Protein war nicht im Überstand nach der Zentrifugation, sondern im Rest am Boden des Gefässes. Es hatte nicht so viel Abl im Eluat, da das YopH-Protein nicht in grossen Mengen ausgedrückt worden ist. Schlussfolgerungen Alle Fragen wurden geklärt und es konnte gezeigt werden, dass, wenn nur das Protein Abl vorhanden ist, dann die Zelle gesund ist. Bindet jedoch das Protein Abl ans BCR, dann entsteht dabei BCR-Abl, was krebserregend ist und zu Leukämie führt. Dank Ein herzliches Dankeschön an die kompetenten Betreuer, die uns nicht nur professionell, sondern auch auf sehr herzliche Art mit Rat und Tat zur Seite gestanden sind. Auch haben sie unsere Neugierde geweckt und es verstanden, uns ein entsprechendes Studium schmackhaft zu machen. Ein ebenso aufrichtiges Dankeschön ist natürlich an die SJf gerichtet, die uns die lehrreiche und supertolle Woche überhaupt ermöglicht hat. Speziell möchte ich mich bei Frau K. Bücheler und Herrn S. Horisberger bedanken, die bei der Auswahl und bei der Schlusspräsentation beteiligt, respektive anwesend waren. Auf ein eventuelles Wiedersehen würde ich mich sehr freuen.

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