Proteinanalytik. Proteineigenschaften Proteinquellen Proteinisolierung Proteinnachweis Proteincharakterisierung

Transkript

1 PROTEINANALYTIK

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3 Proteinanalytik Proteineigenschaften Proteinquellen Proteinisolierung Proteinnachweis Proteincharakterisierung

4 Aminosäuren

5 Proteine Molekulare Eigenschaften Chemische Grundstruktur Größe Säure/Base-Eigenschaften Hydrophilie - Hydrophobizität Biologische Aktivität

6 Strukturmerkmale Primär Sekundär Tertiär Quartär Struktur

7 Strukturmerkmale

8 Nativer Proteinzustand

9 Protein-Denaturierung

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11 Proteinquellen (1) Natürliche Proteinquellen Gewebe vontieren und Pflanzen Extrazelluläre Flüssigkeiten Mikroorganismen (E. coli, Hefe) Individuelle Proteinkonzentration oft gering

12 Proteinquellen (2) Gentechnisch hergestellte Proteine Mikrobielle Systeme (E. coli, Hefe) Klonierung in höheren Systemen (Zell-Linien aus Säugetieren, transgene Tiere, Insektenzellen, Pflanzenzellen) Hohe Proteinkonzentration (Überproduktion) Modifizierung des Proteins?

13 Proteinisolierung (1) Intrazelluläre Proteine: Zelldisruption Abtrennung von unlöslichem Material Extrazelluläre Proteine Zellabtrennung Abtrennung von unlöslichem Material

14 Proteinisolierung (2) Homogenisierung (Gewebe Zellen) Zellaufschluß (Zelle Zellbestandteile) Proteinisolierung und -trennung Fällung, Zentrifugation, Chromatographie Abtrennung von Salzen Dialyse, Ultrafiltration, Gelchromatographie

15 Homogenisierung von Geweben Voraussetzungen für Homogenisierungsmedien: Schutz der Zellen vor osmotischer Lyse Schutz vor Proteasen Erhalt der biologischen Funktion Verhinderung von Aggregation Geringe Zerstörung von Organellen Keine Interferenz mit biologischen Analysen und funktionellen Tests

16 Zellaufschluss Schwache Scherkräfte (bei sehr empfindlichen Zellen, z.b. Leukocyten) Osmolytisches Aufbrechen (z.b. Isolierte Blutzellen) Einfrieren/Auftauen (bei Bakterien) Trocknen (bei Hefen) Entwässerung durch organische Lösungsmittel Mechanische Zerkleinerung (Vibrationszellmühle, Messerhomogenisator, Ultraschall, French- Presse,...)

17 Proteinisolierung (Summary)

18 Proteinlöslichkeit (1)

19 Proteinlöslichkeit (2) Effekt geringer Ionenkonzentration Je geringer die Ionenkonzentration im Lösungsmittel ist, umso eher neigen die Proteine dazu ihre Oberflächenladung gegenseitig durchaggregatbildung zu kompensieren. Große Aggregate fallen aus. Praxis: Verdünnen oder Dialyse gegen Wasser. Bei physiologischer Ionenstärke werden die Ladungen der Proteine durch Salzionen kompensiert

20 Proteinlöslichkeit (3)

21 Proteinlöslichkeit (4)

22 Proteinfällung (1) Salze Organische Lösungsmittel Trichloressigsäure Isolierung des Proteinpräzipitats durch Zentrifugation

23 Abtrennung von Salzen (und hydrophilen Molekülen) Dialyse Ultrafiltration Gelchromatographie Reversed phase-chromatographie

24 Dialyse Entfernung oder Austausch von kleinen Molekülen aus einer Lösung über eine semipermeable Membran Standardverfahren zum Entfernen von (NH4)2SO4 aus Ammoniumsulfatfällungen oder zur Umpufferung von Proteinlösungen für die Säulenchromatographie. Prinzip: Semipermeable Membran, die von Proteinen nicht durchquert werden kann. Anorganische Salze und niedermolekulare Verbindungen können passieren Cut-Off der Membranen (PVDF, Cellulose) von 1-50 kda. Dialyseschlauch muß durch Kochen in 0.1 M NaHCO3/10 mm EDTA und sorgfältiges Spülen rehydratisiert werden (Aufbewahrung in 70% EtOH)

25 Konzentrierung Fällung Ultrafiltration und Diafiltration

26 Proteinstabilisierung (1) Schutz vor Proteasen (biochemischer Abbau) Protease-Inhibitoren (oft als Cocktail") Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Serinproteasen Aprotinin e-amino-n-capronsäure Pepstatin Aspartatproteasen Leupeptin Cysteinproteasen Antipain Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Metalloproteasen

27 Proteinstabilisierung (2) Schutz vor Denaturierung (physikalischer oder chemischer Effekt) Erhaltung des nativen Zustands und der biologischen Aktivität ph-wert (Säure-Basen-Gruppen) Salzkonzentration (physiologisch) Proteinkonzentration (Aggregationen) Detergenzien (hydrophobe Proteine) Reduzierende Agenzien (Mercaptoethanol, Dithiothreitol-DTT)

28 Proteinstabilisierung (3) Hydrophobe Proteine

29 Proteinnachweis (1) Proteinbestimmungsmethoden Biuret-Test Lowry-Test BC-Assay Bradford-Assay UV-Methoden Aktivitätstests einfacher enzymatischer Assay gekoppelter enzymatischer Assay Bindungstests Immunchemische Verfahren ELISA Western-Blot

30 Proteinnachweis (2) Biuret-Reaktion Bicinchoninsäure-Assay Coomassie-Blau/ Bradford-Assay

31 Zentrifugation (1) Physikalisches Prinzip: Trennung nach Größe und Dichte Beschleunigung: B = ω 2. r ω Winkelgeschwindigkeit r.radius Relative Zentrifugalbeschleunigung (RZB): bezogen auf die Erdbeschleunigung RZB = B/ 981 Sedimentationsgeschwindigkeit v (Svedberg-Gleichung) v = D 2.(ρ p -ρ m ).RZB / 18η D Teilchendurchmesser ρ Dichte (Probe/Medium) η Viskosität

32 Zentrifugation (2) Sedimentationskoeffizient s: s = v / rω 2 s ist die Sedimentationsgeschwindigkeit unter geometrisch vorgegebenen Bedingungen des Zentrifugalfeldes. s wird in Svedberg-Einheiten (S)angegeben: 1 S = s

33 Zentrifugationstechniken Differentielle Zentrifugation Ausnützen unterschiedlicher Sedimentationsgeschwindigkeiten im Festwinkelrotor Zonenzentrifugation Selektion durch Einbringen eines flachen Gradienten Isopyknische Zentrifugation Trennung von Teilchen gleicher Größe, aber unterschiedlicher Dichte Dichtegradienten Kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Gradient (CsCl, Sucrose, Polysaccharide, jodierte Aromaten)

34 Zonenzentrifugation

35 Rotoren für die Zentrifugation

36 Dichte und Sedimentationskonstanten von Zellbestandteilen