Versuch 5. Elektrophorese und Proteinblotting. Dr. Alexander S. Mosig. Institut für Biochemie II / Center for Sepsis Control and Care

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1 Versuch 5 Elektrophorese und Proteinblotting Dr. Alexander S. Mosig Institut für Biochemie II / Center for Sepsis Control and Care

2 Theoretische Grundlagen Quantitative Proteinbestimmung Elektrophoresemethoden Proteinblotting Massenspektrometrie von Biomolekülen mit matrix-unterstützter Laserdesorption und ionisation (MALDI) Durchführung Praktikumsversuch Nr.5

3 Quantitative Proteinbestimmung Physikalische Methoden vs. Chemische Methoden

4 Spektroskopische Proteinbestimmungsmethoden

5 Spektroskopische Proteinbestimmungsmethoden

6 Spektroskopische Proteinbestimmungsmethoden

7 Spektroskopische Proteinbestimmungsmethoden

8 Störsubstanzen der Messungen im UV-Bereich

9 Chemische Proteinbestimmung

10 Biuret Komplex mit Peptidbindung Cu 2+ Chemische Proteinbestimmung

11 Biuret Komplex mit Peptidbindung Cu 2+ Chemische Proteinbestimmung FILON Reaktion Cu 2+ à Cu + Cu + Molybdänblau

12 Biuret Komplex mit Peptidbindung Cu 2+ Chemische Proteinbestimmung FILON Reaktion Cu 2+ à Cu + Cu + Molybdänblau LOWRY

13 Biuret Komplex mit Peptidbindung Cu 2+ Chemische Proteinbestimmung FILON Reaktion Cu 2+ à Cu + Cu + Molybdänblau LOWRY BCA Reaktion Aromat. AS mit Cu 2+

14 Chemische Proteinbestimmung Biuret Komplex mit Peptidbindung Cu 2+ Lowry Reaktion Aromat. AS mit Cu 2+ & Cu 1+ mit Folin-Reagens BCA Reaktion Aromat. AS mit Cu 2+ Bradford Komplex mit Proteinen Bindung an basische Seitenketten von AS

15 Vergleich einiger Proteinbestimmungsmethoden

16 Vergleich einiger Proteinbestimmungsmethoden

17 Vergleich einiger Proteinbestimmungsmethoden

18 Vergleich einiger Proteinbestimmungsmethoden

19 Wahl der richtigen Methode bei Proteinbestimmungen Konzentration der Probe? à Empfindlichkeit der Messmethode Menge der Probe? à Verlust durch Messung Störsubstanzen? à Auswahl der Messmethode Stabilität der Probe? à Auswahl der Messmethode Wahl der richtigen Methode hängt von verschiedenen Parametern ab.

20 Elektrophoresemethoden Elektrophorese = griech. Elektron Bernstein ; griech. pherein tragen Wanderung elektrisch geladener Teilchen in einer Lösung oder kolloidalen Lösung unter Einfluss eines elektrischen Feldes.

21 Prinzip der Elektrophorese

22 Ins$tut für Biochemie II Friedrich- Schiller- Universität Jena Elektrophoresemethoden Trägerfreie Elektrophorese - in Lösung ohne Trägermaterial Trägerelektrophorese - in Anwesenheit homogener und inerter Trägermaterialien

23 Gelelektrophoresen Vertikales Elektrophoresesystem Horizontales Elektrophoresesystem Trägermedien: Polyacrylamid (z.b. SDS PAGE) Agarose (z.b. DNA Elektrophorese) Celluloseaccetat (z.b. Serumanalytik)

24 Agarosegele Gelmedien Vorteile ungiftig einfach herzustellen ideal zur Trennung großer Proteine (> 500 kda) Nachteile Elektrodesmose-Effekt niegrige Siebwirkung bei Proteinen < 100 kda starke Hintergrundfärbung

25 Gelmedien Vorteile Agarosegele ungiftig einfach herzustellen ideal zur Trennung großer Proteine (> 500 kda) Polyacrylamidgele sehr stabil keine Elektrodesmose gute Siebwirkung für Vielzahl von Färbemethoden geeignet Nachteile Elektrodesmose-Effekt niegrige Siebwirkung bei Proteinen < 100 kda starke Hintergrundfärbung Monomere toxisch Proteine > 800 kda können wandern nicht in das Gel ein

26 Struktur Agarosegele Gelstrukturen Struktur Polyacrylamidgele

27 Struktur Agarosegele Gelstrukturen Struktur Polyacrylamidgele

28 Struktur Agarosegele Gelstrukturen Struktur Polyacrylamidgele

29 Diskontinuierliche SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Gelelktrophorese)

30 Denaturierung der Proteinen mit Natriumdodecylsulfat und Mercaptoethanol

31 Prinzip der diskontinuierlichen SDS-PAGE

32 Prinzip der diskontinuierlichen SDS-PAGE Isotachophorese

33 Gesetz von Stoke Isotachophorese χ - ph 6.8 Glycin fast ungeladen à Geringe Mobilität ph 8.8 Chlorid-Ionen geladen à Hohe Mobilität +

34 Isotachophorese Fokusierung der Proteine

35 Prinzip der diskontinuierlichen SDS- PAGE Isotachophorese Zonenelektrophorese

36 Prinzip der diskontinuierlichen SDS-PAGE

37 Trägerelektrophorese der Plasmaproteine Agarosegele Celluloseacetat

38 Auswertung der Elektrophorese der Plasmaproteine

39 Auswertung der Elektrophorese der Plasmaproteine

40 Pathobiochemie der Plasmaprotein-Trennung

41 Pathobiochemie der Plasmaprotein-Trennung verminderte Antikörper

42 Plasmaprotein-Trennung Leberinsuffizienz relative Erhöhung der gamma-globuline

43 Plasmaprotein-Trennung Nephrotisches Syndrom Hypalbuminämie reaktive Hyperlipoproteinämie reaktive Erhöhung α2-macroglobulin Hypogammaglobinämie

44 Plasmaprotein-Trennung akute Entzündung Anstieg von C-reaktiven Protein

45 Plasmaprotein-Trennung chronische Entzündung Anstieg von C-reaktiven Protein Anstieg von gamma-globulinen

46 Isoelektrische Fokussierung

47 Ins$tut für Biochemie II Friedrich- Schiller- Universität Jena Isoelektrischer Punkt

48 Ausrichtung des ph-gradienten durch Ampholyte basischer ph saurer ph

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50 Zweidimensionale Elektrophorese 1. Dimension: Isoelektrische Fokusierung

51 Zweidimensionale Elektrophorese 2. Dimension: SDS-PAGE

52 Zweidimensionale Elektrophorese

53 Zweidimensionale Elektrophorese

54 Prinzip der MALDI- TOF- Massenspektrometrie

55 Massenspektrometrische Verfahren zur Identifizierung von Proteinen

56 MALDI-TOF-Spektrum von Trypsin gespaltenem Rinderserumalbumin

57 Versuchsdurchführung Nachweis von Kaninchen- Immunglobulin G SDS-PAGE und Proteinfärbung in Gelen Westernblot und Proteinfärbung auf Blotmembranen Immunreaktion Molekulargewicht- Bestimmung Proteinbilanz der Immun-globulin G- Reinigung Herstellung der Albumin- Eichreihe Proteinbestimmung nach Bennett Bilanz der Proteinreinigung

58 Fließschema Versuchsdurchführung Elektrophorese (SDS-PAGE) Westernblot Proteinfärbung (Coomassie-Blau) Immunreaktion (immunologischer Nachweis von Kaninchen IgG) Molekulargewichtsbestimmung

59 AuEau der Apparatur

60 Bestandteile des Probenpuffers SDS Natriumdodecylsulfat Mercaptoethanol Tris Glycerin Bromphenolblau

61 Ins$tut für Biochemie II Friedrich- Schiller- Universität Jena Struktur von IgG

62 Denaturierung mit SDS, ohne Mercaptoethanol } MW = 170kD Denaturierung mit SDS, mit Mercaptoethanol MW = 60kD MW = 25kD

63 MG-Marker in SDS-Gelen

64 Proteinblotting Prinzipieller Ablauf 1. Trennung von Proteinen des Kaninchen-Serums sowie der Reinigungsfraktionen durch Elektrophorese 2. Transfer der getrennten Proteine aus dem Elektrophorese-Gel auf eine Nitrozellulose-Membran 3. Immunologischer Nachweis von Immunglobulin G (IgG) auf der Membran 4. Ermittlung des Molekulargewichtes des IgG anhand mitgetrennter Proteine bekannten Molekulargewichtes

65 ElektrobloGng Schwamm Filterpapier Gel Blot Membran

66 Westernblot mit Immundetektion

67 Prinzip des ECL Western - Blotting

68 Belichtung - Entwicklung

69 Filmbelichtung schwere / leichte Kette

70 Coomassie-Brilliant-Blau Färbung Prinzipieller Ablauf: Trennung von Proteinen des Kaninchen-Serums sowie der Reinigungsfraktionen durch Elektrophorese. Fixierung und Färbung aller Proteine im Elektrophorese-Gel Entfärbung des Gels Übersicht über den Verlauf der Proteintrennung

71 Abschätzung der molaren Masse eines Proteins

72 Coomassie-Färbung eines SDS-Gels Schwere Ketten Leichte Ketten

73 Proteinfärbung in Gelen

74 Proteinfärbung auf Blots

75 Proteinfärbung auf Blots

76 Bilanz der IgG-Reinigung Bestimmung der Wiederfindung des Ausgangsmaterials in den verschiedenen erhaltenen Fraktionen mit dem Lowry-Test: Wie hoch war der Anteil des IgG am Serumprotein? - Ggf. Zuwenig / Zuviel - Warum?

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