Das Potenzial künstlich erzeugter Stammzellen in Forschung und Medizin

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1 Das Potenzial künstlich erzeugter Stammzellen in Forschung und Medizin Hans R. Schöler Max Planck Institute for Molecular Biomedicine Department of Cell and Developmental Biology Münster, Germany 10. November, 2012 Münster

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3 Stammzelltherapien könnten vielen Menschen helfen Aus: Patients' voices: the powerful sound in the stem cell debate. D. Perry. Science 287, 1423 (2000).

4 Das Dilemma humaner ES Forschung

5 Pluripotente Alleskönnerzellen Befruchtung Einnistung (Tag 6) Alleskönner-Stammzellen im Embryo Kultivierung Embryonale Stammzellen in Kultur (Alleskönner-Stammzellen)

6 Pluripotente Alleskönnerzellen Totipotent Fertilized egg Embryonic stem cells Pluripotent All-rounders Pluripotent stem cells 5-days old embryo Multipotent Specialists Adult stem cells Unipotent Differentiated cells Skin, neurons Muscle, blood Pancreas, lung Germ cells

7 In vitro Differenzierung von pluripotenten Zellen in Kardiomyozyten

8 Das Leben beginnt - auf alle Fälle - in einer Zelle. Doch manchmal endet es - bei Strolchen - in einer solchen.

9 Freitag, 8. Juni 2007, Nr. 130 / Seite 33

10 Reprogrammierung von Körperzellen August 2006 Viruses with reprogramming factors Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors Kazutoshi Takahashi 1 and Shinya Yamanaka 1,2, * 1 Department of Stem Cell Biology, Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto , Japan 2 CREST, Japan Science and Technology Agency, Kawaguchi , Japan *Contact: DOI /j.cell Oct4 Sox2 Klf4 c-myc SUMMARY Differentiated cells can be reprogrammed to an embryonic-like state by transfer of nuclear contents into oocytes or by fusion with embryonic stem (ES) cells. Little is known about factors that induce this reprogramming. Here, we demonstrate induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic or adult fibroblasts by introducing four factors, Oct3/4, Sox2, c-myc, and Klf4, under ES cell culture conditions. Unexpectedly, Nanog was dispensable. These cells, which we designated ips (induced pluripotent stem) cells, exhibit the morphology and growth properties of ES cells and express ES cell marker genes. Subcutaneous transplantation of ips cells into nude mice resulted in tumors containing a variety of tissues from all three germ layers. Following injection into blastocysts, ips cells contributed to mouse embryonic development. These data demonstrate that pluripotent stem cells can be directly generated from fibroblast cultures by the addition of only a few defined factors. INTRODUCTION or by fusion with ES cells (Cowan et al., 2005; Tada et al., 2001), indicating that unfertilized eggs and ES cells contain factors that can confer totipotency or pluripotency to somatic cells. We hypothesized that the factors that play important roles in the maintenance of ES cell identity also play pivotal roles in the induction of pluripotency in somatic cells. Several transcription factors, including Oct3/4 (Nichols et al., 1998; Niwa et al., 2000), Sox2 (Avilion et al., 2003), and Nanog (Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003), function in the maintenance of pluripotency in both early embryos and ES cells. Several genes that are frequently upregulated in tumors, such as Stat3 (Matsuda et al., 1999; Niwa et al., 1998), E-Ras (Takahashi et al., 2003), c-myc (Cartwright et al., 2005), Klf4 (Li et al., 2005), and b-catenin (Kielman et al., 2002; Sato et al., 2004), have been shown to contribute to the long-term maintenance of the ES cell phenotype and the rapid proliferation of ES cells in culture. In addition, we have identified several other genes that are specifically expressed in ES cells (Maruyama et al., 2005; Mitsui et al., 2003). In this study, we examined whether these factors could induce pluripotency in somatic cells. By combining four selected factors, we were able to generate pluripotent cells, which we call induced pluripotent stem (ips) cells, directly from mouse embryonic or adult fibroblast cultures. Shinya Yamanaka Mouse fibroblast Embryonic stem (ES) cells, which are derived from the inner cell mass of mammalian blastocysts, have the ability to grow indefinitely while maintaining pluripotency and the ability to differentiate into cells of all three germ layers (Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981). Human ES cells might be used to treat a host of diseases, such as Parkinson s disease, spinal cord injury, and diabetes (Thomson induced et al., 1998). However, pluripotent there are ethical difficulties regarding the use of human embryos, as well as the problem of tissue rejection following transplantation in patients. One way to circumvent these issues is the generation of plu- stem cell ripotent cells directly from the patients own cells. Somatic cells can be reprogrammed by transferring their nuclear contents into oocytes (Wilmut et al., 1997) ips CELL 2843 RESULTS We selected 24 genes as candidates for factors that induce pluripotency in somatic cells, based on our hypothesis that such factors also play pivotal roles in the maintenance of ES cell identity (see Table S1 in the Supplemental Data available with this article online). For b-catenin, c-myc, and Stat3, we used active forms, S33Y-b-catenin (Sadot et al., 2002), T58A-c-Myc (Chang et al., 2000), and Stat3-C (Bromberg et al., 1999), respectively. Because of the reported negative effect of Grb2 on pluripotency (Burdon et al., 1999; Cheng et al., 1998), we included its dominant-negative mutant Grb2DSH2 (Miyamoto et al., 2004) as 1 of the 24 candidates. Cell 126, 1 14, August 25, 2006 ª2006 Elsevier Inc. 1

11 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2012 John B. Gurdon John B. Gurdon eliminated the nucleus of a frog egg cell (1) and replaced it with the nucleus from a specialised cell taken from a tadpole (2). The modified egg developed into a normal tadpole (3). Subsequent nuclear transfer experiments have generated cloned mammals (4). Shinya Yamanaka Shinya Yamanaka studied genes that are important for stem cell function. When he transferred four such genes (1) into cells taken from the skin (2), they were reprogrammed into pluripotent stem cells (3) that could develop into all cell types of an adult mouse. He named these cells induced pluripotent stem (ips) cells. ips cells can now be generated from humans, including patients with disease. Mature cells including nerve, heart and liver cells can be derived from these ips cells, thereby allowing scientists to study disease mechanisms in new ways The Nobel Committee for Physiology or Medicine The Nobel Prize and the Nobel Prize medal design mark are registered trademarks of the Nobel Foundation Illustration and layout: Mattias Karlén

12 eine Waschmaschine für Shinya Yamanaka und 400 Mio $ für 10 Jahre 2

13 Embryonale Stammzellen und reprogrammierte Zellen im Vergleich Befruchtung Einnistung (Tag 6) Alleskönner-Stammzellen im Embryo Kultivierung Künstlich hergestellte Alleskönner-Stammzellen in Kultur Embryonale Stammzellen in Kultur (Alleskönner-Stammzellen) Reprogrammierung Körperzellen

14 induzierte pluripotente Stammzellen - ips Zellen Gesellschaftlich akzeptierte Lösung mit großem Potential für neue Therapien Oct4 Sox2 Klf4 c-myc Reprogrammierungsfaktoren Embryo (5 Tage alt) Befruchtung Pluripotente Stammzellen im Embryo Reprogrammierung Hautzelle Embryonale Stammzellen in Kultur künstlich hergestellte Stammzellen Nervenzellen induzierte pluripotente Stammzellen ips-zellen Leberzellen Herzmuskelzellen

15 Dies sind embryonale Stammzellen. Aber sind sie von der Maus oder vom Menschen?

16 Morphologie von pluripotenten Stammzellen

17 Morphologie von ES und ips Kolonien von einem Embryo abgeleitet von einer Körperzelle ES colony mouse ips colony SEM

18 Reprogrammierung von Körperzellen Februar 2009 Oct4 Sox2 Klf4 c-myc induzierte Alleskönner WN Nervenzelle der Maus induzierte pluripotente Stammzelle ips

19 Die abnehmende Potenz der Zellen ist nun überwunden Alleskönner- Stammzellen Ausgereifte Zellen Hautzelle Leberzelle Herzmuskelzelle

20 Süddeutsche Zeitung WISSEN Februar 2005 Yamanaka Cocktail August 2006 Oct4 Sox2 Klf4 c-myc

21 KLF4 cmyc Sox2 Oct4 Lucas Cranach 1546: Der Jungbrunnen

22 Direkte Reprogramming von Hautzellen in Neurale Stammzellen durch Faktoren Brn4 Sox2 Klf4 c-myc

23 Direkte Reprogramming von Hautzellen in Neurale Stammzellen durch Faktoren bislang mehr als 130 Passagen stabil in Kultur gehalten

24 in vitro Differenzierungs-Potential von inscs

25 Electrophysiologische Eigenschaften von Kontroll NSC- und insc-abgeleiteten Neuronen Representative voltage-clamp recordings in response to increasing voltage pulses from neurons derived from control NSCs, 5F inscs, and 4F inscs after 7 16 days of differentiation. Insets represent higher magnification of sodium currents. Both single and multiple action potentials were detected in neurons derived from control NSCs, 5F inscs, and 4F inscs.

26 In vivo Transplantation von inscs The transplanted inscs showed differentiation into neurons (GFP+/Tuj1+/Dcx+) astrocytes (GFP+/GFAP+/NG2+) oligodendrocytes (GFP+/S100ß+/Olig2+) immunohistochemistry

27 In vivo Transplantation von inscs Representative immunofluorescence images of differentiated control NCS, 4F inscs, and 5F NSCs after of differentiation. All three NSC types behaved similarly in spontaneous differentiation behavior and differentiated into all major neuronal subtypes, namely GABAergic and glutamatergic neurons, ChAT+ cholinergic and TH+ dopaminergic neurons (except that 4F inscs did not differentiate into TH+ neurons). Dotted VGlut1 expression in proximity of Tuj1+ nerve fibres suggested morphological synapse formation. ChAT, choline acetyltransferase; TH, tyrosine hydroxylase; Scale bars, 50 μm and 20 μm (lowermost panel)

28 Die abnehmende Potenz der Zellen ist nun überwunden Alleskönner- Stammzellen Nerven- Stammzellen Vielkönner- Stammzellen Ausgereifte Zellen Hautzellen Leberzellen Nervenzellen

29 Regeneration of an Organ

30 Mögliche Anwendungen für ips-zellen Patienten-spezifische pluripotente Stammzellen für Transplantation Erforschung von Krankheitsaspekten in Kultur ips-zellen Entwicklung neuer Medikamente

31 Altes Gesicht - Junge DNA?

32 Leider nur ein Traum: denn unsere Erbsubstanz altert Körperzelle ips-zelle Daher hätten die ips-zellen alte DNA

33 Unsere Erbsubstanz kann nicht verjüngt werden Mutationsrate: tatsächlicher Anstieg Mutationsrate: linearer Anstieg Tatsächlicher Anstieg der Krebserkrankungen Ende der Garantie Alter Aus: Somatic cell mutations: Can they provide a link between aging and cancer? M.S. Turker. Mech. Ageing Dev.,117, 1-19 (2000)

34 Stammzellen des Nabelschnurbluts Nabelschnur Klemme Die DNA von Stammzellen des Nabelschnurbluts ist sehr jung Oktober 2009

35 Mögliche Quelle für ips Zellen: Nabelschnur Blut Reprogramming without viruses stem cells in cord blood ips HLA-Class I, II cord blood stem cell bank Immune-compatible ips bank

36 Mögliche Anwendungen für ips-zellen Dies ist möglich mit ips-zellen, eher nicht mit ES-Zellen Erforschung von Krankheitsaspekten in Kultur ips-zellen Entwicklung neuer Medikamente mit Krankheitsmodellen

37 Modellierung von Krankheiten Biopsie Hautzellen Induktion Alleskönner Kultur Krankheitsentstehung in Kultur untersuchen Medikamente an kranken Zellen testen Ausgereifte Körperzellen

38 Mögliche Einsatzbereiche der ips-zellen Patienten-spezifische pluripotente Stammzellen für Transplantation Erforschung von Krankheitsaspekten in Kultur Ein Beispiel einer Krankheit, die wir in der Kulturschale untersuchen: Parkinson ips-zellen Entwicklung neuer Medikamente

39 Parkinson Die Leitsymptome (auch Kardinal- oder Kernsymptome genannt) sind Rigor (Muskelstarre), Bradykinese (verlangsamte Bewegungen), welche bis hin zu Akinese (Bewegungslosigkeit) führen kann, Tremor (Muskelzittern) sowie posturale Instabilität (Haltungsinstabilität).

40 Parkinson ips Zellen

41 Parkinson ips Zellen Krankes Gen Gesundes Gen Gen Reparatur Gesundes Gen Gesundes Gen

42 Nur isogene Linien stellen richtige Kontrollen dar Height C2 L2.3 L2.3GC L1.1Mut L1.1GC2 C1.1 L2.2Mut L2.2GC repar. Kranke Gesunde Zellen Zellen Kranke Zellen repar. Gesunde Zellen Daher würden uns hier humane ES Zellen gar nicht nützen Humane ES Zellen sind aber wichtig, um Protokolle zu entwickeln. z.b.: Wie kann man Nervenzellen in der Kulturschale erhalten?

43 Parkinson ips Zellen umgewandelt in Nervenzellen Kranke Zellen Gesunde Zellen Peter Reinhardt

44 Eine Reihe von Krankheiten, die wir in der Kulturschale untersuchen und wo wir bereits versuchen Vorläufer Medikamente zu entwickeln Eine gemeinsame Pathologie: Chronische Aktivierung von Microglia Zellen

45 Mögliche Anwendungen für ips-zellen Dies ist möglich mit ips-zellen, eher nicht mit ES-Zellen Erforschung von Krankheitsaspekten in Kultur ips-zellen Entwicklung neuer Medikamente mit Krankheitsmodellen Susanne Höing Jared Sterneckert

46

47 Eine gemeinsame Pathologie: Chronische Aktivierung von Microglia Zellen Alzheimer ALS HIV

48 Amyotrophe Lateralsklerose - ALS Lou-Gehrig-Syndrom Abschiedszeremonie im Yankees-Stadium Juli 4, 1939 Hier wusste er schon, dass er krank ist. Lou Gehrig ( )... today I consider myself the luckiest man on the face of this earth.

49 Amyotrophe Lateralsklerose - ALS Nervenzelle Irreversible Schädigung der Bewegungs-Nervenzellen Normal Muskel betroffene Nervenzelle zunehmende Lähmung, Muskelschwund, und Spastik ALS geschwächter Muskel Gang-, Sprech- und Schluckstörungen Mittleres Erkrankungsalter Jahre, Überlebenszeit 3-5 Jahre Sogenannte Seltene Erkrankung (1-3 Neuerkrankungen auf /Jahr) Unheilbar

50 ALS besser verstehen Die Bestandteile Motoneurone Astrozyten Steuern die Muskeln Unterstützen die Nervenzellen Mikroglia Immun- Abwehrzellen des Gehirns

51 ALS besser verstehen Die in vitro Test- Situa3on Motoneurone Astrozyten Steuern die Muskeln Unterstützen die Nervenzellen Petrischale

52 ALS besser verstehen Die in vitro Test- Situa3on Motoneurone Astrozyten Mikroglia Steuern die Muskeln Unterstützen die Nervenzellen Immun- Abwehrzellen des Gehirns Chronisch ak3vierte Mikroglia greifen die Motoneurone an Petrischale

53 ALS besser verstehen Die in vitro Test- Situa3on Motoneurone Astrozyten Mikroglia Steuern die Muskeln Unterstützen die Nervenzellen Immunabwehr im Gehirn Chronisch ak3vierte Mikroglia greifen die Motoneurone an Petrischale

54 ALS besser verstehen Die in vitro Test- Situa3on Vor der Ak4vierung normal Nach der Ak4vierung krank

55 ALS besser verstehen Die in vitro Test- Situa3on Motoneurone Astrozyten Mikroglia Small molecules Steuern die Muskeln Unterstützen die Nervenzellen Immunabwehr im Gehirn Kleine Substanzen Suche nach small molecules, die Degenera3on verhindern Petrischale

56 Validierung Anfrage von F. Hoffmann- La Roche Ltd. Pharma Partnering 4070 Basel, Switzerland Quelle: transkript 11/2012 9

57 Volkskrankheiten Seltene Krankheiten Engl.: orphan disease Gehirn Herz-Kreislauf Neurologische Erkrankungen (z.b. Parkinson-Krankheit) Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z.b. Herzinfarkt) Diabetes Typ I (Zuckerkrankheit) Bauchspeicheldrüse zum Beispiel: Hereditäres Angioödem (HAE) kongenitales QT-Syndrom Osteogenesis imperfecta (Glasknochen) Metachromatische Leukodystrophie (MLD) Mukoviszidose Neuronale Ceroid Lipofuszinose (NCL) Morbus Wilson Leber Lebererkrankungen gesunde ips Zelllinien: Herzmuskelzellen Leberzellen In vitro Toxikologietests Etablierte ips-krankheitszelllinien: zum Beispiel: Muskeldystrophie Typ Duchenne Down Syndrom Parkinson-Krankheit Diabetes Typ I Swachman-Bodian-Diamond Syndrom Chorea Huntington Amyotrophe Lateralsklerose

58 CARE Center for Advanced Regenera;ve Engineering...eine technologische Lei;dee setzt Impulse. 58

59 WN

60 MPI CARE (in Planung) Google Earth

61 Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin Münster

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