ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551

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1 Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: Website: M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 ELISAKit für die quantitative Bestimmung humaner IgGSubklassen im Serum (de) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL de Antikörper gegen Schwarz Puffer Kalibrator Konjugat Kontrolle DIL GREEN HRP HUM HO MOU de Verdünnung Grün Meerettichperoxidase Human Wasserstoffperoxid Maus RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS de Rot Plattenabdeckung Konzentrat Stopp Subklassen Substrat WASH WELL YELLOW de Waschschritt Vertiefungen Gelb Bereich ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS

2 de I. EINFÜHRUNG Humanes IgG umfasst vier Subklassen: IgG, IgG, IgG und IgG. Die biochemischen Merkmale der IgGSubklassen sind ausführlich beschrieben (5). Die Unterschiede zwischen den IgGSubklassen spiegeln sich in mehreren biologisch wichtigen Funktionen wider, darunter bei der Antigenerkennung, Komplementaktivierung und der Bindung an Zelloberflächenrezeptoren. Viele Studien haben gezeigt, dass Anomalien des Serumspiegels der IgGSubklassen mit verschiedenen Krankheitszuständen in Zusammenhang stehen. Besonders der Zusammenhang eines selektiven Subklasse IgGMangels und einer erhöhten Neigung zu viralen oder bakteriellen Infektionen ist hinreichend dokumentiert (, 5). Bei Patienten mit rezidivierenden Infektionen der oberen und unteren Atemwege wurden niedrige IgG oder IgGSerumspiegel festgestellt. Andere fanden einen Zusammenhang zwischen sehr niedrigen Konzentrationen an IgG im Serum und rezidivierenden sinopulmonalen Infektionen (). Anomalien des Serumspiegels von IgGSubklassen wurden auch bei Autoimmunerkrankungen, neurologischen Störungen und bei HIVInfektionen () beobachtet. II. TECHNISCHES PRINZIP Bei dem PeliClass ELISAKit für humane Subklassen handelt es sich um einen EnzymImmunoassay des Sandwich Typs. Der Kit enthält MikrowellStrips, die mit hoch aviden monoklonalen Antikörpern beschichtet sind, von denen jeder für eine der IgGSubklassen des Menschen spezifisch ist. Proben, Kalibrator und Kontrollseren werden in den jeweils zugewiesenen Vertiefungen inkubiert. Die zu bestimmende IgGSubklasse bindet an die feste Phase und ungebundenes IgG wird durch Waschen entfernt. Als Nächstes wird peroxidasekonjugiertes AntihumanIgGAntiserum in jede Vertiefung gegeben und ungebundenes Konjugat wird durch Waschen entfernt. Nach der Inkubation mit Substratlösung (ABTS) und HO wird die Reaktion mit einem sauren Puffer gestoppt. Das grün gefärbte Reaktionsprodukt kann durch Absorption gemessen und die Konzentration der IgGSubklasse in der Probe relativ zu den Werten einer Referenzkurve berechnet werden. Zur Überprüfung der Validität der Kalibrationskurven und der Genauigkeit der IgGSubklassenbestimmung wird IgG Subklassenkontrollserum mitgeführt. Der IgGSubklassenspiegel im Kalibrator/in den Kalibratoren wurde mithilfe eines Kalibrators bestimmt, der aus der WHOReferenzpräparation 7/97 stammt. Es wurden die empfohlenen Zielwerte von 5,0 g/l für IgG,, g/l für IgG, 0, g/l für IgG und 0,5 g/l für IgG verwendet (7). III. AUFBEWAHRUNG UND STABILITÄT Der PeliClass ELISAKit für humane Subklassen sollte aufrecht bei 8 C gelagert werden. Er kann bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum verwendet werden. Bei Aufbewahrung bei 8 C sind alle Komponenten nach dem Öffnen Woche stabil. Die Transportbedingungen können von den Aufbewahrungsbedingungen abweichen. IV. INHALT DES KITS Beachten Sie dazu bitte die Tabelle am Anfang dieser Packungsbeilage. Der PeliClass ELISAKit für humane Subklassen enthält ausreichend Reagenzien für 8 Tests jeder Subklasse, einschließlich Kalibratoren, Kontrollen und Leerwerte. Die monoklonalen Antikörper wurden säulenchromatografisch (Ionenaustausch und Affinitätschromatografie) aus Gewebekulturmedium gereinigt. Bei dem Kalibrator und den Kontrollen handelt es sich um flüssiges Humanserum. V. ZUSÄTZLICH ERFORDERLICHES MATERIAL Destilliertes Wasser zum Verdünnen der Wasch, Verdünnungs und Substratpuffer. Pipettierhilfen zur genauen Übertragung der Volumina. Ein Inkubator (7 ± C). Ein standardmäßiger ELISAWasher bzw. eine Plastikspritzflasche mit einem Volumen von 500 ml zum automatischen bzw. manuellen Waschen der Strips. Ein standardmäßiger ELISAReader zum Messen der Absorption bei nm oder 05 nm. Logarithmuspapier. VI. HANDHABUNG DER PROBEN Es können nur Serumproben getestet werden. Die Proben sollten so frisch wie möglich bzw. tiefgefroren gelagert sein. Die Proben sollten vor dem Gebrauch manuell verdünnt werden (siehe VII ASSAYPROTOKOLL). VII. ASSAYPROTOKOLL Alle Reagenzien Raumtemperatur (85 C) annehmen lassen und gründlich mischen. Blasen oder Schaumbildung vermeiden. Es wird empfohlen, alle Proben, Kontroll und Kalibratorverdünnungen in zweifacher Ausführung zu testen.. MIKROTITERPLATTE Der PeliClass ELISAKit für humane IgG Subklassen ist so flexibel, dass die Platten aufgeteilt und zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen werden können. Vor dem Öffnen des Plastikbeutels sollten Sie die Anzahl der Strips zur Testung der gewünschten Anzahl von Proben bestimmen zuzüglich Vertiefungen zur Testung von Kalibratoren, Kontrollen und Leerwerten in zweifacher Ausführung. Strips, die nicht verwendet werden, werden aus dem Rahmen genommen und in dem Plastikbeutel mit dem Antikondensationsmittel bei 8 C aufbewahrt.. PUFFERHERSTELLUNG Waschpuffer: Zur Herstellung des Waschpuffers wird der gesamte Inhalt der Flasche mit Waschpufferkonzentrat zu 950 ml destilliertem Wasser gegeben. Der verdünnte Waschpuffer muss bei 8 C aufbewahrt werden und bleibt Woche lang stabil. Hinweis: Der konzentrierte Puffer kann Salzkristalle aufweisen. Vor der Herstellung des Puffers mit Arbeitskonzentration sollte der konzentrierte Puffer daher KURZ auf 7 C erwärmt werden, um die Kristalle aufzulösen. Verdünnungspuffer: Es wird die erforderliche Menge des Verdünnungspuffers berechnet (es werden etwa ml unverdünnter Puffer pro Mikrowellstrip benötigt) und eine Lösung mit Arbeitskonzentration hergestellt, indem der Puffer 0fach in destilliertem Wasser verdünnt wird.

3 . HERSTELLUNG VON KALIBRATOR UND KONTROLLSEREN Konzentrationsangaben sind in Tabelle und des beigefügten Informationsfaltblattes enthalten. Kalibrator: (Siehe Tabelle des beigefügten Informationsfaltblatts) Beschriften Sie ein 0 mlröhrchen mit :500 und acht ml Röhrchen mit Kal bis Kal8. Pipettieren Sie,99 ml Verdünnungspuffer in das 0 mlröhrchen und geben Sie 0 µl des Kalibratorserums hinzu (Ausgangsverdünnung :500). Pipettieren Sie,9 ml Verdünnungspuffer in das mit Kal beschriftete Röhrchen und jeweils,0 ml in die mit Kal bis Kal8 beschrifteten Röhrchen. Pipettieren Sie 00 µl des :500 verdünnten Kalibrators in das Röhrchen Kal und stellen Sie von dem Inhalt dieses Röhrchens eine Reihe von sieben zweifachen Verdünnungen her, indem Sie jeweils,0 ml der vorhergehenden Verdünnung in das nächste Kal Röhrchen geben. Wählen Sie für jede IgGSubklasse die entsprechende Reihe von Kalibratorverdünnungen: IgG : : ; IgG, IgG und IgG :0.000 : Kontrolle: Beschriften Sie ein Röhrchen mit :500 und zwei mlröhrchen mit :0.000 (für IgG, und ) bzw. :0.000 (für IgG). Pipettieren Sie in das mit :500 beschriftete Röhrchen,99 ml Verdünnungspuffer und 0 µl Kontrollserum. Pipettieren Sie in das mit :0.000 beschriftete Röhrchen 885 µl Verdünnungspuffer und 5µL der Verdünnung :500. Pipettieren Sie in das mit :0.000 beschriftete Röhrchen 875 µl Verdünnungspuffer und 5 µl der Verdünnung : Bereiten Sie ein mlröhrchen mit ml Verdünnungspuffer als Leerwert vor.. VORBEREITUNG DER PROBEN Verdünnen Sie die Proben mit Verdünnungspuffer und gehen Sie dabei nach dem gleichen Protokoll wie für das Kontrollserum vor. Werden Ergebnisse erhalten, die außerhalb der angegebenen Bereiche liegen (siehe Tabelle auf dem beigefügten Informationsfaltblatt), muss der Test mit einer anderen Probenverdünnung wiederholt werden. 5. ERSTER WASCHSCHRITT Waschen Sie die benötigten Mikrowells in dem Rahmen viermal mit Waschpuffer. Wenn Sie manuell waschen, füllen Sie die Vertiefungen (> 00 µl) mit Waschpuffer und entfernen den Puffer danach wieder; wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Nach dem letzten Waschschritt sollten die Vertiefungen keine Flüssigkeit mehr enthalten. Die darauf folgenden Reagenzien sollten nun sofort zugegeben werden; lassen Sie die Vertiefungen nicht für längere Zeit trocken stehen.. ERSTER INKUBATIONSSCHRITT Geben Sie 00 µl der verdünnten Kalibratoren, Kontrollen, Proben und Leerwerte in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Decken Sie die Platte mit Haftfolie ab und tippen Sie vorsichtig einige Sekunden lang an den Rand der Mikrotiterplatte, um den Inhalt der Vertiefungen zu mischen. Stunde lang bei 7 C inkubieren. Vor dem nächsten Waschschritt muss das Reagenz für die nächste Inkubation wie in Schritt 8 beschrieben hergestellt werden. 7. ZWEITER WASCHSCHRITT Aspirieren Sie den Überstand aus den Vertiefungen und waschen Sie die Platte wie in Schritt 5 beschrieben. 8. INKUBATION MIT HRPKONJUGIERTEM ANTIKÖRPER GEGEN HUMANES IgG Verdünnen Sie das Konjugat :500, indem Sie 0µL des Konjugats zu,97 ml Verdünnungspuffer geben. Verdünnen Sie das Konjugat weiter wie folgt: Auf :000, indem Sie, ml der :500Verdünnung zu,0 ml Verdünnungspuffer geben. Auf :000, indem Sie,0 ml der :500Verdünnung zu,0 ml Verdünnungspuffer geben. Auf :000, indem Sie,5 ml der :500Verdünnung zu,5 ml Verdünnungspuffer geben. Zugabe von: 00 µl der :500Verdünnung zu den AntiIgGMikrowellstrips; 00 µl der :000Verdünnung zu den AntiIgGMikrowellstrips; 00 µl der :000Verdünnung zu den AntiIgGMikrowellstrips; 00 µl der :000Verdünnung zu den AntiIgGMikrowellstrips; Decken Sie die Platte mit Haftfolie ab und tippen Sie vorsichtig einige Sekunden lang an den Rand der Mikrotiterplatte, um den Inhalt der Vertiefungen zu mischen. Stunde lang bei 7 C inkubieren. Vor dem nächsten Waschschritt muss das Reagenz für die nächste Inkubation wie in Schritt 0 beschrieben hergestellt werden. 9. DRITTER WASCHSCHRITT Aspirieren Sie den Überstand aus den Vertiefungen und waschen Sie die Platte wie in Schritt 5 beschrieben. 0. INKUBATION MIT ABTSSUBSTRAT Berechnen Sie die Menge an Substratlösung (es werden ca. 0,9 ml pro Mikrowellstrip benötigt). Geben Sie das Äquivalent von 00 µl Wasserstoffperoxidkonzentrat und 00 µl ABTSKonzentration zu 0 ml Substratpuffer mit Arbeitskonzentration ( ml Substratkonzentrat + 8 ml destilliertes Wasser). Geben Sie jeweils 00 µl der Substratlösung in alle Vertiefungen. Tippen Sie vorsichtig einige Sekunden lang an den Rand der Mikrotiterplatte, um den Inhalt der Vertiefungen zu mischen. 0 Minuten bei Raumtemperatur (85 C) inkubieren.. ANHALTEN DER ENZYMATISCHEN REAKTION Geben Sie jeweils 50 µl der StoppLösung in alle Vertiefungen.. PLATTENMESSUNG Messen Sie die Platte innerhalb von Stunde in einem ELISAReader bei (bevorzugt) oder 05 nm. VIII. ERGEBNISSE UND DATENAUSWERTUNG Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei (bevorzugt) oder 05 nm und ermitteln Sie den Mittelwert aus den Doppelbestimmungen. Die Duplikate der Proben sollten nicht mehr als 5% vom Mittelwert abweichen. Ist die Abweichung größer, sollte der Test wiederholt werden. Tragen Sie auf Logarithmuspapier die Absorptionswerte der Kalibratoren auf der YAchse und die entsprechenden Subklassenkonzentrationen in ng/ml auf der XAchse auf und zeichnen Sie eine Kurve mit der besten Anpassung. Die Konzentrationen der IgGSubklassen im Kontrollserum sollten innerhalb der in Tabelle des beigefügten Informationsfaltblatts angegebenen Bereiche liegen. Interpolieren Sie auf der Referenzkurve die mittlere Absorption einer jeden Probe. Testproben mit einer mittleren Absorption außerhalb des Bereichs der Verdünnungen der Referenzkurve sollten entsprechend weiterverdünnt werden. Zur Evaluierung der Konzentrationen der IgGSubklassen in einer Probe wird die erhaltene Konzentration mit den Normwerten für IgGSubklassen verglichen (siehe X REFERENZBEREICHE).

4 IX. ASSAYMESSBEREICHE Die spezifischen AssayMessbereiche des Kits sind Tabelle des beigefügten Informationsfaltblattes zu entnehmen. X. REFERENZBEREICHE Referenzbereiche (g/l) für die IgGSubklassen in den Serumproben gesunder Kaukasier (8). Für andere Populationen müssen gesonderte Referenzbereiche ermittelt werden. Alter IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE Reproduzierbarkeit IgGSubklassenkonzentration IgG IgG IgG IgG IntraAssayVariation (%) InterAssayVariation (%) 7 7 b Vergleich des PeliClass Kits für humane IgGSubklassen mit dem Test nach Mancini. Die Konzentrationen von IgG, IgG, IgG und IgG in den Seren wurden in einem ELISAAssay bestimmt und mit den entsprechenden, nach Mancini erhaltenen Werten verglichen. Es wurden die folgenden Korrelationen etabliert: IgGSubklasse lineare Regressionslinie Korrelation IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Hinweis: Bei in Zusammenhang mit spezifischen Leistungsmerkmalen des Tests angegebenen Werten handelt es sich um typische Ergebnisse und nicht um Spezifikationen für diesen Kit. XII. EINSCHRÄNKUNGEN. Der Anwender sollte mit ELISAAssays und dem Testverfahren vertraut sein.. Es sollten keine übermäßig hämolysierten oder lipämischen Proben verwendet werden. Bei Proben mit Rheumafaktor, einem hohen Bilirubinspiegel oder anderen zirkulierenden Immunkomplexen kann es zu unerwarteten Ergebnissen kommen. Solche Proben sollten mit einem anderen Verfahren analysiert werden.. Proben, bei denen die Ergebnisse außerhalb des Messbereichs liegen, z.b. im Falle von Paraproteinen, sollten in einer anderen Verdünnung noch einmal getestet werden.. Der Befund eines verringerten Spiegels einer IgGSubklasse ist in keinem Fall als endgültige Diagnose aufzufassen, sondern vielmehr als Anzeichen für eine Störung des Immunsystems, die einer weitergehenden diagnostischen Untersuchung bedarf. 5. Es sollten stets Kontrollseren mitgeführt werden, um die Validität der Kalibrationskurven zu prüfen. Befindet sich die Kontrolle nicht im gültigen Bereich, sind die Ergebnisse der Proben nicht zuverlässig. Der Test sollte dann wiederholt werden.. Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen sind nicht untereinander austauschbar. 7. Reste von Reagenzien (z.b. Todvolumen) dürfen nicht mit dem Inhalt frisch geöffneter Fläschchen gemischt werden. 8. Verschlüsse und Fläschchen sind nicht untereinander austauschbar. Verschlüsse sollten wieder auf die entsprechenden Fläschchen gesetzt werden. 9. Obgleich der aus menschlichem Serum gewonnene Kalibrator und die Kontrollseren entsprechend den derzeit geltenden EU Richtlinien für GMP auf Marker für spezifische, krankheitsübertragende Agenzien getestet und als nicht reaktiv befunden wurden, sind alle Bestandteile des Kits, die menschlichen Ursprungs sind, als potenziell infektiös anzusehen. 0. Konservierungsmittel: 0,00% Thiomersal.. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen sollten bei jedem Inkubations/Fixierungsschritt zum Abdecken der Platten während des ELISATests neue Haftfolien verwendet werden. Aluminiumfolie ist nicht geeignet.. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen sollte für jeden Übertragungsschritt eine neue EinwegPipettenspitze verwendet werden.. Die Verdünnungen der Kalibratoren, Konjugate und Puffer sollten für jeden Test frisch angesetzt werden.. Es dürfen nur die Reagenzien und Mikrotiterstrips verwendet werden, die im Lieferumfang des Kits enthalten sind. 5. Natriumazid inaktiviert HRP; verwenden Sie daher keine Natriumazidhaltigen Lösungen und geben Sie kein Natriumazid zu den mitgelieferten Puffern.. Die Abfallentsorgung sollte entsprechend den Vorschriften in Ihrem Labor vorgenommen werden.

5 XIII. QUELLENANGABE. Shakib, F. (Hrsg), Monographie über Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Hrsg), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5

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