Mycobacterium paratuberculosis (Para-TB-Ab)

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1 Mycobacterium paratuberculosis (Para-TB-Ab) SVANOVIR ELISA test for the detection of Mycobacterium paratuberculosis antibodies in serum and milk (individual and pooled) samples General information Paratuberculosis, also called Johne s disease, is a world wide spread chronic and not treatable intestinal disease in ruminants, caused by Mycobacterium paratuberculosis. Animals are generally infected as calves by the consumption of colostrum containing the mycobacterium or through feed contaminated with faeces. However, clinical signs are not shown until the age of two years. The Paratuberculosis can be diagnosed by the detection of Mycobacterium in faeces or by the detection of specific antibodies in bovine serum and milk samples. With the SVANOVIR Para-TB Ab ELISA kit it is possible to assess the prevalence in a dairy cow herd by testing the tank milk from this herd. Followed by retesting individual serum or milk from the respective herd, interpretation on the infection status of the individual animal can be done. Using the SVANOVIR ELISA, infected animals with subclinical symptoms can be identified. This allows these animals to be removed from the herd, before the infectious mycobacterium in contaminated faeces is infecting other animals in the herd. Principle The SVANOVIR Para-TB Ab ELISA Kit, is designed to detect specific antibodies against This manual covers the following Paratuberculosis-Ab ELISA Kit: Article number Mycobacterium paratuberculosis in bovine serum and milk samples. The kit procedure is based on the Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Indirect ELISA). In this procedure, samples are added to wells in microtitre plates or strips coated with Lipoarabinomannan, LAM, derived from Mycobacterium paratuberculosis. If antibodies directed against Mycobacterium paratuberculosis are present in the test sample, these antibodies will bind to the LAM-antigen in the well forming an antigenantibody-complex. HRP conjugate added subsequently forms a complex with the Mycobacterium paratuberculosis antibodies. Unbound material is removed by rinsing before the addition of a substrate solution. Subsequently a blue colour develops which is due to the conversion of the substrate by the conjugate. A positive result is indicated by development of a blue colour. The reaction is stopped by addition of the stop solution; the colour changes to yellow. The result can be read by a microplate photometer, where the optical density (OD) is measured at 450 nm. Contents 10 Paratuberculosis-antigen, (non-infectious Lipoarabinomannan), coated microtitre plates, (sealed and stored dry) 10 Lyophilized HRP Conjugate (horseradish peroxidase conjugated anti-bovine IgG monoclonal antibodies)

2 3 PBS-Tween Solution 20 x concentrate, 1 Substrate Solution (tetramethylbenzidine in substrate buffer containing H 2 O 2 ) STORE IN THE DARK! 1 Stop Solution Contains sulphuric acid CORROSIVE! A. Positive Control Serum 0,05% merthiolate B. Negative Control Serum 0,05% merthiolate Material needed but not provided 1. Precision pipettes (range from 5 to 200 µl) 2. Disposable pipette tips 3. Distilled water 4. Wash bottle 5. Container: 1 to 2 litres for Washing Buffer 6. Microplate photometer, 450 nm filter 7. Microplate shaker Precautions 1. Carefully read and follow all instructions. 2. Store the kit and all reagents at +2 to +8 C (35 to 45 F) 3. All reagents should equilibrate to room temperature 18 to 25 C (64 to 77 F) before use. 4. Handle all materials according to the Good Laboratory Practice. 5. Do not mix components or instruction booklets from different test kit batches. 6. Care should be taken to prevent contamination of kit components. 7. Do not use test kit beyond date of expire. 8. Do not eat, drink, or smoke where specimens or kit reagents are handled. 9. Use a separate pipette tip for each sample. 10.Do not pipette by mouth. 11.Include positive and negative serum controls on each plate or test strip series. 12.Use only distilled water for preparation of reagents. 13.The Stop Solution contains sulphuric acid, which is corrosive. Specimen information Serum : 5 µl of undiluted blood serum is required for each sample. Fresh, refrigerated, previously frozen serum can be used. Milk: 25 µl of skim milk is required for each sample. Milk samples must be centrifuged for 10 minutes at 2000 x g to remove the lipid layer. Tank milk samples from herds with a size up to 50 animals could be tested Preparation of reagents PBS-Tween Buffer: Dilute the PBS-Tween Solution 20 x concentrate 1/20 in distilled water. Prepare 500 ml per plate by adding 25 ml PBST solution to 475 ml distilled water and mix thoroughly. N.B. Please check that there is no crystal precipitation in the bottle. If crystals are seen, please warm and shake well. Anti-Bovine IgG Conjugate: Reconstitute the lyophilized HRP Conjugate with 11.5 ml PBS-Tween Buffer. Add the buffer carefully to the bottle. Leave the solution one minute and mix thoroughly. Prepare immediately before use.the remaining reconstituted conjugate can be stored at -20 C and thawed and refrozen up to 3 times. Pre-dilution of controls and samples: For testing, the serum controls and serum samples should be pre-diluted 1/100 in PBS-Tween Buffer (for example 5 µl sample into 495 µl of PBS-Tween buffer). For testing, the milk samples (individual as well as tank) should be pre-diluted 1/10 in PBS- Tween Buffer (for example 25 µl sample into 225 µl of PBS-Tween buffer). Recommendations regarding washing procedure Please note, it has been observed that the use of certain washing machines during the washing of microtiter plates, could result in non-valid test results. In such cases it is recommended to wash the plate by hand.

3 Procedure 1. All reagents should equilibrate to room temperature 18 to 25 C (64 to 77 F) before use. 2. In duplicates, add 100 µl of pre-diluted Positive Control Serum (Reagent A) and Negative Control Serum (Reagent B) respectively, into selected wells. 3. Add 100 µl of pre-diluted sample to selected well(s). The samples can be tested individually or in duplicates. However for confirmation purposes it is recommended to run the samples in duplicates. 4. Seal the plate and incubate on a shaker at room temperature 18 to 25 C (64 to 77 F) for 30 minutes. 5. Rinse the plates/strips 3 times with PBS- Tween Buffer: at each rinse cycle fill up the wells, empty the plate and tap hard to remove all remains of fluid. 6. Add 100 µl of HRP Conjugate to each well. Seal the plate and incubate on a shaker at room temperature 18 to 25 C (64 to 77 F) for 30 minutes. 7. Repeat step # Add 100 µl Substrate Solution to each well and incubate for 10 minutes at room temperature. Begin timing after the first well is filled. 9. Stop the reaction by adding 50 µl of Stop Solution to each well and mix thoroughly. Add the Stop Solution in the same order as the Substrate Solution in step # Measure the optical density (OD) of the controls and samples at 450 nm in a microplate photometer (use air as blank). Measure the OD within 15 minutes after the addition of Stop Solution to prevent fluctuation in OD values. Calculations 1. Calculate the mean OD values for each of the controls and samples. 2. Calculate the Percent Positivity (PP) values for the negative control serum and the samples, using the following formula: Mean OD value Sample or Neg. control PP = X 100 Mean OD value Pos. control Interpretation of the results Criteria for test validity To ensure validity, the duplicate OD values of the positive control should not differ more than 25% from each other. Additionally, the control values should fall within the following limits OD Positive control > 1.00 PP Negative control < 10 % Should any of these criteria not be fulfilled, the test is invalid. For invalid tests, technique may be suspect and the assay should be repeated. Examples for control A: OD-Value Difference Validity #1 1,78 / 1,98 0,2/1,98x100=10% valid #2 1,30 / 1,92 0,62/1,92x100=32% not valid #3 1,23 / 2,19 0,96/2,19x100=44% not valid #4 0,94 / 0,82 0,12/0,94x100=13% not valid.

4 Interpretation-individual samples Serum PP Interpretation > 53 Positive Doubtful/Re-test < 31 Negative Milk PP Interpretation > 57 Positive Doubtful/Re-test < 26 Negative To confirm test sample results, each separate duplicate PP value should be equally interpreted, i.e. positive, negative or doubtful. In case of discrepancy it is recommended to re-test the sample. If samples are retested as doubtful, it is recommended to test a second sample from the animal, obtained after a period of at least three months. Example: Mean OD Control A: 1,60 OD-Value PP value Interpretation Sample (%) Nr1 1,03 ; 0,98 64 ; 61 positive Nr2 0,22 ; 0,18 14 ; 11 negative Nr3 0,65 ; 0,58 39 ; 36 doubtful Nr4 0,54 ; 0,24 34 ; 15 retest Interpretation of tank milk samples When testing tank milk samples it is possible to assess the prevalence of the herd as follows: PP Prevalence interpretation < 5 Unsuspected 5-16 Low prevalence/ recommended for surveillance >16 High prevalence References 1. Gerlach, G.-F.; Valentin-Weigand (1998) Die Paratuberkulose des Rindes: Ursache und Auswirkungen neuer Bemühungen um eine alte Erkrankung. Berl. Münch. tierärztl. Wschr. 111, in press 2. Jark, U.; Ringena, I.; Franz, B.; Beyerbach, M.; Gerlach, G.-F. (1997) Development of an ELISA technique for serodignosis of bovine paratuberculosis. Vet. Microbiol. 57 (2-3): Winterhoff, C. Paratuberkulose-Diagnostik in Milch: Erreger- und Antikörpernachweis mittels PCR und ELISA. Hannover, Tierärzliche Hochschule, Dissertation, Winterhoff, C., Beyerbach, M., Homuth, M., Strutzberg, K., Gerlach, G.-F. (2002). Etablierung und Evaluation eines ELISA zum Nachweis von Antikörpen gegen Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Milch. Dtsch. tierätztl. Wschr. 109: Recommendations! Reconstituted conjugate may not be stored in refrigerator. Manufacturer Svanova Biotech AB Uppsala Science Park SE Uppsala, Sweden Phone Fax info@svanova.com Customer Service Phone Fax customer.service@svanova.com

5 SVANOVIR Gebrauchsinformation Paratuberkulose ELISA (Para-TB-Antikörper-Test) ELISA-Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Mycobacterium (M.) paratuberculosis in Blutserum und Milch sowie in Sammelmilchproben von Rindern Allgemeine Information Die Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete, chronische und nicht therapierbare Darmerkrankung der Wiederkäuer, verursacht durch Mycobacterium paratuberculosis. Die Ansteckung erfolgt in der Regel im Kälberalter durch Aufnahme von erregerhaltigem Kolostrum oder kotverschmutztem Futter; die Erkrankung bricht aber erst ab einem Alter von ca. 2 Jahren aus. Die Diagnose der Paratuberkulose kann durch den Erregernachweis im Kot oder durch den Nachweis spezifischer Antikörper im Serum und in der Milch der Rinder erfolgen. Mit dem SVANOVIR Paratuberkulose ELISA kann zunächst die Prävalenz, bezogen auf den Prozentsatz positiver Einzelmilchproben in dem Milchviehbestand aus dem die Proben stammen, durch die Untersuchung von Sammelmilch-proben abgeschätzt werden. Durch die Nachuntersuchung von einzelnen Serum- oder Milchproben kann dann eine individuelle Beurteilung bezüglich des Infektionsstatus durchgeführt werden. Mit dem SVANOVIR ELISA können auch subklinisch erkrankte Tiere erfaßt werden, die so aus dem Bestand entfernt werden können, bevor der Erreger in großer Menge mit dem Kot ausgeschieden wird und sich weitere Tiere infizieren. Diagnostisches Verfahren Der SVANOVIR Para-TB-Antikörper-Test, ist ein ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) zum spezifischen Nachweis von Antikörpern gegen Mycobacterium paratuberculosis im Blutserum bzw. -plasma und Milch von Rindern. Die in der zu testenden Probe vorhandene Antikörper, die gegen das Bakterium Mycobacterium paratuberculosis gerichtet sind, binden an in den Reaktionsvertiefungen (wells) fixiertes Antigen. Monoklonale, Meerettichperoxidase gekoppelte (horseradish peroxidase linked) Antikörper (HRP-Konjugat), die bovine Immunglobuline (IgG) spezifisch erkennen, werden zugegeben und reagieren mit bereits an der Festphase gebundenen bovinen Antikörpern. Ungebundenes, überschüßiges Material wird durch Waschvorgänge entfernt. Danach zugeführtes Substrat reagiert mit dem HRP-Konjugat. Es kommt zu einer Farbreaktion. Der Test ist positiv. Sind in der zu testenden Probe keine meßbaren Antikörper gegen das Paratuberkulose-bakterium vorhanden, dann kann das zugegebene HRP- Konjugat nicht binden und wird beim Waschvorgang entfernt. Da kein Enzymgekoppeltes Konjugat gebunden ist, kann auch das abschließend zugegebene Substrat nicht umgesetzt werden; die Farbreaktion bleibt aus. Der Test ist negativ. Zusammensetzung 10 Mikrotiterplatten, beschichtet mit nicht infektiösem Paratuberkulose-Antigen (Lipoarabinomannan) 10 Anti-Rind-IgG-HRP-Konjugat, lyophilisiert, (jede Flasche 11,5 ml nach Auflösen) 3 Flaschen PBS-Tween-Lösung, 20-fach konzentriert, (3 x 125 ml) 1 Flasche Substratlösung - Tetramethylbenzidin und H2O2 gelöst in Substratpuffer(100 ml) 1 Flasche Stoplösung, 2 M Schwefelsäure - Vorsicht ätzend! (50 ml) 1 Flasche Reagenz A Positives Kontrollserumvom Rind, konserviert mit 0,05 % Merthiolat (225 µl)

6 1 Flasche Reagenz B Negatives Kontrollserum vom Rind, konserviert mit 0,05 % Merthiolat (225 µl) 10 Klebefolie zum Abdecken der Mikrotiterplatte Zusätzlich notwendiges Material 1. Präzisionspipetten (im Bereich von 5-200µl) 2. Einmalpipettenspitzen 3. Destilliertes Wasser 4. Ein Behälter für Waschlösung (1bis 2 Liter) 5. Einrichtung zum Aufbringen und Absaugen der Waschlösung 6. Schüttler für Mikrotiterplatten 7. Photometer für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter Besondere Hinweise 1. Alle Hinweise vor der Testdurchfürung sorgfältig lesen und befolgen. 2. Das Test-Kit und alle Reagentien bei +2 bis +8 C lagern. 3. Alle Reagentien vor Gebrauch auf Zimmertemperatur (+18 bis +25 C) bringen. 4. Alle Materialen als potentiell infektiös behandeln und entsorgen. 5. Nicht die Reagentien und/oder Anweisungen verschiedener Tests untereinander vertauschen. 6. Kontamination der Testreagentien verhindern. 7. Test nach Ablauf der Haltbarkeit nicht mehr verwenden. 8. Während der Testdurchführung nicht essen, trinken oder rauchen. 9. Für jede Probe eine separate Pipettenspitze benutzen. 10. Nicht mit dem Mund pipettieren. 11. Bei jeder Testdurchführung muß eine positive und negative Kontrolle mitgeführt werden. 12. Ausschließlich destilliertes Wasser zur Herstellung der Testreagentien verwenden. 13. Die Stoplösung enthält Schwefelsäure, eine starke Säure, die schwere Verletzungen verursachen kann. Erhöhte Vorsicht! 14. Alles biologische Material vor Entsorgung unschädlich machen (z. B. durch Autoklavieren). Art der Anwendung 1. Verwendung der Mikrotiterplatten: Mit jeder Mikrotiterplatte können maximal 92 Proben im Einfachansatz bzw. 46 Proben im Doppelansatz untersucht werden. 2. Zubereitung der Testreagenzien: 2.1 Wasch-/Verdünnungs-Lösung: Für die Bearbeitung einer Mikrotiterplatte verdünnen Sie 25 ml des 20-fach-Konzentrates mit 475 ml destilliertem Wasser. Mischen Sie sorgfältig! Der Puffer kann, bei -20 C ein-gefroren, 3 Monate aufbewahrt werden. 2.2 Konjugat: Pro Mikrotiterplatte 1 Flasche des lyophilisierten Anti-Rind-IgG-HRP-Konjugats in 11,5 ml der Wasch-/Verdünnungslösung lösen. Die Konjugatlösung kann bei -20 C aufbewahrt werden, bis zu dreimal aufgetaut und wieder eingefroren werden. 3. Probenvorbereitung 3.1 Serum / Plasma Es kann frisches, kühl aufbewahrtes oder auch aufgetautes Blutserum oder -plasma benutzt werden. Die Proben werden für den Test mit Wasch-/ Verdünnungslösung (1/100) verdünnt werden (z B. 5 µl Serum in 495 µl Wasch-/ Verdünnungslösung). 3.2 Milch/Sammelmilch Es kann frische, kühl aufbewahrte oder auch konservierte Milch verwendet werden. Die Milch wird für den Einsatz im Test durch Zentrifugation (2000 x g / 10 Minuten) entfettet. Das aufgerahmte Fett wird entfernt. Das so erhaltene Milchserum kann entweder einzeln untersucht werden oder Sammelmilchproben aus bis zu 50 Tieren aus einem Bestand untersucht werden. Die Einzel- als auch Sammelmilchproben, bestehend aus bis zu 50 Einzelmilchproben, die zu gleichen Teilen gemischt sind, werden für den Einsatz im Test mit Wasch-/ Verdünnungslösung (1/10) verdünnt (z.b. 25 µl Milch/Sammelmilch in 225 µl Wasch-/ Verdünnungslösung). 4. Auswertung des Tests Mit Hilfe des ELISA kann durch Berechnung des prozentualen Probenwertes eine quantitative Aussage über den Antikörpergehalt der Proben im

7 Vergleich zu den Kontrollwerten gemacht werden. Die Proben können entsprechend positiv, zweifelhaft oder negativ befundet werden. Im Falle der Untersuchung von Sammelmilchproben kann die Seroprävalenz des untersuchten Betriebes abgeschätzt werden. Durchfürung des Tests 1. Alle Reagenzien sollen Raumtemperatur (+18 bis +25 C) haben. 2. Die benötigte Anzahl an Mikrotiterplatten der Umhüllung entnehmen. Die Platten sollten trocken sein. 3. Kontroll- und Patientenseren 1/100, Milchseren 1/10, mit Wasch-/Verdünnungslösung verdünnen. 4. In jede für die Kontrollseren vorgesehenen Reaktionsvertiefungen 100 µl des jeweiligen vorverdünnten positiven (Kontrolle A) bzw. des negativen (Kontrolle B) Kontrollserums geben (siehe Abbildung). 5. In jede für die Proben vorgesehenen Reaktionsvertiefungen 100 µl der jeweiligen vorverdünnten Serum- und Milchproben geben. Die Proben können einzeln (92 Proben pro Mikrotiterplatte) oder zur Absicherung im Doppelansatz (46 Proben) eingesetzt werden (siehe Abbildung) 6. Mikrotiterplatte mit Klebefolien abdecken und 30 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur (+18 bis +25 C) inkubieren. 7. Reaktionsvertiefungen entleeren und 3 x mit Wasch-/Verdünnungslösung (mindestens 300 µl) spülen; verbleibende Flüssigkeit gründlich entfernen. 8. In jede Reaktionsvertiefung 100 µl des HRP- Konjugates geben. 9. Wie unter Punkt 6 verfahren. 10. Wie unter Punkt 7 verfahren. 11. In jede Reaktionsvertiefung 100 µl der Substratlösung geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Zeitmessung beginnt mit dem Befüllen der ersten Reaktionsvertiefung. 12. In jede Reaktionsvertiefung 50 µl Stoplösung (Schwefelsäure) - Vorsicht ätzend! - zugeben und zwar in der gleichen Reihenfolge wie bei Zugabe der Substratlösung. 5. Hinweis betreffend des Waschvorganges Bitte beachten Sie, dass es festgestellt ist, dass ein Gebrauch von eingen Waschautomaten bei dem Waschvorgänge der Mikrotierplatte zu nicht validen Testergebnissen führen könnte. In diesem Fall sollte der Waschvorgang mit der Hand durchgeführt werden 13. Die Extinktionswerte (OD) der Kontroll- Patienten- und Milchseren innerhalb von 15 Minuten nach Zugabe der Stoplösung mit einem Photometer bei 450 nm messen. Auswertung Um eine zuverlässige Bewertung der Testergebnisse zu erhalten, sollte die nachfolgende Anweisung befolgt werden. Vor der Bewertung der Patientenproben sind die Kontrollen auszuwerten. 1. Validitätsgrenzen der Kontrolle A (positiv) OD: > 1,00 Beide OD-Werte sollen eine OD > 1,00 haben und dürfen höchstens 25%, bezogen auf den gröberen der beiden Einzelwerte, voneinander abweichen. Sind ein oder beide OD-Werte auberhalb dieser Grenze, bzw. haben sie eine Abweichung > 25 % voneinander, ist der Test nicht gültig und muss wiederholt werden. Beispiele: OD-Werte Abweichung Gültigkeit #1 1,78 / 1,98 0,2/1,98x100=10% gültig #2 1,30 / 1,92 0,62/1,92x100=32% nicht gültig #3 1,23 / 2,19 0,96/2,19x100=44% nicht gültig #4 0,94 / 0,82 0,12/0,94x100=13% nicht gültig 2. Berechnen Sie den Mittelwert der beiden OD Werte der Kontrolle A 3. Validitätsgrenzen der Kontrolle B (negativ) Kontrolle % der OD Kontrolle A B <10 Beide Einzelwerte der Kontrolle B müssen innerhalb der obigen Grenzwerte sein. Sind ein oder beide OD-Werte dieser Kontrolle außerhalb dieser Grenzen, ist der Test nicht auswertbar und muß wiederholt werden.

8 Beispiel 1: gemittelte OD Kontrolle A: 1.60 Kontrolle OD-Werte % der Gültigkeit Kontr. A B 0,15 ; 0,12 9 ; 8 gültig Beispiel 2: gemittelte OD Kontrolle A: 1.75 Kontrolle OD-Werte % der Gültigkeit Kontr. A B 0,32 ; 0,12 18 ; 7 nicht gültig 4. Bewertung der Patientproben Berechnung der prozentualen Probenwerte mit den Mittelwerten der gemessenen OD-Werte nach folgender Formel (der Mittelwert der positiven Kontrolle A entspricht dabei 100%) OD Probe Probenwert (%) = X 100 Gemittelte OD positive Kontrolle % des Mittelwertes der Kontr. A (Die Probenwerte werden dann mathematisch auf volle Zahlen gerundet.) Beurteilung der Blutproben > 53 positiv zweifelhaft < 31 negativ Beurteilung der Milchproben > 57 positiv zweifelhaft < 26 negativ Sind beide Werte nicht einheitlich positiv/negativ zubeurteilen, so ist die Untersuchung dieser Probe zu wiederholen. Beispiele: gemittelte OD Kontrolle A: 1,60 OD-Werte Probenwert (%) Beurteilung der Proben Nr1 1,03 ; 0,98 64 ; 61 positiv Nr2 0,22 ; 0,18 14 ; 11 negativ Nr3 0,65 ; 0,58 39 ; 36 zweifelhaft Nr4 0,54 ; 0,24 34 ; 15 Test wiederholen Bei zweifelhaft beurteilen Seren bzw. Milchproben ist eine Nachuntersuchung nach frühestens 3 Monaten zu empfehlen. Beurteilung von Sammelmilchproben < 5 derzeit unbedenklich 5 bis 16 geringprävalent/ überwachungsempfohlen >16 hochprävalent Referenzen 1. Gerlach, G.-F.; Valentin-Weigand (1998) Die Paratuberkulose des Rindes: Ursache und Auswirkungen neuer Bemühungen um eine alte Erkrankung. Berl. Münch. tierärztl. Wschr. 111, in press 2. Jark, U.; Ringena, I.; Franz, B.; Beyerbach, M.; Gerlach, G.-F. (1997) Development of an ELISA technique for serodignosis of bovine paratuberculosis. Vet. Microbiol. 57 (2-3): Winterhoff, C. Paratuberkulose-Diagnostik in Milch: Erreger- und Antikörpernachweis mittels PCR und ELISA. Hannover, Tierärzliche Hochschule, Dissertation, Winterhoff, C., Beyerbach, M., Homuth, M., Strutzberg, K., Gerlach, G.-F. (2002). Etablierung und Evaluation eines ELISA zum Nachweis von Antikörpen gegen Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Milch. Dtsch. tierätztl. Wschr. 109: Diese Gebrauchsinformation umfasst die Testkits mit den Produktnummern: Hersteller/Vertreib Svanova Biotech AB Uppsala Science Park SE Uppsala, Schweden Rufnummer: Faxnummer: info@svanova.com Kundenservice Rufnummer: Faxnummer: customer.service@svanova.com Manualnumber: /04

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