Histamine Stool ELISA

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1 Vertrieb durch: FROST Diagnostika GmbH Speyerer Str. 74 Tel: Otterstadt Fax: info@frostdiagnostika.de Arbeitsanleitung Histamine Stool ELISA (Histamin im Stuhl) Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Histamin in Stuhlproben BA

2 1. Einleitung Hstamin wurde erstmals 1910 als endogene Substanz pharmakologisch beschrieben. Als biogenes Amin wird es aus der Aminosäure Histidin synthetisiert. Es ist ein wichtiger Mediator vieler biologischer Reaktionen im Körper, bekannt als Vermittler allergischer und pseudoallergischer Reaktionen. Histamin wird im Körper durch zwei verschiedene Wege metabolisiert. Ein direkter Gegenspieler des Histamins ist das sekretorische Enzym Diaminooxidase (DAO). Ein zweiter intrazellulärer Weg der Regulation läuft über das Enzym Histamin-N-Methyltransferase (HNMT). Beide Systeme ergänzen sich, da die DAO mehr für die Regulation extrazellulär angefallenen Histamins ( z.b.: im Darm) zuständig ist und die HNMT für die intrazelluläre Regulation im Zytosol zuständig ist. Durch verschiedene Faktoren kann im Körper die Histamin-konzentration beeinflusst werden. Zum einen wird Histamin von Körper selbst gebildet zum anderen über Nahrung aufgenommen. Bestimmte Nahrungsmittel können im Körper gespeichertes Histamin freisetzen. Die Diaminooxidase (DAO) ist das entscheidene, körpereigene Enzym das für den Abbau von Histamin im Organismusverantwortlich ist. Beim Abbau des über die Nahrung aufgenommen Histamins spielt das Enzym eine zentrale Rolle. Der wichtigste Ort ist der Darm. Liegt ein DAO- Enzymmangel, bzw. eine Hemmung der DAO Aktivität vor, wird Histamin nicht im ausreichenden Maße abgebaut. Der Histamin- Stuhl Elisa Test gewährleistet eine zuverlässige Quantifizierung von Histamin. Für die Histaminbestimmung in der Stuhlprobe ist ein spezielles Stuhlentnahmebesteck notwendig, das mit einem Stabilisationsmedium den Abbau des Histamins auf dem Transport zum Labor gewährleistet. Mit der Bestimmung von Histamin im Stuhl erfasst man die akute Histaminbelastung und die Aussage über die Abbaukapazität von Histamin im Darm. 2. Testprinzip Der Histamin ELISA Kit BA enthält Materialien für die quantitative Bestimmung von Histamin in Stuhlproben. Zuerst wird Histamin im Verlauf der Probenvorbereitung zu N-Azyl-Histamin derivatisiert. Der sich anschließende kompetitive ELISA basiert auf dem Mikrotiterplattenformat. Das Antigen ist an eine feste Phase gebunden. Die acylierten Standards, Kontrollen und Proben und die an der festen Phase gebundenen Antigene konkurrieren um die vorhandenen Bindungsstellen der Antikörper. Nachdem das System im Gleichgewicht ist, werden die freien Antigene und die freien Antigen-Antiseren-Komplexe durch Waschen entfernt. Der an der festen Phase gebundene Antigen-Antikörper-Komplex wird mit einem enzymmarkierten Antikörper bestimmt und mit einem Substrat durch eine Farbreaktion nachgewiesen. Die Reaktion wird bei 450 nm gemessen. Die Konzentrationen der Proben werden mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt. 3. Lagerung und Haltbarkeit Die Testpackung ist bis auf das Azylierungsreagenz - bei 2-8 C aufzubewahren. Das Azylierungsreagenz hingegen sollte bei Raumtemperatur gelagert werden. Das Verfallsdatum sowie die Chargenbezeichnung der Komponenten sind auf jedem Kit angegeben. Innerhalb eines Ansatzes sollten nur Reagenzien einer Charge verwendet werden. Revision date: /7

3 4. Reagenzien im Kit BA 3024 Reaktionsplatte 1 x 96 Wells gebrauchsfertig BA Waschpuffer- Konzentrat 1 x 20 ml Konzentrat. Inhalt mit destilliertem Wasser auf 500 ml Endvolumen verdünnen BA Substrat 1 x 11 ml gebrauchsfertig, enthält TMB BA Stopplösung 1 x 11 ml gebrauchsfertig, enthält 0.25 M H 2 SO 4 BA Histamin Mikrotiterstreifen 1 x 96 Wells 12 Streifen, jeweils 8 Kavitäten, einzeln abbrechbar, vorbeschichtet mit Azyl- Histamin BA Probenpufferkonzentrat 2 x 50 ml Konzentrat. Inhalt eines Fläschchens jeweils mit destilliertem Wasser auf 500 ml Endvolumen verdünnen BA Standard A 1 x 4 ml gebrauchsfertig BA Standard B 1 x 4 ml gebrauchsfertig BA Standard C 1 x 4 ml gebrauchsfertig BA Standard D 1 x 4 ml gebrauchsfertig BA Standard E 1 x 4 ml gebrauchsfertig BA Standard F 1 x 4 ml gebrauchsfertig BA Histamin Antiserum 1 x 11 ml gebrauchsfertig, blau gefärbt, Ziege-anti- N-azylhistamin Antiserum BA Azylierungspuffer 1 x 22 ml gebrauchsfertig BA Azylierungsreagenz 2 x 1,5 ml gebrauchsfertig BA Enzymkonjugat 1 x 11 ml gebrauchsfertig, Anti-Ziege-IgG konjugiert mit Peroxidase BA Kontrolle 1 1 x 4 ml gebrauchsfertig BA Kontrolle 2 1 x 4 ml gebrauchsfertig 5. Nicht im Kit enthaltene aber zur Durchführung erforderliche Geräte und Reagenzien - Kalibrierte variable Präzisionspipetten (z.b µl / µL) - Waschvorrichtung für Mikrotiterplatten - Photometer zur Auswertung von Mikrotiterplatten mit 450 nm- und 620 (650) nm-filter - Zentrifuge min x g - Plattenschüttler (Schüttelhub von 3 mm, ca. 600 rpm) - Vortex-Mischer - Destilliertes Wasser 6. Probenmaterial und Lagerung Zum sammeln, stabilisieren und versenden der Stuhlproben ist die Verwendung eines speziellen Stuhlsammelgefäßes erforderlich (Artikelnummer BA ). Wie empfehlen, zur einfachen und sauberen Sammelung, ein Stuhlsammelset (Artikelnummer BA ). Stabilisierte Proben können bei Raumtemperatur versandt werden und sind mindestenseine Woche bei Raumtemperatur sowie einen Monat bei 2-8 C stabil. Revision date: /7

4 7. Testdurchführung Vor dem Gebrauch müssen alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Die Durchführung von Doppelbestimmungen wird empfohlen. 7.1 Vorbereitung der Reagenzien Probenpuffer 50 ml Probenpufferkonzentrat mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 500 ml verdünnen. Der gebrauchsfertige Probenpuffer kann bis zum Verfallsdatum (siehe Etikett) bei 2 8 C gelagert werden. Waschpuffer 20 ml Waschbufferkonzentrat mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 500 ml verdünnen. Der gebrauchsfertige Waschpuffer kann bei 2 8 C bis zum Verfallsdatum (siehe Etikett) gelagert werden. Azylierungsreagenz Das Acylierungsreagenz hat einen Gefrierpunkt von 18,5 C. Um sicherzustellen, dass es bei Gebrauch flüssig ist, sollte es getrennt von den übrigen Kitkomponenten bei Raumtemperatur (20-25 C) gelagert werden. Bei Lagerung im Kühlschrank (2-8 C) muss sichergestellt sein, dass es vor der Verwendung Raumtemperatur angenommen hat und eine homogene, kristallfreie Lösung bildet. 7.2 Vorbereitung und Azylierung 1. Jeweils 100 µl Standards und Kontrollen sowie 100 µl der Proben (aus Stuhlsammelgefäß) in die entsprechenden Vertiefungen der Reaktionsplatte pipettieren µl Azylierungsreagenz (siehe 7.1) in alle Vertiefungen pipettieren µl Azylierungspuffer in alle Vertiefungen pipettieren. 4. Reaktionsplatte kurz per Hand schütteln; 15 Minuten bei RT (20-25 C) inkubieren. Jeweils 25 µl werden für den nachfolgenden ELISA verwendet 7.3 Histamin ELISA µl der azylierten Standards, Kontrollen und Proben in die Kavitäten der Histamin Mikrotiterstreifen pipettieren µl Histamin-Antiserum in alle Kavitäten pipettieren Minuten bei RT (20-25 C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Alternativ ohne Schüttler: Histamin Mikrotiterstreifen kurz per Hand schütteln und für 40 Minuten bei RT (20-25 C) inkubieren. 4. Den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen und sorgfältig 3 x mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Die Platte ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Ausklopfen auf einer saugfähigen Unterlage (Papierhandtuch) entfernen µl Enzymkonjugat in alle Kavitäten pipettieren Minuten bei RT (20-25 C)auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Alternativ ohne Schüttler: Histamin Mikrotiterstreifen kurz per Hand schütteln und für 20 Minuten bei RT (20-25 C) inkubieren. 7. Den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen und sorgfältig 3 x mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Die Platte ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Ausklopfen auf einer saugfähigen Unterlage (Papierhandtuch) entfernen µl Substrat in alle Kavitäten pipettieren ± 2 Minuten bei RT (20-25 C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Alternativ ohne Schütteln: Histamin Mikrotiterstreifen kurz per Hand schütteln und für 15± 2 Minuten bei RT (20-25 C )inkubieren. Direktes Sonnenlicht vermeiden! µl Stopplösung in alle Kavitäten pipettieren und kurz per Hand schütteln. 11. Absorbtion mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei 450 nm (falls vorhanden, gegen eine Referenzwellenlänge von nm) innerhalb von 10 Minuten messen. Revision date: /7

5 8. Berechnung der Ergebnisse Standardkonzentrationen Standard A B C D E F Histamin (ng/ml)* *Histamin Stuhlproben 1:300 (nach Multiplikation ng/g Stuhl) Histamin (ng/ml) x 9 = Histamin (nmol/l) Histamin (ng/g) x 9 = Histamin (nmol/kg) Eine Standardkurve, mit deren Hilfe die Konzentration der unbekannten Proben ermittelt werden kann, wird durch Auftragen der gemessenen Standard-Extinktionen (linearer Maßstab auf der y-achse) gegen die entsprechende Standardkonzentration (logarithmischer Maßstab auf der x-achse) erstellt. Für die Auswertung wird eine nicht-lineare Regression (z.b.: spline, 4- parameter, akima) empfohlen. Kontrollen: Die Konzentrationen der Kontrollen können direkt aus der Standardkurve ermittelt werden. Stuhlproben: Die Konzentrationen der Stuhlproben müssen mit 300 multipliziert werden. 8.1 Qualitätskontrolle Es wird empfohlen, mit jeder Testserie entweder die Kitkontrolle oder andere kommerzielle Kontrollproben mitzubestimmen, um die Leistungsfähigkeit des Tests zu überprüfen. Diese Kontrollen müssen dabei wie die unbekannten Proben behandelt werden. Die Kontrollproben müssen dabei innerhalb der Nachweisgrenze liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind im QC Report aufgeführt. 8.2 Kalibrierung Die Reaktion des Antiserums, Enzymkonjugats und die Aktivität des Enzyms sind temperaturabhängig. Die optimale Temperatur während des Enzymimmunoassay ist zwischen C. Liegt die gemessene Extinktion außerhalb des Messbereichs, so sollte innerhalb von 10 Minuten die Absorption mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei 405 nm gemessen werden Referenzbereich Der angegebene Referenzbereich gilt lediglich als Richtlinie. Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Referenzbereiche erstellt. Erwachsene: < 600 ng/g Stuhl Alkohol und Medikamente können die Aktivität der histaminabbauenden Enzyme stören und zu erhöhten Histaminwerten im Stuhl führen. 9. Testcharakteristika Spezifität (Kreuzreaktion) Substanz Kreuzreaktion (%) Histamin Histamin Methyl-Histamin 0.1 Tyramin 0.01 L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Tyrosin, < Tryptamin, 5-Hydroxy-Indol- Essigsäure, Serotonin Histamin 75 ng/g Mittelwert (Null-Standard) - 2SD Analytische Sensitivität (Limit of Detection) Präzision Inter-Assay Variation, n = 13 Intra-Assay Variation, n = 39 Probe Mittelwert ± CV (%) Probe Mittelwert ± CV (%) SD (ng/g) SD (ng/g) ± ± 7, ± ± 310 6,6 Widerfindung Bereich (ng/g) Bereich (%) Mittelwert (%) Histamin Linearität Serielle Verdünnung bis Bereich (%) Mittelwert (%) Histamin 1: Revision date: /7

6 10. Hinweise zum Test 10.1 Zuverlässigkeit der erhaltenen Messergebnisse Für eine zuverlässige Auswertung der Messergebnisse, muss die beschriebene Testdurchführung eingehalten und nach den geltenden Regeln und Richtlinien (GLP, RILIBÄK, usw.) gearbeitet werden. Insbesondere ist auf eine Mitführung von Präzisions- und Richtigkeitskontrollen zu achten, außerdem müssen die Ergebnisse der Kontrollen im gültigen Bereich liegen. Bei auffälligen Diskrepanzen zwischen den für diesen Test vorgegebenen Assaycharakteristika und den gemessenen Werten ist der Hersteller des Testkits zu Rate zu ziehen Reklamationen Bei eventuellen Reklamationen, bitte diese schriftlich und zusammen mit allen Angaben zur Testdurchführung, den Ergebnissen und Original-Testausdrucken (in Kopie) beim Hersteller einreichen. Das entsprechende Reklamationsformular kann beim Hersteller angefordert werden. Bitte vollständig ausfüllen! 10.3 Gewährleistung Dieses Testkit wurde gemäß dem aktuellen Stand der Technik produziert und strengen internen und externen Qualitätskontrollen unterworfen. Jede Veränderung des Testkits oder des Testablaufs sowie die Verwendung von Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen kann die Testergebnisse negativ beeinflussen. In diesen Fällen besteht kein Anspruch auf Ersatz. Transportschäden sind von der Haftung durch den Hersteller ausgenommen Entsorgung Reststoffe und/ oder alle übriggebliebenen Chemikalien, Reagenzien und angefertigten Gebrauchslösungen, sind Sonderabfälle. Die Entsorgung unterliegt den Gesetzen und Verordnungen des Bundes und der Länder. Über die Beseitigung von Sonderabfällen informieren die zuständigen Behörden oder Abfallentsorgungsunternehmen. Die Testverpackungen sind nach den gesetzlichen Bestimmungen zu entsorgen. Gesetzliche Grundlage für die Entsorgung von Sonderabfällen ist das Kreislaufwirtschaftsund Abfallgesetz. Die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter der einzelnen Produkte stellen wir gerne zur Verfügung oder sind auf der Hersteller-Internetseite erhältlich. Die Sicherheitsdatenblätter entsprechen der Norm: ISO Interferenzen Reagenzien und Lösungen aus verschiedenen Chargen nicht mischen. Bitte unterschiedliche Transport und Lagerbedingungen beachten Unsachgemäße Handhabung von Testproben oder Abweichungen von der Testvorschrift können die Ergebnisse beeinflussen. Keine Kitkomponenten über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Mikrobielle Kontaminationen der Reagenzien und des Waschwassers vermeiden. Inkubationszeiten und Waschhinweise beachten Warnhinweise Beachten Sie die Inkubationszeiten und Waschhinweise. Verwenden Sie beim Arbeiten mit den Kitreagenzien oder Proben geeignete Handschuhe und waschen Sie anschließend sorgfältig die Hände. Vermeiden Sie jegliches Spritzen! In den Bereichen, in denen mit Proben oder Kitreagenzien umgegangen wird, ist Essen und Trinken sowie Rauchen untersagt. Nicht mit dem Mund pipettieren! Verwenden Sie keine Kitkomponenten über das Verfallsdatum hinaus. Reagenzien verschiedener Chargen nicht mischen! Vermeiden Sie mikrobielle Kontamination der Reagenzien und des Waschwassers. Natriumazid kann mit Blei- und Kupferrohrleitungen reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Um dies zu verhindern, muss bei der Entsorgung mit großen Mengen Wasser sorgfältig nachgespült werden. Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf HCV, HBsAG bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solch infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Aktuelle Literatur und weitere Informationen senden wir auf Anfrage gerne zu. Revision date: /7

7 %B/Bo Verwendete Symbole: Enthält Testmaterial für <n> Teste Hersteller Lagertemperatur Katalog-Nummer Chargennummer Verwendbar bis In vitro Diagnostikum Gebrauch nur zu Forschungszwecken Inhalt Achtung Vor Gebrauch Packungsbeilage lesen Revision date: /7