Immunzytometrische Qualitätssicherung: Stamm- und Progenitorzellen. - RV 217: Rückblick und Perspektive -

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1 Immunzytometrische Qualitätssicherung: Stamm- und Progenitorzellen - RV 217: Rückblick und Perspektive - Kai Gutensohn Göttingen

2 S. Serke, H.E. Johnsen An European reference protocol for quality assessment and clinical validation of autologous haematopoietic blood progenitor and stem cell grafts. The first step in quality assessment was CD34 standardisation. The final step in quality assessment is clinical validation. Bone Marrow Transplant 2001; 27:

3 Immunzytometrische Analyse von CD34+ Zellen Autor Fachzeitschrift Gratama JW et al. Barnett D et al. Johnsen HE et al. Gratama JW et al. Keeney M et al. Fritsch G et al. Chin-Yee I et al. Sutherland DR et al. Johnsen HE et al. Gutensohn K et al. Chia Huei C et al. Kreissig C et al. Bender JG et al. Sovalat H et al. Serke S et al. Siena S et al. J Biol Regul Homeost Agents 2001;15: Clin Lab Haematol 1999; 21: J Hematother 1999; 8: Cytometry 1998; 34: Cytometry 1998; 34: Transfusion 1997; 37: Clin Immunol Newslett 1997; 17: J Hematother 1996; 5: J Hematother 1996; 5: Infusionsther Transfusionsmed 1996;23:1-23 J Hematother 1994; 3: 3-13 J Hematother 1994; 3: The Mulhouse Manual 1994; pp J Hematother 1993; 3: Blood 1992; 80: Blood 1991; 77: Technical report Guideline Technical report Review Technical report Technical report Technical report Technical report Technical report Technical report Technical report Technical report Technical report

4 Relevante Protokolle Author Keeney 1998 Keeney 1998 Sutherland 1996 Owens, Loken 1995 Gratama 1997 Bender 1994 Johnsen 1999 Siena 1991 Protocol and Procedure ISHAGE modification: SYTO-13, trigger on intact living cells, counterstain with CD34 and CD45 ISHAGE modification: single platform, 7-AAD, omitting isotype control ISHAGE: sequential gating steps 3-color-protocol, counterstain of CD34 with 7-AAD (exclusion of dead cells and CD14+ monocytes) SIHON: LDS-751 (denominator), counterstain of CD34 with CD14 and CD66e (exclusion of Fc gamma receptor-mediated mab binding by myelomonocytic cells), region on CD34+/SSC low Multicolor strategy, inclusion of CD45 Nordic: CD34+ as single cluster of bright staining cells Milan-Mulhouse: CD34 class III, whole blood, stain-lysewash, leukocytes as denominator, FL analysis region on cells with low-intermediate SSC in isotype control

5 Anwendungsbereiche Monitoring Qualitätskontrolle QK Prozessierung Prä-Transfusion Zytapherese Apheresat Knochenmark Nabelschnurblut Purging/Positivselektion Volumenreduktion Zellreduktion Kryokonservierung Ex-vivo-Expansion Genetische Modifikation Lagerung, Transport QK des Transplantates Beginn des Verfahrens Prädiktiver Wert (1) CD34+ Zellgehalt Tumorzellabreicherung z.b. CD34+ Anreicherung Plasma z.b. Erythrozyten Einfrier-/Auftauprozess CD34+ Zellgehalt Viabilität 1 Ford CD et al. Tranfusion 2003; 43:

6 Rückblick RV 217: Stamm- und Progenitorzellen Übernahme RV (Nebe, Gutensohn) Testung von Versandgefäßen und Transportbehältern RV Integration von Kompetenzzentren RV Versand von Fragebögen (Gerät, IVD, Technik) RV Bewertung: numerisches und technisches Resultat RV 01 und Workshop (INSTAND & IGLD) Materialwechsel Logistik (Optimierung)

7 RV-Proben (INSTAND, ): Kommerzielle Hersteller R1 R3 R4 SSC FSC CD45 FITC CD34 PE SSC CD45 FITC R6 R2 SSC SSC CD34 PE (QBEND-10) CD34 PE (HPCA2)

8 RV : Sequenzielle Gating-Strategie CD34+HPC Abs. Count 23 Total 0,55 CD34+HPC Abs. Count 1 Total 0,01 Sutherland DR et al. J Hematother 1996; 5: (ISHAGE Guidelines)

9 RV : Probenerhalt und -bearbeitung 120 n = n = Teilnehmer (8) 1 d nach Versand 2 d nach Versand * 20 0 Bearbeitung Tag 0 11 Bearbeitung Tag +1 0 Bearbeitung Tag +2 * Eingang laut Protokoll Kurierdienst 1 d nach Versand (n=8)

10 CD34-Antigen: Epitope und Antikörper Neuraminidase sensitiv I My-10 (HPCA-1), 12.8, BI3C5, ICH-3, 5.1.1, Immu-409, Immu 133 O-Glycanase und Chymopapain sensitiv II 11A10, 9G3, , 9C5, 15E10,MD34-2, QBend-10 III TUEK-3, 581, 115.2, BIRMA-K3, 8G12 (HPCA-2) CD34 Antigen Lanza F et al. J Biol Regul Homeost Agents 2001; 15: 1-13

11 RV 217: RV 217: Entwicklung in Zahlen

12 Literatur zu prädiktivem Wert: Chapple P et al. Bone Marrow Transplant 1998; 22: Linn YC et al. J Clin Apheresis 2000; 15: Prädiktiver Wert des CD34+ Monitorings Parameter Korrelation Signifikanz prädiktiver Faktor (± 1 SD) Zytometrie r = p < ± ProCOUNT r = p < ± HPC r = p = ± IMI-total r = p = ± MNC r = p = ± 4.00 WBC (SE-9000) r = p = ± 0.86

13 Monitoring: Optimierung des Zeitpunktes der Zytapherese Fixierter Zeitpunkt Tag X" nach Nadir Apherese zu früh (Tage) Apherese zu spät (Tage) Abweichung vom optimalen Zeitpunkt (zusätzliche Patiententage ) Tag Tag Tag Patienten; Monitoring ab Nadir; Beginn der Zytapherese nach CD34+/uL Kalkulierte Kostenersparnis: ca ; Kosten Zytometrie: ca

14 RV : Single- und Dual-Platform-Analyse 100 n = n = 59 Teilnehmer Single Platform Dual Platform Keine Angabe Single P. (eigen) ProCOUNT Stem-Kit

15 ProCOUNT (BDIS) Threshold und Akquisition von 500 Beads NAD/SSC CD45/ SSC Setzen der low SSC Grenze für die CD45 / SSC Region Setzen des Negativbereichs CD45/CD34 NAD/CD34 Chin-Yee I et al. Clin Immunol Newslett 1997; 17: 21-29

16 Barnett D et al. Br J Haematol 1999; 106: Gratama JW et al. Clin Lab Haematol 1999; 21: Vorteile Single-Platform vs. Dual-Platform Direkte Absolutzahlmessung (CD34+) an einem Gerät (Zytometer). Elimination des Einflusses der WBC-Wert-Bestimmung mit einem hämatologischen Zellanalyzer. Umgehen der Frage der Referenzpopulation (denominator): Prozentualer Anteil CD34+ Zellen als Fraktion der Leukozyten und kernhaltigen Zellen (nrbc!). Insbesondere bei Gating im FSC/SSC: nicht akzeptabel. Vermeiden der erforderlichen Geräteabstimmung (WBC Hämatologie-Analyzer = WBC Zytometer?). Vermeiden von Zellzählungen bei Proben mit Extremwerten (Nadir, Apheresate, etc.) und der dabei erforderlichen Manipulation (Verdünnung) am hämatologischen Analyzer. Umgehen des Problems einer fixed volume -Messung (statt fixed cell event ) am hämatologischen Analyzer. Deutliche Reduktion der Differenzen zwischen verschiedenen Laboratorien (interlaboratory variation). Fazit: Standardisierung, Optimierung der Analytik Nachteil: Exaktes reverses pipettieren erforderlich.

17 CAP Survey FL4-B 2001 Weitere Quelle: Gratama JW et al. Cytotherapy 2003; 5: Single- versus Dual-Platform CD34+ (%) CV (%) CD34+ (ul) CV (%) Zielwerte 1,5 45 0,5 15 Dual Platform (n=77) 1, ,1 15,8 0,45 17,7 13,3 20,6 Single Platform (n=69) 1, ,9 11,4 0,46 13,1 14,1 15,1

18 RV : Vitalitätsmessung mit 7-AAD RV Probe 1 RV Probe 2 nicht vital nicht vital Viable Abs. Count 3053 % Total 74,45 Viable abs. Count 3267 % Total 75,81 Nach: Keeney M et al. Cytometry (Comm Clin Cytometry) 1998; 34: 61-70

19 Schuurhuis GJ et al. Bone Marrow Transplant 2001; 27: De Boer F et al. Bone Marrow Transplant 2002; 29; Progression der Apoptose Viable Zellen Frühe Apoptose Späte Apoptose Nekrose 7-AAD +? Annexin V +

20 Greco NJ. Holland Laboratory, American Red Cross, 2003 Keeney M et al. Cytometry 2004; 58 A: Progression der Apoptose? 50 % Frühe Apoptose Späte Apoptose Kryokonservierung % Apoptose Liquid storage 0 % Caspase- Substrat Syto-16 Annexin-V 7-AAD

21 Brocklebank A et al. Comm Clin Cytometry 2001; 46: CAP FLO Messung der Viabilität Lagerung des Apheresats über 24 h kann zu Zelltod führen. Purging, T-Zell-Depletion, Kryokonservierung, Auftauen (!) beeinträchtigt die Viabilität. Nabelschnurblut und Knochenmark enthalten nicht-vitale Zellen. CAP Issues: For apheresis samples stored for more than 4 hours, an aliquot from the product should be tested immediately before freezing or infusion. Packs stored overnight should have an aliquot tested on the day of processing. CD34 celluar viability should be performed on these aliquots.... precise determination of CD34 cell viablity.

22 Allan DS: Einfluss der Anzahl vitaler Zellen auf das Resultat der Tx Platelet engraftment (viable CD34+ cells after thawing): Group I (< 2 X 10 6 /kg): 17 days (12-42) Group I (2-5 X 10 6 /kg): 12 days (11-16) Group I (>5 X 10 6 /kg): 10 days (9-14) Neutrophil engraftment (viable CD34+ cells after thawing): Group I (< 2 X 10 6 /kg): 13 days (10-22) Group I (2-5 X 10 6 /kg): 14 days (10-19) Group I (>5 X 10 6 /kg): 12 days (9-13) Allan DS et al. Bone Marrow Transplant 2002; 29:

23 Europäische Direktive 98/79/EC für IVD (incl. Software) Europäische Union ( ) Übergangsperiode 07. Dez Unterstützung der Vereinheitlichung (EU) Integration in das MPG definiert essentielle Forderungen für IVD letztes Handelsdatum IVD ohne CE-Zeichen 07. Dez. 2005

24 Kosten Einzelanalyse Zytometrie ISHAGE ProCOUNT (BD) * Stem-Kit (BC) ** Reagenzien kosten Kosten Arbeitszeit*** Gesamtkosten pro Einzelanalyse * Testkit: Analyse der Probe und Isotypkontrolle ** Testkit: Wiederholungsuntersuchung der Probe, isoklone Kontrolle, KG1a- Kontrolle wurden bei der Berechnung der Arbeitszeit nicht berücksichtigt *** Durchschnittswerte Anm.: Kalkulation auf Basis Listenpreis

25 1) Gratama JW et al. J Biol Regul Homeast Agents 2001; 15: ) S. Serke, HE Johnsen. Bone Marrow Transplant 2001; 27: Mittelfristige Ziele des RV 217 Bestehensquote 2002: 25% Bestehensquote 2005: 71% Benchmarking Laboranalytik (Qualität) Orientierung am internationalen Standard Höchstmöglicher Nutzen für den Patienten Dead cells don t engraft (1) The final step in quality assessment is clinical validation. (2)

26 RV 217 (Stamm- und Progenitorzellen): Perspektive RV : Angabe CD34+ pro ul als relevanter Parameter RV : Implementierung eines Vitalfarbstoffs (7-AAD) April 2006: INSTAND-IGLD-Workshop (Vitalität, Single Platform) RV 01 und : Messung der Vitalität (noch optional) RV : Forcierung Single Platform-Technik RV 2007: Integration der Vitalitätsmessung? RV 2007: Integration der SP-Technik? CE-Zertifizierung IVD, Subklassen

27 Unser Dank gilt: Den Teilnehmern. Den Referenzlaboratorien in Eschweiler, Frankfurt a.m., Hamburg, Mannheim, Kiel, München, Rostock, Wien. Den Mitarbeitern von INSTAND! Kai Gutensohn, C. Thomas Nebe; Berlin

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