Firmengründung 1992 GLP-Status seit Neuss Am Röttgen 126

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1 Firmengründung 1992 GLP-Status seit Neuss Am Röttgen 126

2 Fragestellung: Quantifizierung von 5-Methyltetrahydrofolat in Humanplasma und -vollblut

3 Begriffsbestimmung: Folsäure hitzelabiles, lichtempfindliches, wasserlösliches B-Vitamin zu dieser Gruppe gehören über 100 Verbindungen mit ähnlichen Eigenschaften, die man als Folate bezeichnet

4 Struktur der Folsäure

5 Folsäure-Derivate unterscheiden sich: in Oxidationsstufe des Pteridin-Rings (z.b. 5,6,7,8-Tetrahydrofolsäure) durch Bindung von 1-Kohlenstoff-Resten an N-5 und/oder N-10 (z.b. 5-Methyl-THF, 5-Formyl-THF, 5,10-Methylen-THF) Anzahl der Glutamylreste (bis zu 8 möglich)

6 Nahrungsfolate liegen als Pteroylpolyglutamate vor Polyglutamate müssen bei der Verdauung erst in Monoglutamate überführt werden, damit sie resorbiert werden können Monoglutamate = Transportform der Folate (im Plasma) Polyglutamate = Speicherform der Folate (in Erythrozyten)

7 Wichtig für die Analytik: Monoglutamat im Serum bzw. Plasma liegt die Folsäure vorwiegend als 5-Methyl-THF-Monoglutamat vor Erythrozyten enthalten höhere Konzentrationen, hier liegt 5-Methyl-THF jedoch als Polyglutamat vor daher müssen die Erythrozyten im Vollblut zunächst durch Zusatz von 1% iger Ascorbinsäurelösung lysiert werden. durch die plasmaeigene Konjugase werden die Polyglutamate anschließend in Monoglutamate überführt

8 Funktion der Folate im Organismus: Übertragung von 1 Kohlenstoffeinheiten dadurch entscheidende Rolle im DNA-, RNA- und Proteinstoffwechsel

9 Folie der Firma Merck Eprova AG/Schweiz

10 Literaturmethoden zur Quantifizierung von 5-Methyl-THF mittels SPE Probenvorbereitung und LC-MS/MS: in Humanserum: Pfeiffer u.a. (Clinical Chemistry 2004, 50:2, ) in Humanserum und Vollblutlysat: Fazili u.a. (Clinical Chemistry 2004, 50 No.12, )

11 1. Literaturmethode: Herstellung der wässrigen Reinstandardlösungen Herstellung der Kalibrier- und QC-Proben mit und ohne Matrix: µl Reinstandardlösung µl Puffer ph µl ISTD 13 C-markiert µl Wasser bzw. Plasma bzw. Vollblut-Lysat Gesamtvolumen 1.1 ml (Verdünnung der Matrix 1:4)

12 zu 1. Literaturmethode (Fortsetzung): Herstellung der Patientenproben: µl Puffer ph µl ISTD 13 C-markiert µl Wasser bzw. Plasma bzw. Vollblut-Lysat Gesamtvolumen 1.1 ml (Verdünnung der Matrix 1:4) Konditionierung der SPE-Kartusche: - 4 Waschschritte

13 zu 1. Literaturmethode (Fortsetzung): Aufgabe der Probe von 1 ml auf die SPE-Kartusche Waschen der SPE-Kartusche: - 3 Waschschritte Elution mit 1 ml Eluent LC-MS/MS

14 Zusammenfassung der Literaturmethode: Kalibrierung erfolgt mit wässrigen Standards Kalibrierbereich: 0.1 bis 100 ng/ml Verwendung eines stabil-isotopen markierten Standards Geht das auch einfacher???

15 Blutentnahme für die Methodenentwicklung: Gewinnung von Citratplasma und Citrat-Vollblut zur Herstellung des Vollblut-Lysats wird das Citrat-Vollblut 1:10 mit 1% Ascorbinsäurelösung versetzt, 2 h bei RT inkubieren lassen

16 2. TFC-Methode: Herstellung der wässrigen Reinstandardlösungen Herstellung der Kalibrier- und QC-Proben mit und ohne Matrix: µl Reinstandardlösung µl Puffer ph 3.2 bzw. Plasma bzw. Vollblut-Lysat µl 1 ng/ml Methotrexat (=ISTD) in Pufferlösung ph 3.2* - in Deep Well Platte (96 well) pipettieren und mischen Verdünnung der Matrix 1:4 * Pufferlösung ph 3.2 = 10 g/l Ammoniumformiat und 1g/L Ascorbinsäure, mit Ameisensäure auf ph 3.2 stellen

17 zu 2. TFC-Methode (Fortsetzung): Herstellung der Patientenproben: µl Puffer ph 3.2* µl Plasma bzw. Vollblut-Lysat µl 1 ng/ml Methotrexat (=ISTD) in Pufferlösung ph 3.2* - in Deep Well Platte (96 well) pipettieren und mischen Verdünnung der Matrix 1:4 Zentrifugation (20 min bei 4 C) TFC-MS/MS-Messung * Pufferlösung ph 3.2 = 10 g/l Ammoniumformiat und 1g/L Ascorbinsäure, mit Ameisensäure auf ph 3.2 stellen

18 Methotrexat = 4-Amino-N 10 -methylfolat Strukturanalog zu 5-Methyl-THF als ISTD geeignet?

19 Herstellung der Reinstandardlösungen Proben mischen Konditionierung Probenaufgabe Proben mischen Zentrifugieren TFC-MS/MS Waschen Elution LC-MS/MS Methodenvergleich: links: Literaturmethode rechts: TFC-Methode 12 Proben pro h 96 Proben pro h

20 Geräte: API 3000 mit TurboIonspray-Ionisierung (Applied Biosystems) im positiven Modus bei 400 C 2300 HTLC (Cohesive) im Turboflow-Modus HTC PAL Autosampler (CTC) analytische Säule: Polaris (Varian), C18-A, 150x3 mm, 5 µm TFC Säule: Cyclone (Cohesive), 1x50 mm

21 Eluenten: Eluent A für Pumpe 1 (isokratische Pumpe): - 10 g/l Essigsäure in Wasser Eluent B für Pumpe 1 (isokratische Pumpe): - 10 g/l Essigsäure in Wasser/Methanol 30/70 Eluent A für Pumpe 1 (binäre Pumpe): - 10 g/l Essigsäure in Wasser Eluent B für Pumpe 1 binäre Pumpe): - Methanol

22 40 60 Step 0.5 Load A Step 0.5 Load B Step 0.5 Elute A Ramp 0.5 Elute B Step 0.5 Elute A Step 0.5 Load A % A Pump 1 %B Pump 1 Grad Pump 1 Flow Pump 1 CD SD Comp Pump 2 Flow Pump 2 Sec Start Pumpe 1 = binär Pumpe 2 = isokratisch TFC-Bedingungen: Laufzeit 5.83 min

23 Kalibrierbereich (ohne Matrix) 1 bis 200 ng/ml Wichtung 1/x 2

24 Standardaddition zu Plasma 5 bis 200 ng/ml Wichtung 1/x2

25 Standardaddition zu Vollblut-Lysat 5 bis 200 ng/ml Wichtung 1/x 2

26 QC-Proben ohne Matrix: Sollkonzentration [ng/ml] Wiederholungen [n] Präzision [%] Richtigkeit [%] Bias

27 QC-Proben mit Matrix Plasma: Sollkonzentration [ng/ml] Wiederholungen [n] Präzision [%] Richtigkeit [%] Bias

28 QC-Proben mit Matrix Vollblut-Lysat: Sollkonzentration [ng/ml] Wiederholungen [n] Präzision [%] Richtigkeit [%] Bias

29 Koelution von 5-Methyl-THF und ISTD Q 80 ng/ml ohne Matrix blau: Quantifier rot: Qualifier grün: ISTD

30 Beispielchromatogramm: Q 80 ng/ml 5-Methyl-THF ohne Matrix Quantifier MRM 460.2/313.0 RT 2.84 min ISTD MRM 455.2/308.2 RT 2.86 min Qualifier MRM 460.2/180.2 RT 2.84 min

31 Beispielchromatogramm: Q 80 ng/ml 5-Methyl-THF in Plasma Quantifier MRM 460.2/313.0 RT 2.84 min ISTD MRM 455.2/308.2 RT 2.86 min Qualifier MRM 460.2/180.2 RT 2.84 min

32 Beispielchromatogramm: Q 80 ng/ml 5-Methyl-THF in Vollblut-Lysat Quantifier MRM 460.2/313.0 RT 2.84 min ISTD MRM 455.2/308.2 RT 2.86 min Qualifier MRM 460.2/180.2 RT 2.84 min

33 5-Methyl-THF-Gehalt in Plasma: Standardaddition mit Matrix versus externe Kalibrierung ohne Matrix Batch 1 [ng/ml] Batch 2 [ng/ml] externe Kalibrierung mean (n=3) CV% (n=3) Standardaddition (= Referenz) % Abweichung von Referenz

34 5-Methyl-THF-Gehalt in Vollblut-Lysat: Standardaddition mit Matrix versus externe Kalibrierung ohne Matrix Batch 1 [ng/ml] Batch 2 [ng/ml] externe Kalibrierung mean (n=3) CV% (n=3) Standardaddition (= Referenz) % Abweichung von Referenz

35 Fazit: Die Quantifizierung von 5-Methyltetrahydrofolat kann über externe Kalibrierung mit wässrigen Standards erfolgen!

36 5-Methyl-THF-Gehalt in Plasma verschiedener Probanden (berechnet über externe Kalibrierung): Proband Batch 1 [ng/ml] Batch 2 [ng/ml] 1 mean (n=3) CV% (n=3) mean (n=3) ? CV% (n=3) mean (n=3) CV% (n=3)

37 5-Methyl-THF-Gehalt in Vollblut-Lysat verschiedener Probanden (berechnet über externe Kalibrierung): Proband Batch 1 [ng/ml] Batch 2 [ng/ml] 1 mean (n=3) CV% (n=3) mean (n=3) CV% (n=3) mean (n=3) CV% (n=3)

38 Matrixeffekt: QC-Probe 80 ng/ml wird 1:10 anstelle von 1:4 mit Puffer verdünnt tatsächliche Konzentration [ng/ml] Wiederholungen [n] Präzision [%] Richtigkeit [%] Bias ohne Matrix * mit Plasma mit VB-Lysat * * Ausreisser

39 Fazit: Es liegen keine Matrixeffekte vor!

40 LLOQ: ohne Matrix Q 1 ng/ml Peak Area Plasma-Probe 1:3 verdünnt Peak Area VB-Lysat-Probe 1:5 verdünnt Peak Area

41 Q 1 ng/ml ohne Matrix S/N ca. 40:1 LLOQ ohne Matrix

42 Plasmaprobe vor der Aufarbeitung 1:3 mit Puffer verdünnt S/N ca. 50:1 LLOQ mit Matrix Plasma

43 Vollblut-Lysatprobe vor der Aufarbeitung 1:5 mit Puffer verdünnt S/N ca. 50:1 LLOQ mit Matrix Vollblut-Lysat

44 C 200 ng/ml in Vollblut-Lysat Lösungsmittel nach höchstem Kalibrierpunkt Keine Verschleppung!

45 Recovery (= Extraktionsausbeute inklusive Matrixeffekt) von 5-Methyl-THF in Plasma (berechnet über externe Kalibrierung): Reinstandard versus Matrix Plasma (n=3) Q 80 ng/ml in Plasma (n=5) Referenz: Q 80 ng/ml in Lösungsmittel (n=4) Recovery [%] Mean [ng/ml] CV [%]

46 Recovery (= Extraktionsausbeute inklusive Matrixeffekt) von 5-Methyl-THF in Vollblut-Lysat (berechnet über externe Kalibrierung): Reinstandard versus Matrix Vollblut-Lysat (n=3) Q 80 ng/ml in Vollblut-Lysat (n=6) Referenz: Q 80 ng/ml in Lösungsmittel (n=4) Recovery [%] Mean [ng/ml] CV [%]

47 Zusammenfassung: einfache, schnelle Methode zur Quantifizierung mittels TFC-MS/MS im Vergleich zur Literaturmethode können 96 Proben pro Stunde aufgearbeitet werden unter diesen Bedingungen robuste Methode: bisher ca. 500 Injektionen mit der Cyclone-Säule durchgeführt: - keine Veränderung der Peakform - keine Retentionszeiten-Schwankung - kein Druckanstieg Verwendung des Strukturanalogs Methotrexat als ISTD ist möglich

48 Hiermit möchte ich mich bedanken: bei der Firma Cohesive, insbesondere bei Herrn Dr. Gügel, für die fachliche Unterstützung und die Überlassung der Cyclone-Säulen zu Testzwecken bei der Firma Merck EPROVA, insbesondere bei Herrn Weibel, für die Überlassung der Vergleichungssubstanz Metafolin und der gezeigten Folie bei meinen Kolleginnen Frau Enders, Frau Moosbauer, Frau Sala und Frau Schillinger, die für diese Versuche im wahrsten Sinne des Wortes bluten mussten