4 Hämatopoetische Stammzellen

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1 4 Hämatopoetische Stammzellen 1

2 Was erwartet Sie in dieser Vorlesung? (heute und in den kommenden Wochen) 1 - Einführung: Hype and Hope von SZ 2 - Definitionen, allg. Begriffe, Gewinnung, Kultivierung 3 - Embryonale SZ 4 - Adulte SZ: HSCs 5 - Adulte SZ: MSCs 8 - Tumor-SZ 11 - ips 6 - Signalvermittlung 7 - SZ-Nischen 9 - Pluripotenz 10 - Epigenetik 11 - Reprogrammierung Regenerative Medizin, Tissue Engineering Biomaterialien, Zell- und Gewebetransplantate Biologische und Gentherapien Verschiedene Gewebeund Organsysteme und assoziierte Erkrankungen: Bindegewebe Neuronale Gewebe Herz 2

3 Stammzellen für therapeutische Anwendung Stammzelltransplantation Embryonale versus adulte SZ versus ipsz ES- und IPS-Zellen lassen sich in praktisch alle Zelltypen differenzieren (pluripotent), während adulte Stammzellen ein deutlich beschränkteres Entwicklungspotential besitzen (multipotent). Außerdem haben sie in der Regel eine beschränktere Lebenszeit. Sind pluripotente SZ oder adulte Stammzellen besser für medizinische Therapien geeignet? ES: Probleme sind Tumorigenität und die Gefahr von Immunantworten bei heterologer (allogener) Anwendung, Einsatz xenogener Substanzen (Serum, Feederzellen) IPSZ: maligne Entartung und autologe Anwendung möglich Adulte SZ: keine maligne Entartung, autologe Anwendung möglich. Limitierte Vermehrung in Zellkultur. 3

4 Unterschiede zwischen adulten und embryonalen SZ nicht pluripotent unterschiedliche Typen je nach Gewebe geringere Telomerase-Aktivität (wichtig für Erhalt der Chromosomenintegrität) limitierte Vermehrung in Zellkultur Ruhender Zustand: Aufenthalt in Nische in vivo 4

5 Hämatopoetische SZ myeloid lymphoid

6 Indikationen für KMT (Knochenmark- od. SZ-Transplantation) Passweg JR et al.: Hematopoietic SCT in Europe: data and trends in Bone Marrow Transplantation (2013) 48, Indikationen für autologe KMT n = (58 %) Indikationen für allogene KMT n = (42 %) BMF: bone marrow failure; HD: Hodgkin s disease; IDM: inherited disorders of metabolism; MDS: myelodysplastic syndrome; MPS: myeloproliferative syndrome; NHL: non-hodgkin s lymphoma; PCD: plasma cell disroder; PID: primary immunodeficiency. 6

7 Indikationen für KMT AML: acute myeloid leukemia, ALL: acute lymphatic leukemia, CML: chronic myeloid leukemia, MDS/MPS: myelodysplastic syndrome/myeloproliferative syndrome, CLL: chronic lymphatic leukemia, PCD: plasma cell disorders, HD: hodgkin lymphoma, NHL: non Hodgkin lymphoma, BMF: bone marrow failures, Hemo/thal:hemoglobinopathies, PID: primary immune deficiencies, 7 IDM:inherited disorders of metabolism, AID: auto immune disease.

8 SZ-Quellen für allogene KMT BM = bone marrow. PBSC = peripheral blood stem cells 8

9 Zentren für KMT in Deutschland 9

10 Transplant rates in Europe (= total number of HSCT per 10 million inhabitants) by participating country. (a) Allogeneic transplant rates per 10 million population in (b) Autologous transplant rates per 10 million population in

11 CD: cluster designation, cluster of differentiation CD: cluster designation or cluster of differentiation Nomenclature proposed in 1982 at First International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA); now called (Human) Cell Differentiation Molecules Classification system for monoclonal antibodies generated by laboratories worldwide against cell surface molecules on leukocytes initially, now also antigens from other cell types Must be at least two monoclonal antibodies for each antigen w" indicates that the CD is not well characterized or is represented by only one monoclonal antibody Interpretation should be based on cellular distribution of staining (i.e. membranous, cytoplasmic, nuclear), proportion of positively stained cells, staining intensity and cutoff levels Used in immunohistochemistry and flow cytometry References: J Immunol 1994;152:1, Bull World Health Organ 1997;75:385, J Immunol Methods 2003;275:1-8, Blood 2005;106:

12 Hämatopoetische Stammzellen (Maus) KLS-Zellen (Hematopoietic stem and progenitor cells) TyrK-Rezeptor c-kit vorhanden ( positiv ) Lineage differentiation markers Lin (B220, CD4, CD8, Gr-1, Mac-1, Ter- 119) nicht oder nur wenig vorhanden Antigen Sca-1 vhd. (Stem cell antigen, positiv ) =: ckit pos Sca-1 pos Lin neg/low CD150 + CD48-12

13 Fate through Fat : Lipidstoffwechsel reguliert die Art der SZ-Teilung bei HSZ Ito K et al.: A PML-PPAR-d pathway for fatty acid oxidation regulates hematopoietic stem cell maintenance. Nature Medicine 18/9: (2012) Bone marrow transplantation PML: promyelocytic leukemia (Tumorsuppressorgen) PPAR-d: peroxisome proliferator-activated receptor FAO: (long chain) fatty acid oxidation 13

14 Erythrozyten-Bildung aus HSCs erfordert Glutamin Oburoglu L. et al.: Glucose and Glutamine Metabolism Regulate Human Hematopoietic Stem Cell Lineage Specification. Cell Stem Cell 15: (2014) und CD34-neg. Glucose-Transporter Glutamin-Transporter (transportiert auch neutrale aa) Marker myeloide Zellen 6 d repo Glycophorin (Erythrozytenmarker) 14

15 Erythrozyten-Bildung aus HSCs erfordert Glutamin GlyA CD36 Tag 10 DON: 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin: Glutaminase-Inhibitor May-Grünwald-Giemsa staining of cytospins 15

16 Lis1 ist für die Aufrechterhaltung von HSCs essentiell Zimdahl B. et al.: Lis1 regulates asymmetric division in hempaopoietic stem cells and in leukemia. Nature Genetics 46 (3): (2014) und Verlust von wichtigen Genen der Stammzellsignatur von HSCs (Transkriptomanalysen) Genetic deletion of Lis1 impairs establishment of the hematopoietic system during embryonic development. Representative images of control and Lis1 / (Lis1f/f; Vav1-cre) littermates at E14.5. Lis1 is required for adult HSC self-renewal. Average frequency of HSCs (KLS Flt3 or KLSF cells) in whole bone marrow (WBM) from tamoxifen-treated control (Lis1 +/+ ; Rosa26- creer, indicated as wild type, WT) and tamoxifen-treated Lis1-floxed (Lis1f/f; Rosa26- creer, indicated as Lis1 / ) mice. 16

17 Lis1-Deletion behindert die korrekte Vererbung von Schicksals -Determinanten 17

18 Lis1 kontrolliert die korrekte Ausrichtung der Mitosespindel 18

19 19

20 Hämatopoetische Stammzellen (Mensch) CD34 + CD38 - CD34: Intercellular adhesion protein and cell surface glycoprotein; ligand is CD62L (Lselectin) Defines adult hematopoietic stem cells; can also differentiate into neural cells CD38: Multifunctional enzyme; ligand is CD31. Functions: (a) synthesizes cyclic ADPribose, a second messenger for glucose-induced insulin secretion; (b) positive and negative regulator of cell activation and proliferation, depending on the cellular environment; (c) involved in adhesion between human lymphocytes and endothelial cells; (d) considered an activation marker; (e) may cause physiologic death of T cell precursors in human thymus. plasma cells (strong), committed hematopoietic progenitor cells, NK cells, B and T cells, monocytes, erythroid and myeloid precursors; neurons and perivascular autonomic nerve terminals, pancreatic islets, thymocytes 20

21 Wiscott-Aldrich Syndrom (WAS): eine Seltene Erkrankung Thrasher AJ und Burns SO: WASP a key immunological multitasker. Nature Reviews Immunology 10, S (2010) Leit-Symptome: komplexe Immundefizienz mit schweren wiederkehrenden Infektionen (z.b. Lungenentzündungen), Thrombozytopenie, Hämatome (Blutungen und unzureichende Blutgerinnung), Ekzemen (Hautausschläge), Autoimmunität, Leukämien, Lymphome unbehandelt: Tod im frühen Kindesalter (max. 10 Jahre) X-chromosomal rezessiv vererbt, nur bei Jungen 21

22 Das WAS-Protein (WASP) Schlüsselregulator der Aktin- Polymerisation (nur in hämatopoetischen Zellen!!!!) Signalvermittlung Zellbewegung Bildung der immunologischen Synapse Eingeschränkte Aktinbildung führt zu verminderter Thrombozytenbildung 22

23 WASP und Lymphozyten-Homöostase 23

24 Stammzell-vermittelte Gentherapie für WAS Boztug, K. et al.: Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. New England J. of Medicine 363 (20), S (2010) hämatopoetische Stammzellen: CD34 + Transduktion mit WASP-exprimierenden RV RE-Infusion 4 Tage später 24

25 Rückbildung des Ekzems Patient 2 Vor Gentherapie 6 Monate nach Gentherapie 12 Monate nach Gentherapie 24 Monate nach Gentherapie 25

26 Fluoreszenz (WASP) Proteinexpression (FACS) in Leukozyten Patient 1 Patient 2 nach Gentherapie (Monate) WASP-Expression steigt rasch an und bleibt hoch 9 bzw. 20 % der CD34-positiven Zellen (Patient 1 bzw. 2) exprimieren WASP: chimäre Progenitorzellen 26

27 Proteinexpression im Western Blot Patient 2 PBMC: peripheral blood mononuclear cells P: Blutplättchen (Thrombozyten) nach Gentherapie (Monate) HC: Healthy Control WAS: Kontrollpatient ohne Gentherapie 27

28 Bildung einer immunologischen Synapse zwischen natürlichen Killerzellen (NK) und Tumorzellen (K562) HC: Healthy Control WAS: Kontrollpatient ohne Gentherapie Patient 2 1 Jahr nach Gentherapie DIC: differential interference contrast microscopy Perforin 28

29 Stammzell-vermittelte Gentherapie für WAS: Langzeitbericht Braun, J.C. et al.: Gene Therapy for Wiskott-Aldrich Syndrome Long-term efficacy and genotoxicity. Science Translational Medicine 6 (227), 227ra33 (2014) 29

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