Einführendes Praktikum in die HPLC

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1 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 1 Universität Regensburg LS für Organische Chemie Prof. B. König Abteilung Instrumentelle Analytik CH Einführendes Praktikum in die HPLC Skript WS 2014/15 Dr.R.Vasold

2 Seite 2 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Inhalt I Theoretischer Teil I.1 Einleitung... 4 I.2 Zielsetzung... 4 I.3 Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP- Phase (reversed-phase-phase)... 5 I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen... 7 I.4 Die mobile Phase (Eluent)... 7 I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen... 7 I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen... 9 I Die Isokratische-Elution I Die Gradienten-Elution I.5 Die Pumpen I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme I.6 Die Injektionseinheit I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) I.6.2 Die manuelle Injektion I.7 Der Detektor I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD).. 17 I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil... 19

3 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 3 II Experimenteller Teil II.1 Einleitung II.2 Durchführung II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen II Vorbereitung der Stammlösungen II Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung II Vorbereitung der Probenlösungen II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen II Die Pumpen-Programmierung II Die Programmierung des Injektionsvolumens II Die Detektor-Programmierung II Die Programmierung des Säulenthermostaten II Die Einstellung der Integrationsparameter II Die Programmierung des Autosamplers II Das Starten der Proben-Sequence II.2.3 Die quantitative Auswertung II Der Menüpunkt: Data-Analysis II Das Erstellen der Kalibriertabelle II Das Erstellen des quantitativen Reportes I.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil III Auswertung Theoretischer Teil IV Auswertung Experimenteller Teil... 31

4 Seite 4 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Einführendes Praktikum in die HPLC I Theoretischer Teil I.1 Einleitung Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) ist eine leistungsfähige Methode zur analytischen, wie auch präparativen chromatographischen Trennung und quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Verbindungen fast aller Klassen. Für fast alle Verbindungen, die man in Lösung bringen kann, kann man in der Regel auch ein chromatographisches Trennsystem finden, mit dem man die Verbindungen trennen und anschließend qualitativ oder quantitativ bestimmen kann. Aber: die HPLC ist (noch) keine Knopfdruckmethode! Ihre erfolgreiche Anwendung erfordert die richtige Auswahl des chromatographischen Trennsystems, sorgfältiges, sauberes Arbeiten und viel Fingerspitzengefühl. Man muss die Eigenschaften der zu trennenden Substanzen und ihr Verhalten im Trennsystem abschätzen können, man muss Misserfolge bei der Trennung erklären können und sich am besten durch viel Praxis einen großen Erfahrungsschatz erwerben. I.2 Zielsetzung Das Ziel dieses Teils des Praktikums ist es, dem Studierenden eine Einführung in die HPLC zu geben. In diesem Praktikum sollen u.a. die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Trennsystems kennen gelernt werden, wie - die stationäre Phase (in diesem Fall eine sog. RP-Phase, d.h. reversed phase-phase) und ihr "Behälter", die Trennsäule. - die mobile Phase mit Eluentenversorgung, - Pumpen und Einspritzventil (Autosampler), - der Detektor, - die Steuerungs- und Auswertesoftware; die Trennleistung eines Systems an einem einfachen Beispiel beurteilt werden;

5 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 5 wichtige chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durchbruchszeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. bestimmt werden. die quantitative Bestimmung einer chemischen Substanz in verschiedenen Realproben mit der Methode des Internen Standards durchgeführt werden. Im folgenden werden die Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Systems näher beschrieben. I.3. Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-phase) RP-Phasen gehören zu den sog. chemisch modifizierten Kieselgelphasen, von denen eine kaum noch überschaubare Vielfalt im Angebot ist. Bei den RP- Phasen ist die normalerweise polare, nicht chemisch modifizierte, Kieselgeloberfläche (normal-phase) durch kovalent gebundene, hydrophobe Reste (z.b. C-18-Ketten [RP-18], C-12-Ketten [RP12], C-8-Ketten [RP8] usw.) unpolar gemacht worden (sog. endcapping ). Über die chemischen Einzelheiten der Herstellung solcher Festphasen und die verschiedenen Typen, sowie über die Eigenschaften (Einheitlichkeit der Korngröße, Porosität) und die Charakterisierung von RP-Phasen muss man sich in geeigneten Büchern oder beim Hersteller informieren. RP-Phasen haben gegenüber Normal-Phasen aber eine Reihe von Vorteilen, die dazu geführt haben, dass heute weit über 90% aller Trennungen auf RP-Phasen durchgeführt werden. Neben der öfteren Wiederverwendbarkeit (bei guter Pflege) liegt der wesentliche Vorteil in der schnellen Einstellung der Gleichgewichte beim Eluentenwechsel und der deutlich erhöhten Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten. Diese Eigenschaften sind vor allem beim Gradientenbetrieb sehr wichtig. C18-Ketten N Probensubstanz Beispiel einer Probensubstanz Cl N CH 3 CH 3 H O H Si Si O Si H H H H H H H H O O O O O O H O O H O O Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Silicagel H O Si H O H O Si Si Si Durch fast vollständiges endcapping sind weniger Wechselwirkungen mit noch freien Silanolgruppen (SiOH) möglich. Folge: scharfe Peakform Abb. 1.3.a Schematische Darstellung eines relativ gut endgecappten C18-Materials.

6 Seite 6 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Im Versuch wird eine RP-18- Phase vom Typ LUNA RP18 der Firma Phenomenex verwendet (also eine Phase mit einem entsprechend hydrophobem Schild auf der Kieselgelbasis). Bei Kieselgeloberflächen, bei denen nicht alle ursprünglich vorhandenen Silanolgruppen mit unpolaren Ketten modifiziert wurden, liegt ein je nach Hersteller unterschiedlicher Anteil der Silanolgruppen noch unmodifiziert vor. Wegen der schwach sauren Eigenschaften der Silanolgruppen verleiht dieser Restanteil den diesen nicht vollständig endgecappten" RP-Phasen gewisse Ionenaustauscheigenschaften. Für ungeladene Substanzen hat das meist keine nachteiligen Folgen. Geladene Substanzen, bzw. Substanzen, die in Abhängigkeit vom ph-wert ihren Ladungszustand ändern, z.b. saure Substanzen (z.b. Phenole) und besonders basische Substanzen (Amine, N-Heterocyclen) neigen jedoch auf solchen "nicht vollständig endgecappten RP-Phasen zur Bandenverbreiterung und zum Tailing. Bei manchen Aminen kann dieser unerwünschte Effekt so stark sein, dass man keine ausreichenden Trennungen erzielen kann. Deshalb gibt es heute viele spezielle RP-Phasen für basische Verbindungen. Bei diesen speziellen RP-Phasen werden auch die restlichen Silanolgruppen noch meist mit kürzeren organischen Resten (z.b. C12) möglichst vollständig modifiziert. C18-Ketten Verbindung interagiert mit noch freien Silanolgruppen H O H Si Si O Si N N C H 3 Cl C H 3 H H H H H H H H H H H H H H O O O O O O O O H O O O H O O O Si Si Si Si Si Si O H Si Si Si Si Si Si Si Si Si O Si Si O Si Si Si Si Si H O Si Folge: Bandenverbreiterung und Peaktailing Silicagel Abb. 1.3.b Schematische Darstellung eines relativ schlecht endgecappten C18-Materials. Viele (heterocyclische) Diamine und andere Substanzen, die als Chelatliganden wirksam sein können (2,2 -Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur endgecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein Gerüst-Kieselgel, das völlig frei ist von Schwermetallverunreinigungen (z.b. Merck: Purospher ).

7 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 7 I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen Hauptursachen für die Schädigung von RP-Phasen und anderen Festphasen sind: 1. Verunreinigungen und Verstopfungen am Säulenkopf durch irreversibel retardiertes (Proben)-Material oder unlösliche Bestandteile (Staub, Pumpenabrieb) in Probe oder Eluent. Abhilfe: Bessere Eluenten- und Probenvorbereitung (Filtration des Eluenten und der Probe); Verwendung von guard-columns (=Vorsäulen); Säulenspülung mit geeignetem Eluenten. 2. Schrumpfung der Festphase bei Anwendung extremer ph-werte. Abhilfe: Verwendung von "gepufferten Eluenten" 3. Falsche Säulenaufbewahrung. Wegen Pilzwachstum (Pufferlösungen!) und der Gefahr des Auskristallisierens von Puffersalzen, sollen Säulen niemals in 100% Wasser oder gar in Pufferlösungen aufbewahrt werden. RP-Pasen müssen nach Verwendung von Puffern gut mit Wasser und anschließend mit Methanol od. Acetonitril gespült werden. Als Eluent für eine längere Aufbewahrung empfiehlt sich eine Mischung aus 20% H 2 O und 80% Acetonitril. I.4 Die mobile Phase (Eluent) I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen In der Normal-Phasen-Chromatographie besteht die mobile Phase aus einem unpolaren organischen Lösungsmittel(gemisch), dem nur in bestimmten Fällen (welchen?) etwas polares Lösungsmittel oder gar Wasser (in geringen Mengen) zugesetzt wird. Die Elutionskraft oder Stärke der verschiedenen Eluenten wurde empirisch bestimmt und ist für jeden Eluenten als Zahlenwert festgehalten. Als Symbol dafür verwendet man E 0 oder ε 0. Die so gefundene Reihenfolge von schwachen zu mittleren bis hin zu starken Eluenten nennt man die Eluotrope Reihe. Es zeigt sich, dass darin die Eluenten nach ihrer Polarität geord-

8 Seite 8 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 net sind. Ein (in der NP-Adsorptionschromatographie) stärkerer Eluent ist immer polarer, ein schwächerer unpolar: Eluent Polarität [E 0 ] UV-Grenze [nm] n-hexan 0, Toluol 0, Chloroform 0, Dichlormethan 0, Aceton 0, Essigsäureethylester 0, Dimethylsulfoxid 0, Diethylamin 0, Acetonitril 0, Ethanol 0, Methanol 0, Wasser >1,11 <190 * im angegebenen Chromatographiemodus (RP/NP) häufig, aber nicht ausschließlich verwendet. Wichtige Voraussetzung ist die Mischbarkeit der Eluenten Tab Eluotrope Reihe (Auszug) (Lit.: Meyer V.R. Praxis der Hochleistungsflüssigchromatographie Salle+Sauerländer 7, S. 110ff). Die angegebenen E 0 -Werte gelten streng genommen für Aluminiumoxid als Adsorbens, doch sind sie für Silicagel nur um einen konstanten Faktor verschieden: E 0 (SiO 2 ) = 0,77 E 0 (Al 2 O 3 ). Die Lösungsmittelreihenfolge ändert sich also nicht, wenn man von Aluminiumoxid auf Silicagel übergeht. In der linken Spalte ist angegeben, bei welcher Chromatographieart die Eluenten häufiger Verwendung finden. NP-Chromatographie* RP-Chromatographie* In der RP-Chromatographie ist es umgekehrt: Dort besteht die mobile Phase in der Mehrzahl der Fälle aus einem überwiegend polaren Eluenten. Stark polare Eluenten, (z.b. Wasser) verzögern die Elution. Beimengungen von dazu schwächer polaren Eluenten (z.b. MeOH, Acetonitril) beschleunigen sie. Bei Standardtrennungen ist meist Acetonitril im Vergleich zu Methanol die bessere Wahl (warum?). Das verwendete Wasser muss stets sehr rein sein (Millipore-Qualität) und darf insbesondere keine organischen Verunreinigungen enthalten (deshalb niemals Wasser verwenden, das lediglich mit Ionenaustauschern entionisiert wurde).

9 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 9 Weiterhin sollten die Eluenten (besonders das Wasser) keine gelösten Gase enthalten (warum?). Deshalb müssen die Eluenten vor Gebrauch sorgfältig entgast werden. Für diese Zwecke sind verschiedene Verfahren im Gebrauch: Vakuumentgasung, Membranfiltration, Ultraschall, Heliumspülung (Helium ist in Wasser unlöslich und transportiert die in Wasser gelösten Gase, die mit Helium mischbar sind, ab). Ganz wichtig ist auch, dass die Eluenten (ebenso wie die Probenlösung) frei von Partikeln (z.b. Staub, ungelöste Substanzrückstände etc.) sind, die die sehr feinen Einlassfritten (2 m) der Trennsäule verstopfen könnten oder gar die Pumpenköpfe schädigen könnten. Eine (Membran)-Filtration der Eluenten oder der Gebrauch von Einlassfiltern ist deshalb unerlässlich. Besondere Vorsicht ist bei der Verwendung von wässerigen Salzlösungen (Puffern) angeraten. Es muss sicher gestellt sein, dass es nicht zu Ausfällungen kommt, wenn die wässerige Pufferlösung mit einem organischen Lösungsmittel vermischt wird. Niemals darf ein Eluentengemisch, das eine wässerige Salzlösung enthält, nach Beendigung der Trennung im HPLC-System verbleiben. Totalschäden an Pumpen, Säulen und Detektorzellen sind vorprogrammiert, wenn darin Salze im Laufe der Zeit auskristallisieren! I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen Im Versuch werden Gemische aus Wasser und Acetonitril verwendet mit einem Volumenanteil Acetonitril zwischen 0,10 und 0,95 (0,10 < < 0,95). Dies entspricht einer Eluentenzusammensetzung von 10% ACN bis 95% ACN gegen H 2 O im Verlauf der Trennung. Anmerkung: Man muss sich leider damit abfinden, dass in fast allen HPLC-Büchern und Arbeitsanweisungen die Zusammensetzung der mobilen Phase nicht so wie oben unter Verwendung der definierten Gehaltsgröße σ "Volumenanteil", sondern oft nicht ganz eindeutig angegeben wird. So heißt es z.b. oft: "Methanol/Wasser 50:50" oder "50% Wasser in Methanol" etc. Man kann dann aber davon ausgehen, dass damit der Volumenanteil gemeint ist, weil dies der gängigen Arbeitsweise entspricht. Beim Einsatz der mobilen Phasen unterscheidet man generell zwischen zwei Arbeitsweisen: Der isokratischen Elution und der sog. Gradientenelution.

10 Seite 10 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 I Die Isokratische-Elution D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Trennung nicht. Die Eluenten werden im benötigten Verhältnis vorgemischt und entgast und können dann von z.b. nur einer Pumpe gefördert werden. - Vorteil: es wird nur eine Pumpe benötigt; - Nachteil: mangelnde Flexibilität, denn bei wechselnden Trennproblemen oder in der Erprobungsphase eines neuen Eluentensystems muss der Vorratsbehälter der mobilen Pase häufig gewechselt werden. Erfahrung oder langwierige Erprobungen sind nötig, um ein geeignetes isokratisches Eluentengemisch zu optimieren (Zeitaufwendig!!). I Die Gradienten-Elution D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Trennung! Man spricht von binären Gradienten, wenn sich die mobile Phase aus zwei, von ternären bzw. quaternären Gradienten, wenn sie sich aus drei, bzw. vier Bestandteilen zusammensetzt. Der zeitliche Verlauf der Änderung der Zusammensetzung kann mit Hilfe der Steuerungssoftware programmiert werden. Auf diese Weise sind viele Arten von Gradientenverläufen (linear, konvex, konkav, stufenförmig) möglich. Meist jedoch sind lineare Gradienten völlig ausreichend. - Vorteil: hohe Flexibilität; Bewältigung von schwierigen Trennproblemen, die isokratisch nicht zu lösen sind; Verkürzung von Analysenzeiten bei stark retardierten Substanzen; - Nachteil: es werden oft mehrere Pumpen (Hochdruckgradient) bzw. komplexere Pumpensysteme benötigt. Erfahrungen im Gradientendesign sind nötig. So muss man z.b. wissen, dass Methanol-Wasser-Gemische zur Bildung von Gradienten nicht optimal sind, weil die Mischungsreaktion stark exotherm ist, sowie eine Volumenverminderung und eine Viskositätserhöhung (Druckerhöhung!) eintritt. Gemische aus Acetonitril und Wasser sind in dieser Hinsicht viel unproblematischer.

11 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 11 I.5 Die Pumpen I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem Über die raffinierten technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktion der Pumpen muss man sich in geeigneten Büchern informieren. Als die zwei wichtigsten Anforderungen, die an die Pumpen gestellt werden müssen, seien genannt: Es muss eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit gewährleistet werden. Von der Fließgeschwindigkeit sind die Retentionszeiten der Peaks und damit die Reproduzierbarkeit der Messung abhängig. Es muss ein möglichst pulsationsfreier Fluss gewährleistet werden, weil sonst die Grundlinie des Detektors zu unruhig wird, und Druckstöße die stationäre Phase schädigen können. Die van Deemter-Gleichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC) zeigt, dass sich die Bodenzahl einer Trennsäule und damit die Güte einer Trennung durch die Steigerung der Fließgeschwindigkeit über einen bestimmten Wert hinaus nicht mehr wesentlich optimieren lässt. Abgesehen davon, würde der Rückdruck bei zu hohen Fließgeschwindigkeiten und sehr kleinen Korngrößen der stationären Phase (< 3 m) auch viel zu hoch werden. I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme Auslaßventil Kolben Membran Kolben Einlaßventil Hydraulik-Flüssigkeit Abb a Kolbenpumpe Abb b Diaphragmapumpe

12 Seite 12 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 I.6 Die Injektionseinheit I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) Moderne HPLC-Anlagen sind fast ausschließlich mit einer automatischen Probengeber-Einheit ausgestattet. Die Vorteile liegen nicht nur in einer deutlichen Zeitersparnis beim Abarbeiten größerer Probenmengen, sondern auch in der außerordentlichen Reproduzierbarkeit und Präzision des Einspritzvorganges. I.6.2 Die manuelle Injektion Das Probeninjektionsventil bei der manuellen Injektion ist ein wichtiges, empfindliches und verschmutzungsanfälliges Einzelteil einer HPLC-Anlage. In Verbindung mit einer Probenschleife gestattet es die Injektion eines definierten Probenvolumens in ein HPLC-System, das unter hohem Druck steht. Über die technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktionsweise muss man sich in geeigneten Büchern informieren. Sollte man einmal in Ermangelung eines Autosamplers auf die Benutzung eines manuellen Injektionsventils angewiesen sein, seien hier einige wichtige Bedienungshinweise zur geflissentlichen Beachtung genannt: Niemals das Ventil ohne Lösungsmittelfluss betätigen. Vor jedem Einspritzen einer Probe muss die Probenschleife gespült werden. Das kann per Hand mit einer Spritze geschehen. Zum Einspritzen der Probe dürfen nur spezielle Mikroliterspritzen mit stumpfen Endungen verwendet werden, damit die Dichtungen im Inneren des Ventils nicht beschädigt werden. Der Umschaltvorgang des Ventils von der "load"- auf die "inject"-stellung, der ja bei laufenden Pumpen erfolgt, muss zügig und schnell erfolgen, da es sonst zu einem Druckstoß im System kommen kann, der die Säulenpackung schädigen kann oder eventuell die Sicherheitsabschaltung des gesamten Systems auslöst. Das Probeninjektionsventil kann zu einer Quelle von Verunreinigungen werden, wenn es nicht regelmäßig gereinigt und gepflegt wird.

13 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 13 I.7 Der Detektor Ohne Detektor ist jedes Chromatographiesystem blind. Es gibt eine Vielzahl von Detektionsverfahren. Diejenigen, die auf der Absorption von UV- oder sichtbarer Strahlung beruhen, haben einen großen Einsatzbereich. Viele organische und anorganische Moleküle (Aromaten, Carbonylverbindungen, etc.) absorbieren im mittleren UV-Bereich (250nm - 300nm) mit ausreichend großen Absorptionskoeffizienten (Lambert-Beersches-Gesetz). Wenn das nicht ausreicht, kann man auch in das kurzwellige UV (190nm - 250nm) wechseln. Dann allerdings ist eine etwaige Eigenabsorption der Eluenten zu berücksichtigen. Spalt Gitter Lampe Deuteriumlampe (UV/VIS) Flußzelle Photozelle Abb. 1.7.a: Schematische Darstellung eines einfachen UV/VIS-Detektors (z.b. sog. VWD- oder MWD-Detektor) mit einstellbaren Einzel- Wellenlängen (nicht kontinuierlich). Anstelle eines einfachen UV/VIS-Detektors (Abb. 1.7.a), bei dem man meist nur eine bestimmte Wellenlänge auswählen kann, ist es besser, ein spezielles, computerunterstütztes Spektrophotometer, den Photodioden-Array-Detektor (DAD) mit sog. inverser Optik zu verwenden (siehe Abb. 1.7.b). Die Bezeichnung inverse Optik bedeutet, dass hier die Messzelle nicht nach, sondern vor dem spektralen Gitter angebracht ist. Das gesamte Licht fällt so durch die Flusszelle und wird erst danach am Gitter spektral aufgeteilt. Der spektrale Lichtfächer fällt dann auf ein Dioden-Array. Dies ist ein Chip mit zahlreichen ( ) lichtempfindlichen Photodioden. Diese Dioden werden kontinuierlich in sehr kurzer Zeit (ca. 50 ms) elektronisch ausgelesen und daraus eine Vielzahl von UV-Spektrum generiert. Der DAD-Detektor ist somit in der Lage, während einer chromatographischen Trennung die kompletten UV-Spektren aller Peaks zu registrieren und abzuspeichern. Dies ist besonders wichtig zur Peakidentifikation, zur Reinheitskontrolle (Peak-Purity-Check) und zur Ermittlung optimaler Detektionswellenlängen bei der Untersuchung unbekannter Proben.

14 Seite 14 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Spalt Gitter Photodioden Flußzelle Deuteriumlampe Lampe (UV/VIS) Abb. 1.7.b: Schematische Darstellung eines Diodenarray-Detektors (DAD-Detektor) Weitere häufig eingesetzte HPLC Detektoren sind: HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität UV/VIS bzw. selektiv für UV/VIS-aktive ca. 0,3 ng/ml ca. 1 x 10 4 DAD (Dioden-Array-Det.) Analyte (ca nm) RI (Refractive-Index-Det.) Analyte mit ca. 0,7 g/ml ca. 3 x 10 3 unterschiedlichem Brechungsindex zum Eluenten (temperaturabhängig, keine Gradientenelution möglich, wenig empfindlich) FLD (Fluorescence-Det.) selektiv nur für fluoreszierende Analyte ca. 0,2 pg/ml (!) ca ECD (Electro-Chemical- selektiv nur für oxidierbare ca. 1,0 pg/ml (!) - Det.) bzw. reduzierbare Analyte CD (Conductivity-Det.) Ionen a) ca ELSD (Evaporative-Light Scattering-Det.) MSD (Mass-Selective-Det.) speziell geignet für Substanzen, die im UV/VIS nicht absorbieren z.b. Zucker, Salze (Gradientenelution möglich) für alle im MS ionisierbaren Analyte a) kann bis zu ca. 0,2% Unterschied in der Leitfähigkeit nachweisen. Tab. 1.7 Übersicht über häufig eingesetzte HPLC-Detektoren:

15 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 15 I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software Bei modernen HPLC-Anlagen werden alle zugehörigen Einzelgeräte (Probenaufgabe, Pumpen, Säulenthermostat, Ventile, Detektoren) von einem Rechner aus gesteuert. Die dafür nötige Software übernimmt auch die Darstellung, Speicherung und Verwaltung der Chromatographie-Daten. Nach Aufnahme des Chromatogramms muss die Software natürlich auch die Bearbeitung und Auswertung des Chromatogramms übernehmen und einen passenden Ausdruck der Ergebnisse liefern. Bei älteren HPLC-Anlagen, bei denen die Steuerung der Geräte nicht zentral von einem PC aus erfolgt, übernimmt ein separater Integrator die Aufzeichnung und Auswertung der Chromatogramme (heute nicht mehr gebräuchlich). Bei quantitativen Analysen ist die Ermittlung der Peakflächen (Integration) wohl die wichtigste Aufgabe der Auswerte-Software. Die beste Voraussetzung zur exakten Ermittlung der Peakflächen liegt vor, wenn die einzelnen Peaks völlig getrennt sind (Grundlinientrennung), und wenn die Grundlinie konstant verläuft. Zwar kann eine gute Integrationssoftware auch überlappende oder aufsitzende Peaks integrieren und auch eine eventuelle Drift der Grundlinie berücksichtigen, jedoch ist es immer angebracht, zunächst die Trennung zu optimieren oder die Probenvorbereitung zu verbessern um Störpeaks zu beseitigen. Für die Integration der einzelnen Peaks benötigt die Software die sog. Peakverarbeitungsparameter, die entweder vom Anwender gesetzt, oder aus den Chromatographie-Rohdaten automatisch ermittelt werden. Die beiden wichtigsten Peakverarbeitungsparameter sind: - Peak-Width: legt die minimale Breite (in Sekunden) eines Peaks fest, der ausgewertet werden soll. Optimaler Wert: Halbwertsbreite des schmalsten interessierenden Peaks. - Slope-Sensitivity: legt Beginn und Ende eines Peaks fest (Peakerkennungsempfindlichkeit). Wenn die ermittelte positive (Peakbeginn) bzw. negative Steigung (Peakende) einen vorgegebenen, aus den Schwankungen der Grundlinie ermittelten Wert erreicht kommt es zur Peakerkennung durch die Software.

16 Seite 16 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD) In der HPLC ist es von größter Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhaltenen Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten Bedingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten erlauben. Als Meßgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei exakt symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß herangezogen werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge der zu analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der Konzentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten abhängig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Konzentration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vorzugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleichbarer Korrekturfaktor verwendet werden. I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchenden Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard eingesetzt werden soll, muss aber unbedingt einige wichtige Bedingungen erfüllen: sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vorkommen. sie muss chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Komponenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der Säule und der verwendeten mobilen Phase. sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen. sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften (Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestimmende Substanz verfügen. sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in vergleichbarer Konzentration zugesetzt werden. Nach der HPLC-Analyse einer Eichlösung, welche die Stammlösung mit den genauen Einwaagen der zu bestimmenden Probenkomponenten, die als reine Referenzsubstanzen verfügbar sein müssen, und den internen Standard in ähn-

17 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 17 lichen Konzentrationsverhältnissen wie in der Realprobe enthält, lässt sich für jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KFi aus den Response-Faktoren f Tr und f i nach folgenden Zusammenhängen ermitteln: (1) f i = ai f i = Response-Faktor der m Komponente i i a i m i = Fläche der Substanz i = Masse der Komponente i (2) KF i = f f Tr i K K mi atr = K K mtr a i KF i = Kalibrierfaktor der Komponente i f Tr = Response-Faktor destracers m i K = Masse der Komponente i in der Kalibrierlösung (K) m K Tr = Masse des Tracers in der Kalibrierlösung (K) a K Tr = Fläche des Tracers in der Kalibrierlösung (K) a i K = Fläche der Komponente i in der Kalibrierlösung (K) (3) mi x = KF a i a x i x Tr m Tr mi x = Masse der Komponente i in der Probenlösung (X) mtr x = Masse des Tracers in der Probenlösung (X) a x i = Fläche der Komponente i a x Tr = Fläche des Tracers Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und gleicher Konzentration (Masse m Tr ) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus der Eichung ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten nach Formel (3) ermitteln.

18 Seite 18 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil 1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die Adsorptionschromatographie unterschieden werden? 2.) Erklären sie den Begriff endcapping. 3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.b. stark basische Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele aufzeichnen )? 4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu NP-Phasen aufweisen. 5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt, und welchem Ordnungsprinzip folgt sie? 6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen E o (Al 2 O 3 ) und E o (SiO 2 )? 7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Einsatz der mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution? 8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe binärer, ternärer und quaternärer Gradient. 9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten. 10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung. 11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KF i einer Komponente i definiert? 12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer aufweisen muss. 13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip eines herkömmlichen UV/VIS-Detektors und eines DAD-Detektors. Erläutern sie in diesem Zusammenhang den Ausdruck: Inverse Optik. 14.) Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.

19 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 19 II Experimenteller Teil HPLC-Bestimmung von Coffein in Getränken (Kaffee und Energy-Drinks) mit der Methode des Internen Standards II.1 Einleitung Coffein gehört als pharmazeutischer Wirkstoff in die große Gruppe der Psychopharmaka und in die Untergruppe der Psychoanaleptika. Analeptika sind Substanzen, die das Zentralnervensystem stimulieren und in hohen Dosen Krämpfe auslösen. Psychoanaleptika sind unspezifisch wirksame Substanzen, die vorwiegend die "Psyche" anregen, aber auch noch andere, z.b. bei Coffein diuretische, Wirkungen zeigen. Eine tägliche Coffeinzufuhr hinterläßt in der Regel keine bleibenden organische Schädigungen. Chemisch gesehen ist Coffein (1,3,7- Trimethylxanthin), genau wie Theophyllin und Theobromin als Xanthinderivat eine Purinbase. Alle drei genannten Xanthinderivate kommen in Teeblättern vor, Theobromin auch in der Kakaobohne und in der Colanuß. In der Kaffeebohne und auch in Teeblättern ist Coffein gegenüber den beiden anderen Xanthinderivaten der Hauptbestandteil. H 3 C O O CH 3 N N N N CH 3 Coffein Auch in vielen käuflichen Limonaden ist Coffein in bisher erlaubten Konzentrationen von mg/l enthalten. Die sog. Energy-Drinks dürfen nach speziellen Genehmigungen der Lebensmittelbehörden Coffein in höherer Konzentration (ca. 350 mg/l) und außerdem noch weitere Inhaltsstoffe, wie Taurin (2- Amino-ethansulfonsäure), Glucuronolacton, Inosit und sehr viel Zucker enthalten. Diese Inhaltsstoffe sollen angeblich zur höheren "Leistungsfähigkeit" verhelfen (Werbung: "pure Energie für Kopf und Körper"). Während die Wirksamkeit von Coffein als Anregungsmittel nicht umstritten ist (250 ml Energy Drink hat die Wirkung einer starken Tasse Bohnenkaffee), ist die Wirksamkeit der übrigen Bestandteile eher spekulativ.

20 Seite 20 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 II.2 Durchführung II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen II Vorbereitung der Stammlösungen Coffein-Stammlösung (Lösung A): 10 mg Coffein (27600 Fluka 99% HPLC) werden in ein Zinnwägeschiffchen (Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, , Fa. Elementar Analysensysteme GmbH, D Hanau, Germany), genau eingewogen. Anschließend wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben überführt und mit H 2 O (Millipore-Qualität) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird beschriftet (Lösung A / Konzentration-Coffein [mg/ml]! ). Tracer-Stammlösung (Lösung B): 25 mg Benzophenon (84676 Fluka) werden in ein Zinnwägeschiffchen (Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, , Fa. Elementar Analysensysteme GmbH, D Hanau, Germany) genau eingewogen. Anschließend wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben überführt und mit Acetonitril (HPLC Ultra-Gradient-Grade 9017, Fa. Mallinkrodt Baker, D Griesheim, Germany) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird beschriftet (Lösung B / Konzentration-Benzophenon [mg/ml]! ). II Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung Herstellung der Eichlösung C: Mit einer Pipette (Transferpette,Fa. Brandt, D Wertheim, Germany) werden je 700µl Lösung A und 700µl Lösung B in einem Präparategläschen zusammenpipettiert (Vorsicht! dabei unbedingt Luftblasen in der Pipettenspitze vermeiden!). Das Präparategläschen wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s geschüttelt und beschriftet. Filtration: Die so hergestellte Eichlösung C wird in eine 2ml Einweg-Spritze (NormJect, Luer, Fa. Henke Sass Wolf, D Tuttlingen, Germany) mittels einer aufgesteckten Einmalkanüle (Typ Erosa, Pravaz, 0.90 x 40mm 20G x

21 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 21 11/2, Fa. Rose GmbH, D-5500 Trier, Germany) aufgezogen. Danach wird die Kanüle von der Spritze wieder entfernt (Achtung! Spritze dabei senkrecht nach oben halten, damit die aufgezogene Lösung nicht ausläuft!) und ein Chromafil Einmalfilter (PTFE Typ O-20/15, organisch, Porendurchm. 0.2µm, Fa. Macherey-Nagel, D Düren, Germany) aufgesetzt. Die Lösung wird vorsichtig! durch den aufgesetzten Filter in ein Autosampler-Injektionsgläschen gepresst. Das Gläschen wird mit einer Anbördelkappe fest verschlossen und beschriftet (Lösung C / Konzentrationen in [mg/ml]! ). Achtung: Jeweils Vialkonzentrationen angeben! II Vorbereitung der Probenlösungen Herstellung der Kaffee-Probenlösung (P1): Der aufgebrühten und auf Raumtemperatur abgekühlten Kaffee-Lösung werden mit der Transferpette 700µl entnommen und in ein Präparategläschen überführt. Es werden 700µl Lösung B (Tracer-Stammlösung) zupipettiert. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung C. Herstellung der Red-Bull-Probenlösung (P2): 700µl (Transfepette) Red-Bull-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung C. Herstellung der Coca-Cola-Probenlösung (P3): 700µl (Transferpette) Coca-Cola-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung (C).

22 Seite 22 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen Säule: Phenomenex Luna C18 / 3µm / 150 x 4.6 mm Vorbereitung: Nachdem die HPLC-Anlage mit den benötigten Eluenten (Kanal A: 100% H 2 O [Millipore-Qualität] / Kanal B: 100% Acetonitril [HPLC Ultra-Gradient-Grade 9017, Fa. Mallinkrodt Baker, D Griesheim, Germany] bestückt wurde, wird zunächst die Säule für 10 min mit 98% B gespült. Anschließend konditioniert man die Säule für weitere 10 min auf die gewünschten Anfangsbedingungen (hier 10% B). Danach wird die Software programmiert. Bevor die Sequence mit der Eichlösung (C) und den einzelnen Probenlösungen (P1, P2, P3) vermessen werden, wird ein Chromatogramm der Tracer-Lösung (B) aufgenommen, um beurteilen zu können, ob Benzophenon als Interner Standard überhaupt verwendet werden kann. II Die Pumpen-Programmierung A B C A : Geben sie eine Flussrate von 1.00 ml/min ein. B : Stellen sie Solvent B auf 10% ein (Anfangsbedingungen). C : Programmieren sie die Timetable in dem sie das gewünschte Gradientenprogramm angeben 10% B 95% B in 20 min.

23 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 23 II Die Programmierung des Injektionsvolumens D D : Geben sie als Injektionsvolumen 5.0 µl ein. II Die Detektor-Prammierung E F E : F : Geben sie als Signalspur A = 220 nm ein. Geben sie als Signalspur B = 254 nm ein.

24 Seite 24 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 II Die Programmierung des Säulenthermostaten G G : Geben sie als Temperatur für den Säulenthermostaten 25.0 C ein. II Die Einstellung der Integrationsparameter H I H : I : Geben sie für die Slope Sensitivity den Wert 50 ein. Geben sie für die Peak Width den Wert 0.05 ein.

25 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 25 II Die Programmierung des Autosamplers J J : Geben in der Sequence Table (programmiert den Autosampler) die Bezeichnungen der Proben in der Reihenfolge ein, in der sie abgearbeitet werden sollen (Eichlösung / P1 / P2 / P3 ). Unter Inj/Location ist standardmäßig 1 eingetragen, was bedeutet, dass jede Probe nur jeweils einmal injiziert werden soll. Tragen sie unter der Rubrik Sample Info die jeweiligen Vialkonzentrationen der Komponenten in ihrer Lösung ein. II Das Starten der Proben-Sequence K K : Starten sie mit dem Kommando Run Sequence die Analysensequence, nachdem sie die Proben in den Probenteller des Autosamplers gestellt haben.

26 Seite 26 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 II.2.3 Die quantitative Auswertung II Der Menüpunkt: Data Analysis L L : Die Auswerung der gewonnenen Analysenergebnisse erfolgt unter dem Menüpunkt Data Analysis. Hier können u.a. die Integrationsparameter für die aufgenommenen Chromatogramme optimiert, als auch spektroskopische Analysen (UV-Spektren, Isoplot, 3-D-Plot etc.) durchgeführt werden. II Das Erstellen der Kalibriertabelle M : N : M N Laden sie das Datenfile des Eich-Chromatogramms und öffnen sie die Calibration Table. Geben sie unter der Rubrik Compound für den jeweiligen Peak den entsprechenden Namen ein. Geben sie in der der Spalte Amt (=Amount!) die Vialkonzentration der Komponente ein. Indizieren sie den Tracer in der Spalte ISTD mit YES. Nach abspeichern als Kalibrier-Methode drucken sie mit Print die Tabelle aus und schließen mit OK ab.

27 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 27 II Das Erstellen des quantitativen Reportes (ISTD-Report) O O : Nachdem sie die Kalibriertabelle erstellt und abgespeichert haben (Punkt II.2.3.2), können nun nacheinander die Chromatogramme der Lösungen P1 bis P3 geladen werden und für jedes Chromatogramm der quantitative Report erstellt werden. Dazu wählen sie den Menüpunkt Specify Report aus. Im Fenster Destination wählen sie Printer, im Fenster Style wählen sie Short aus. Unter der Rubrik Quantitative Results muss ISTD aktiviert sein. Die restlichen Einstellungen können beibehalten werden. Mit dem Kommando Print Report kann danach jeweils der spezifische quantitative Ergebnis-Report erstellt werden. Drucken sie diesen Report für jedes Chromatogramm aus.

28 Seite 28 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil 1.) Was versteht man unter der chromatographischen Durchbruchszeit t m. 2.) Welche apparativen Einflüsse (zusätzlich zur Säule) können in der HPLC zu einer deutlichen Beeinflussung der Durchbruchszeit führen (nennen sie 2 Beispiele)? 3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit t R (X) von Benzophenon 4.) Berechnen sie die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase u m in [cm/min] bei einer gegebenen Durchbruchszeit von t m = 1.33 min (Länge der Säule = 150 mm). 5) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen V m der mobilen Phase sowie das Retentionsvolumen V R von Benzophenon. 6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon. 7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein. 8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originalgetränken (Kaffee- Lösung / Red Bull / Coca-Cola). 9.) Der Energy-Drink Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethansulfonsäure. Geben Sie die entsprechende chemische Formel an. 10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum Coffein-Peak in etwa erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit). Begründen sie ihre Aussage. 11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV/VIS-Detektor einschätzen (Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsmethode für Taurin.

29 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 Seite 29 III Auswertung Theoretischer Teil

30 Seite 30 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2014/15 Rev 1 IV Auswertung Experimenteller Teil