Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation im Labormaßstab

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1 Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation im Labormaßstab Dr. Induka Abeysena & Rob Darrington Einleitung Seit vielen Jahren wird die Lyophilisation oder Gefriertrocknung zur Trocknung von Proben im Labor eingesetzt. Die Technik ist gut untersucht und für viele Forscher, die nur wenige Proben trocknen, ist die Lyophilisation die Methode der Wahl. Die Lyophilisation wird oft wegen dem hohen erreichten Trockenheitsgrad bzw. niedrigen verbleibenden Lösungsmittelmengen und wegen dem leichten, pulvrigen und lockerem Zustand der Proben bevorzugt, der die Entnahme und das Auswiegen der Proben erleichtert. Konventionelle Gefriertrockner sind jedoch mit einer Reihe von möglichen Nachteilen verbunden. Dazu gehören: 1. Für die Vorbereitung der Proben steht nur eine begrenzte Anzahl von Lösungsmitteln zur Verfügung und oft kann nur Wasser verwendet werden. 2. Flüchtige organische Lösungsmittel und deren Gemische können nicht zum Einsatz kommen. 3. Das Verfahren ist zeitaufwändig. Aus diesem Grund wird für die Bearbeitung einer hohen Anzahl von Proben, z. B. von präparativen Reverse-Phase-HPLC-Trennungen auf der Basis von Wasser und Acetonitril, oft Rotationsverdampfer eingesetzt. In anderen Laboren, z. B. im Bereich Compound Handling, verbieten die aggressiven Eigenschaften von organischen Lösungsmitteln die Verwendung von Gefriertrocknern. Unter diesen Bedingungen sind sogar hochentwickelte Rotationsverdampfer wie das Modell Genevac HT-4X (s. Abb. 1) von begrenztem Nutzen. Zu den berichteten Problemen gehören: Proben trocknen als Film and die anschließende Resuspendierung kann unter Umständen schwierig sein; bei manchen Proben bleibt etwas Lösungsmittel zurück und einige Proben trocknen nicht zusammen mit den anderen. Abbildung 1 Rotationsverdampfer Genevac HT-4X Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 1 von 8

2 In dieser Studie sollen die Ergebnisse der Forschung in Genevac-Labors vorgestellt werden, die zur Entwicklung einer Kombinationslösung führen sollte. Dabei sollte ein schnelles Paralleltrocknen der Proben und ein hoher Trocknungsgrad, die oft gewünschte lockere Probenkonsistenz nach Trocknung und eine zuverlässige Trocknung aller Proben erreicht werden. Probleme mit der Reinigung Die von Reinigungslabors bearbeiteten Proben sind typischerweise in einem Wasser- /Acetonitrilgemisch mit einem niedrigen Zusatz eines Modifiers, normalerweise 0,1 % TFA, gelöst. Die Entfernung dieses Lösungsmittelgemisch mit einem Gefriertrockner ist mit vielen Schwierigkeiten verbunden. Erstens kann Acetonitril nur bei einem sehr niedrigen gefroren werden oder es muss ein Gefriertrockner verwendet werden, der die Trocknung bei Tiefsttemperaturen durchführen kann: Acetonitril gefriert bei -65 C. Wird das Acetonitril nicht eingefroren, können ein Aufkochen von Lösungsmittel und damit Probenverluste und Kreuzkontaminationen nicht vermieden werden. Zweitens verhindert in Eis eingeschlossenes Acetonitril den Aufbau eines gutes s und damit ist die Lyophilisation von Wasser fast unmöglich. Drittens ist das Verfahren sehr zeitaufwändig und ist daher nicht mit dem industrieweiten Bestreben zur Verminderung von Verfahrenszeiten vereinbar. Aus diesen Gründen wird gewöhnlich die Rotationsverdampfung eingesetzt, da auf diese Weise viele Proben parallel getrocknet werden können. Auch das Aufkochen von Lösungsmitteln beim Trocknen von Gemischen kann konstruktionsmäßig vermieden werden. Trotzdem ist diese Methode auch mit zwei potentiellen Problemen verbunden, die beide mit Probeneffekten zu tun haben. Benutzer berichten von Problemen beim Trocknen von nur wenigen Proben pro Lauf. Es ist möglich, dass nicht alles TFA entfernt wird und verbleibendes TFA die Proben bei der Lagerung beschädigt. Außerdem könnte das TFA den Siedepunkt des Wassers erhöhen und die Trocknung erschweren. Darüber hinaus zeigen NMR (Nuclear Magnetic Resonance)-Analysen Restlösungsmittel an. Obwohl diese Probleme nur gelegentlich auftreten, ist das manuelle Heraussuchen von einigen Proben für viele automatisierte Labors trotzdem unmöglich. Aus diesem Grund muss das gesamte Probenrack erneut bearbeitet werden. Lyophilisation in einem Rotationsverdamper Wässrige Proben können nur in Rotationsverdampfern lyophilisiert werden, in denen das bestmögliche verwendet wird. Das Modell Genevac HT-4X (Abb. 1), ausgestattet mit einer lösungsmittelresistenten Scroll-Pumpe, kann ein unter 0,5 mbar erreichen, das für das Gefrieren von Wasser mehr als ausreichend ist. Dieses Verfahren entspricht der normalen Gefriertrocknung und ist daher langsam. Vor einigen Jahren entwickelte Genevac ein Verfahren, mit dem die Benutzer zunächst den größten Teil des Lösungsmittel schnell auf nur wenige mm mit dem Rotationsverdampfer entfernen dann auf einen Gefriertrocknungsbetriebsmodus umschalten konnten. Auf diese Weise wurden beide Methoden miteinander kombiniert. Bei einem Genevac-Kunden konnte die Verfahrensdauer für ml- Fraktionen so von 48 Stunden in einem Gefriertrockner auf 16 Stunden (über Nacht) in einem Genevac HT-12 verkürzt werden. Die Trocknung einer 30-ml-Probe dauerte Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 2 von 8

3 bei diesem sequentiellem Verfahren nur noch jeweils Minuten. Auf dieser Grundlage wurde getestet, ob der Vorgang durch Aufwärmung der Proben während der Lyophilisation noch weiter beschleunigt werden kann. Die Studie bestand aus zwei Teilen. Zunächst wurden die optimalen Bedingungen für das Lösungsmittel Wasser ermittelt. Dann wurde eine Wasser-Acetonitril-Gemisch verwendet, das für HPLC-Proben typisch ist. Lyophilisation von Wasser In allen en diente Ibuprofen-Natriumsalz als Standardprobe. Es wurde eine Stammlösung von 0,01 M in Wasser hergestellt. 15 ml dieser Lösung wurde in ml-szintillationsfläschchen (Wheaton) gefüllt und bei unterschiedlichen Bedingungen in einem Rotationsverdampfer des Modells Genevac HT-4X lyophilisiert. In Abb. 2 ist ein typischer Fläschchenhalter abgebildet. Abbildung 2 Genevac-Halter für 20-ml-Szintillationsfläschchen. In Abb. 3 wurde die Temperatur- und Druckwerte bei der Wassergefriertrocknung gegen die Zeit dargestellt. Diese Werten dienten der Aufstellung einer Baseline. Die verwendeten Systemeinstellungen wurden in Abb. 4 zusammengefasst. Die Trocknung der Proben dauerte ungefähr 8 Stunden. Dabei betrug die Länge der Konzentrationsphasen 1 und 2 (Probentemperatur: ca. +8 C) und die Länge der Lyophilisationsphase 3 (eigentlich Phase 3 und 4, s. unten) (Probentemperatur: ca. -16 C) mit anschließender Aufwärmung der Proben jeweils ca. 4 Stunden. Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 3 von 8

4 Abbildung 3 Konzentration und Lyophilisation von wässrigen Proben mit der Baseline-Methode Haltertemp ( C) Probentemp ( C) Druck (mbar) Phase 1 Phase 2 Phase 3 Konzentration Abkühlen Lyophilisation Obwohl in Abb. 3 drei Phasen dargestellt werden, besteht die tatsächliche Evaporationsmethode aus bis zu vier Phasen: 1. Konzentration des größten Lösungsmittelanteils mit schneller Verdampfung 2. Kühlen der Proben und Probenhalter in Vorbereitung des nächsten Schrittes 3. Gefrieren der Proben mit einem niedrigen 4. Lyophilisation des verbleibenden Lösungsmittels mit oder ohne erhöhte Temperaturen Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 4 von 8

5 Abbildung 4 Die Ergebnisse der Lyophilisationsversuche mit Wasser Wasser Phase 1 Konzentration Phase 2 Abkühlung Phase 3 Phase 4 Lyophilisation bei bei bei bei 3 h bei bei Abkühlphas e (Gefrieren) 18 h bei Wärme für Wärme für Wärme für Wärme für separate Gefrierphase C für 5 h h 20 C für 5 h h h h h Ergebnisse Lyophilisationserg ebnis: OK 8 h min / Probe Lyophilisationsergebnis: OK 6 h 7,5 min / Probe Lyophilisationsergebnis: OK 6,5 h 8,1 min / Probe Lyophilisationsergebnis: OK 5,5 h 6,8 min / Probe wiederholt & Ergebnis zuverlässig Lyophilisationsergebnis: OK 5,5 h 6,8 min / Probe Proben zu trocken 5 h In Abb. 4 werden die Ergebnisse der Methodenentwicklung für die Verarbeitung von wässrigen Proben dargestellt. Bei den aufeinanderfolgenden Läufen wurden steigende Temperaturen verwendet. So konnte gezeigt werden, dass die Gesamtverfahrensdauer von 8 Stunden in 1 auf 5,5 Stunden in 4 vermindert werden konnten. In Abb. 5 werden die Ergebnisse des s 4 dargestellt. Da die genaue Verarbeitungsdauer für die jeweiligen sbedingungen nicht bekannt waren, wurden die Proben zu lange bearbeitet und dann auf der Grundlage der Daten den vorher erreichten Endpunkt bestimmt. Um die die Bestimmung des Endpunktes einheitlich durchzuführen, wurde der Endpunkt als der Zeitpunkt definiert, bei dem die Probentemperatur positiv wurde. Zu diesem Zeitpunkt wärmen sich die Proben schnell auf, da der Kühlungseffekt durch die Lyophilisation nicht weiter vorhanden ist. Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 5 von 8

6 Abbildung 5 - Ergebnisse der Konzentration und Lyophilisation mit Aufwärmung der Proben, Druck (mbar) Haltertemp ( C) Probentemp ( C) Lyophilsiation beendet 0 Phase 1 Phase 2 Phase 3 Phase 4-1 Konzentration Abkülen Gefrieren Lyophilsiation & Wärme Hinweise zu diesen Daten zu den besten Laborpraktiken gehörte unserer Meinung nach eine Abkühlphase, Phase 2. Diese hatte in der Vergangenheit immer gut funktioniert, ist aber nie getestet worden. Tatsächlich werden die Proben auch durch die Gefrierphase abgekühlt, und wie 5 zeigt, ist eine separate Abkühlphase nicht notwendig. Die Gefrierphase ohne Aufwärmung ist wie in 6 gezeigt jedoch unabdingbar. In diesem Fall trockneten die Proben auf normale Weise und wurden nicht lyophilisiert. Die Daten wiesen darauf hin, dass die Proben zu keinem Zeit gefroren waren. Die Ergebnisse des s 3 scheinen aus der Reihe zu fallen, da die höheren Temperaturen zu einer Verminderung der Verarbeitungszeit hätten führen sollen. Lyophilisation von Wasser und Acetonitril Natürlich sind die in dieser Studie erreichten Zeiteinsparungen willkommen, doch ist die Gefriertrocknung von Wasser für die allermeisten Benutzer von untergeordneter Bedeutung. Die wichtigere Frage ist die nach der Handhabung von Lösungsmittelgemischen. Die Methode, die für Wasser benutzt wird, wurde daher modifiziert und eine frühere Phase, Phase 0, zur Entfernung des Acetonitrils eingeführt. Die Phase 0 besteht aus drei Unterphasen: 1. Dri-Pure TM rampen und hohe Rotorgeschwindigkeiten zur Vermeidung von Aufkochen 2. Konzentration eine 40-mbar-Phase zur Entfernung des Acetonitrils ohne ein Gefrieren des Wassers. Bei 40 mbar siedet Acetonitril bei +2 C. 3. Entleerung der verbleibendes Acetonitril stört den Aufbau eines s in späteren Phasen und muss daher entfernt werden. Für diese e wurde eine 0,01 M-Stammlösung aus Ibuprofen-Natriumsalz und einer Wasser/Acetonitril-Mischung (60:40) hergestellt. Die Ergebnisse werden in Abbildung 6 zusammengefasst. Wie die Daten zeigen, werden die Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 6 von 8

7 Optimalbedingungen erst bei erreicht. Genau wie bei der Wasserentfernung war keine Abkühlphase notwendig. Das Verfahren musste mit Blick auf ein ausgewogenes Verhältnis von Konzentration und Lyophilisation etwas angepasst werden ml-Proben trockneten in 5 Stunden im Vergleich zu 6,25 Stunden bei sequentieller Trocknung. In Abbildung 7 wird der Unterschied zwischen einer lyophilisierten Probe ( ) und einer traditionell rotationsverdampften Probe (e 7, 8, 9 und 11) dargestellt. Der Unterschied ist sehr groß. Die lyophilisierte Probe kann auch viel leichter resuspendiert werden, während die getrockneten Proben sich nicht ganz auflösen. Die Resuspension der Proben kann unter angesehen werden. Abbildung 6 Die Ergebnisse der Lyophilisationsversuche mit einem Wasser-/Acetonitrilgemisch MeCN: H 2 O 40:60 Phase 0 MeCN- Entfernung Phase 1 Konzentration Phase 2 Abkühlung Phase 3 (Gefrieren) Phase 4 Lyophilisation mbar, 50 min entleeren 40 mbar, 50 min entleeren 40 mbar, 1 h entleeren 40 mbar, 1,5 h entleeren 40 mbar, 1,5 h nicht geleert 1,5 h bei 45 min bei 45 min bei 30 min bei 30 min bei 30 min bei Abkühlpha se Abkühlpha se h h h h h Ergebnisse Proben wurden zu stark getrocknet. Proben wurden zu stark getrocknet. Proben wurden zu stark getrocknet. Lyophilisationse rgebnis: OK Trocknungszeit 5h oder 6,25 min/probe Proben wurden zu stark getrocknet. Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 7 von 8

8 Abbildung 7 Getrocknete Proben in Szintillationsfläschchen A zu trocken = traditionelles Ergebnis der Verdampfung B Ergebnis der Lyophilisation Schlussfolgerungen & Diskussion Eine Lyophilisation der Proben erleichtert das anschließende Aufnehmen der getrockneten Probe. Durch Durchführung der Lyophilisation bei höheren Temperaturen konnte die Lyophilisationsdauer erheblich verkürzt werden. Bei der Etablierung einer Lyophilisationsmethode ist eine traditionelle Abkühlmethode nicht notwendig. Auf der anderen Seite ist die Gefrierphase unerlässlich. Bei der Evaporation eines Wasser-/Acetonitrilgemisches ist es notwendig, nach Evaporation des Acetonitrils und vor Evaporation und Lyophilisation des Wassers die zu leeren. Verbleibendes Acetonitril beeinträchtig den Aufbau des s und die ordnungsgemäßen Lyophilisationsbedingungen können nicht erreicht werden. Die des Systems HT-4X musste bei Ende der Phase 0 von Hand geleert werden. Bei einigen Systemen von Genevac kann dies automatisiert werden, so dass während des Verfahrens kein Eingreifen des Benutzers notwendig ist. Auf der Grundlage dieser Studie werden zur Zeit automatische nentleerfunktionen für die Genevac-Modelle HT-4X und HT-12 entwickelt. Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Lyophilisation Genevac Ltd Seite 8 von 8

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