Fortgeschrittenen - Praktikum Laser-Scanning-Mikroskop Versuchsleiter: Herr Dr. Reyher Autor: Simon Berning Gruppe: 10, Dienstag Daniel Bruns, Simon Berning Versuchsdatum: 27.02.2007
Laser-Scanning-Mikroskop; Gruppe 10 1 Inhaltsverzeichnis 1 Ziele 2 2 Das Laser-Scanning-Mikroskop und seine Fähigkeiten 2 2.1 Das Lichtmikroskop................................... 2 2.2 Aufbau und Funktionsweise des LSM.......................... 2 2.3 Das konfokale Prinzip.................................. 3 3 Experimentelles 3 3.1 Vermessung einer Münze................................. 3 3.1.1 3D-Darstellung.................................. 5
Laser-Scanning-Mikroskop; Gruppe 10 2 Abbildung 1: Prinzipieller Aufbau eines LSM 1 Ziele In diesem Versuch geht es darum die Vorteile des konfokalen Prinzips gegenüber der herkömmlichen Mikroskopie kennenzulernen. Dafür steht ein Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) der Firma Leica zur Verfügung mit dem wir unter Anderem einen Mikrochip oder auch Chloroplasten einer Alge genauer untersuchen werden. 2 Das Laser-Scanning-Mikroskop und seine Fähigkeiten 2.1 Das Lichtmikroskop Zusätzlich zum LSM befindet sich in dem Gerät noch ein herkömmliches Lichtmikroskop, welches dabei helfen kann, die zu betrachtende Probe richtig zu positionieren und erste Erkenntnisse über ihre Struktur zu gewinnen. Das LSM und das Lichtmikroskop teilen sich den Objektiv-Revolver, der über ein 30-fach und ein 40-fach vergrößerndes Objektiv verfügt. Dabei sind die zwei Standard- Modi, Auflicht- und Durchlicht-Mikroskopie, möglich. Die Probe kann auf einem Kreuztisch in alle Raumrichtungen bewegt werden, in z-richtung ist dies sogar im Bereich von µm möglich, was für die späteren z-scans wichtig ist. 2.2 Aufbau und Funktionsweise des LSM Der grundsätzliche Aufbau eines LSM ist in Abbildung 1 dargestellt. Zwar besteht ein Laser- Scanning-Mikroskop aus viel mehr Komponenten, aber zum Verständnis des Arbeitsprinzips reicht die gezeigte Skizze völlig aus. Beim LSM wird nicht das ganze Objekt auf einmal beleuchtet und abgebildet, sondern die Abbildung geschieht durch das sukzessive Abtasten und Abbilden einzelner Punkte des Objektes. Dabei wird ein Laserstrahl mit Hilfe der Objektivlinse auf einen Punkt auf oder in dem Objekt fokussiert. Der Scan-Spiegel führt diesen Strahl zweilenweise über das Objekt und im Detektor wird dann die
Laser-Scanning-Mikroskop; Gruppe 10 3 Abbildung 2: Stern auf einer Zwei-Cent Münze Intensität des reflektierten oder emittierten Lichts von jedem abgetasteten Punkt gemessen. Dabei sorgt ein Photoelektronen-Multiplier dafür, dass das Signal hinreichend verstärkt wird. Der Clou liegt beim LSM allerdings im konfokalen Prinzip, welches wir nun erläutern wollen. 2.3 Das konfokale Prinzip Es ist bekannt, dass ein Punkt bei einer Abbildung durch ein optisches Gerät immer zu einem gewissen Grad verschmiert. Das führt dazu, dass auch Teile des Objektes beleuchtet werden, die nicht ganz genau im Fokus des Objektives liegen und zu einem unscharfen Bild führen. Um diesen Effekt zu minimieren wird das reflektierte oder emittierte Licht mit einer zweiten Linse gebündelt, bevor es auf den Detektor fällt. In der Brennebene dieser Linse befindet sich die Airy-Blende, die nur Licht durchlässt, was sich zuvor im Fokus des Objektives befunden hat. Dieses Licht befindet sich, im Gegensatz zu dem Licht welches nicht im Fokus des Objektives lag, auch im Fokus der Airy-Blende (vergleiche Abbildung 1). Man spricht daher von einem konjugierten oder konfokalen Fokus. Das hat zur Folge, dass während eines Abtastvorganges mit sehr kleiner Blendenöffnung nur Intensitäten von Punkten des Objektes gemessen werden, die sich in der Fokusebene des Objetives befinden. Diese Eigenschaft kann man auch gut nutzen um eine 3D-Darstellung eines Objektes zu erstellen indem man viele übereinander liegende Schichten des Objektes aufnimmt und diese dann zu einem Bild zusammen fügt. 3 Experimentelles 3.1 Vermessung einer Münze Im ersten Versuchsteil sollte die Prägung einer Münze vermessen werden um den Umgang mit dem LSM zu erlernen. Dazu wurde diese zunächst auf einen Objektträger gelegt, mit dem Lichtmikroskop vorfokussiert und eine geeignete Stelle für die Vermessung gesucht. Wir haben uns zwei Münzen ausgesucht. Auf einer Zwei-Cent Münze haben wir einen Stern am Rand der Münze und bei einer Zwanzig-Cent Münze die Abbildung von Irland vermessen. Einen Eindruck über die vorher genannten unscharfen Bereiche bei einem Lichtmikroskopbild gibt Abbildung 2, bei der wir die Obefläche des Sterns scharf gestellt haben. Die unscharfen Bereiche auf der Oberfläche der Münze liegen nicht im Fokus des Objektives, werden aber dennoch abgebildet.
Laser-Scanning-Mikroskop; Gruppe 10 4 Abbildung 3: Stern: Links Sternoberfläche im Fokus, rechts Münzoberfläche Abbildung 4: Abstand Oberfläche Stern und Münze Nun haben wir das Mikroskop auf Laserbetrieb umgestellt und den Stern vermessen. Es ist zu bemerken, dass lediglich Intensitäten gemessen werden und die Farben aller nachfolgenden Bilder nur aus einer Colormap entspringen bei der jeder Farbwert einer Intensität zugeordnet ist. Die Objekte haben also keineswegs die gezeigte Farbgebung. Als erstes haben wir die Höhe des Sterns, oder mit anderen Worten, die Prägungstiefe der Münze vermessen. Dafür wurde der Fokus erst etwas über die Oberfläche des Sternes gelegt und danach unter die Oberfläche der Münze. Die Aufnahmen der beiden Oberflächen im Fokus sind in Abbildung 3 dargestellt. Das LSM konnte dann viele einzelne Schichtaufnahmen zwischen den beiden Fokuspunkten erstellen aus denen man die Höhe des Stern bestimmen kann. Dazu haben wir uns in einem Graphen für zwei Bereiche auf der Bildserie anzeigen lassen, bei welcher Aufnahme die Intensität des gewählten Bereiches maximal wurde. Zu diesem Zeitpunkt muss der Bereich in der Fokusebene gelegen haben. Mann kann die Höhendifferenz dann einfach ablesen. Die Bereiche und die Graphen sind in Abbildung 4 zu finden.
Laser-Scanning-Mikroskop; Gruppe 10 5 Abbildung 5: Vermessung der Spannweite des Sternes Der Abstand der Maxima beträgt 37.66 ± 2.4µm. Der Fehler kommt durch den Abstand zweier Schichtaufnahmen zustande. Da die Prägehöhe aber von Prägerei zu Prägerei variiert kann hier kein Literaturwert angegeben werden. Als nächstes haben wir die Spannweite des Sternes an zwei Stellen vermessen. Dazu sind wir wie folgt vorgegangen: Zuerst haben wir mit Hilfe der Bearbeitungssoftware zwei Linien in einem Bild gezogen. Die eine schnitt zwei Spitzen des Sternes und die Andere zwei Einbuchtungen. Danach kann man sich wieder einen Graphen anzeigen lassen, der die Intensität an jedem Punkt der Linie widergibt. Die Kanten des Graphen an denen die Intensität sprunghaft zu oder abnimmt kennzeichnen die Kanten des Sternes. Die Ergebnisse finden Sie in Abbildung 5. Entlang der blauen Linie hat der Stern eine Ausdehnung von 430 ± 10µm, entlang der grünen eine von 730±10µm. Hier ist der Fehler durch die maximale Ablesegenauigkeit am Graphen entstanden. Als letztes haben wir in diesem Teilverusch die Prägung von Irland auf einer Zwanzig-Cent Münze vermessen. Nach Literatur (Atlas) liegt zwischen dem nördlichsten und dem südlichsten Punkt Irlands eine Strecke von 428 km. Zwischen dem östlichsten und dem westlichsten eine von 257 km. Die Nord-Süd-Strecke ist also etwa 1.66 mal so lang wie die von Ost nach West. Dieses Streckenverhältnis haben wir für die Münze geprüft. Die nötigen Aufnahmen der Vermessung finden Sie in Abbildung 6. Dabei ist der linke Graph der der Nord-Süd-Linie Die Auswertung der Daten steht in Tabelle 7: Erstaunlicher Weise liegt das Streckenverhältnis recht nah am Verhältnis der realen Strecken. 3.1.1 3D-Darstellung Aus den z-scans kann nun noch, wie im Vorfeld erwähnt, eine 3D-Darstellung des Objektes gewonnen werden. Dazu dient ein Matlab-Programm, dass Punkte ähnlicher Intensitäten, die nah bei einander liegen zu einer Isofläche zusammenfasst. Dies geschieht auch über mehrere z-ebenen. Das Resultat für den Stern sehen sie in Abbildung 8. Man erkennt gut, dass der Stern höher liegt als die Grundfläche der Münze, jedoch befindet sich zwischen den beiden Ebenen eine Lücke. Diese ist aber keinesfalls ein Indiz für eine Fehlstelle in der
Laser-Scanning-Mikroskop; Gruppe 10 6 Abbildung 6: Vermessung von Irland auf der Münze Nord-Süd-Linie Ost-West-Linie Verhältnis Realität 428 km 257 km 1.66 Münze 0.9 ±0.01 mm 0.51 ±0.01 mm 1.76 ±0.05 Abbildung 7: Streckenverhältnisse Irland real und auf der Münze
Laser-Scanning-Mikroskop; Gruppe 10 7 Abbildung 8: 3D-Darstellung des Sterns Abbildung 9: Topo-Image des Sterns Münze, sondern resultiert lediglich daraus, dass an den Kanten des Sterns das Licht so reflektiert wurde, dass keine Intensität mehr gemessen werden konnte. Ergo konnte das Matlab-Programm auch keine Isoflächen bilden. Zur Veranschaulichung haben wir mit den Bearbeitungstools ein Topo-Image aus dem z-scan des Sterns erstellt, welches die Höhe einzelner Teile des Bildes widergibt. Der Nullpunkt liegt dabei auf Höhe der unteren Scangrenze. Die gelben Bereiche stehen für hohe, die roten für niedrige Stellen. Ist eine Stelle schwarz, so wurde hier zu wenig Intensität während des z-scans gemessen und man kann keine Höhe zuordnen. Sie finden das Image in Abbildung 9.