Replikation. Allgemeine Grundlagen. Replikation Transkription Translation Signaltransduktion. 1. Allgemeines. 2. Meselson-Stahl-Experiment

Transkript

1 Allgemeine Grundlagen Replikation Transkription Translation Signaltransduktion Replikation 1. Allgemeines DA dient als Matrize, d.h. als Vorlage für die Vervielfältigung und Weitergabe der genetischen Information Stränge sind zueinander komplementär z.b. 5 -AGCGTTAGCGATCAT-3 3 -TCGCAATCGCTAGTA-5 Replicon: DA-Abschnitt, der von Replikationsursprung aus repliziert wird Eukaryoten besitzen mehrere Replicons Origin: Ursprung /Startpunkt der Replikation Trennung der Doppelhelix (Mutterstrang) in ihre 2 Einzelstränge Y-Figur mit doppelsträngigem Stamm Synthese der Tochterstränge ausgehend von einzelsträngigen Bereichen mit Hilfe spezifischer Enzyme Abb.: semikonservative Replikation der DA 2. Meselson-Stahl-Experiment (Beweis der semikonservativen Replikation der DA) Meselson und Stahl, 1957 Kultivierung von E.coli Stickstoffquelle 15 ( schweres Isotop) Trennung der 15 -DA von der -DA mittels CsCl- Dichtegradient Kultivierung auf -ährboden; 15 -DA diente als Elternmolekül 3. Replikationsmöglichkeiten 1. Semikonservativ (Tochterstrang besteht jeweils aus einem Eltern- DA-Strang und einem Tochter- DA-Strang) 2. Konservativ (Eltern-DA- Doppelstrang wir komplett kopiert; es entsteht ein kompletter Eltern- DA-Strang und ein identischer Tochter-DA-Strang) 3. Dispers (Eltern-DA-Strang zerbricht in Einzelstücke; es entstehen 2 Stränge, die abwechselnd aus Eltern- und Tochter-DA bestehen) 4. Replikationselemente Replikationsgabel Multi-Enzym-Komplex: Topoisomerase: Entspiralisieren/Entwinden der Doppelhelix Helicase: Aufspalten des DA-Doppelstrangs durch Lösen der Wasserstoffbrücken

2 ssbp: Einzelstrang-bindendes Protein (Stabilisierung) Primase: Synthese des Primers (kurze RA-Sequenz) DA-Polymerase: Synthese des komplementären Stranges in 5-3 -Richtung Rase: Abbau der RA-Primer Ligase: Verbinden der einzelnen DA-Stücke Übersicht Replikationskomplex DA-Polymerisation Voraussetzungen für Polymerisation: Matrize (Eltern-DA- Strang) und Primer (mit freier 3 -OH-Gruppe am Ende) Korrekturlesefunktion: Entfernung falsch eingebauter ucleotide

3

4

5 Dnarepli.swf 5. Mechanismus Topoisomerase entspannt die superhelikale Struktur der DA (Spaltung der DA, Entwinden, Verschliessen) Helicase trennt die Doppelhelix in 2 Einzelstränge durch Lösen der Wasserstoffbrücken zwischen A/T bzw. G/C Primase synthetisiert RA-Primer als Startpunkt für die DA-Polymerase (freies 3 -OH-Ende) Polymerase synthetisiert komplementären Tochterstrang ausgehend vom 3 -Ende des Primers kontinuierliche Synthese am Leitstrang (5-3 -Richtung) Folgestrang: Polymerase muss in entgegengesetzter Richtung zur Helicase arbeiten Synthese kurzer Primersequenzen (ca. 10 nt) durch RA- Primase; Verlängerung durch DA-Polymerase zu Okazaki-Fragment (ca nt) bis zum 5 -Ende des vorherigen Fragmentes Abbau der Primer durch Rase; Auffüllen der Lücken durch DA-Polymerase DA-Ligase verbindet aufeinandertreffende 3 -und 5 - Enden zu kontinuierlichem Strang Beenden (Termination) der Replikation durch Bindung des Proteins Tus (terminator utilization substance) an DA; Blockieren der Helicase Topoisomerase trennt den restlichen unreplizierten Abschnitt Übungsaufgaben: Replikation 1. Das menschliche Genom besteht aus ca. 3 x 10 9 bp. Die DA-Polymerase arbeitet mit einer Geschwindigkeit von ca. 50 bp/s. Wie lange würde demzufolge ein Replikationszyklus dauern, wenn angenommen wird, dass nur ein Replicon existiert? 3x 10 9 bp / 50 bp x s -1 6 x 10 7 s etwa 695 Tage (ca. 2 Jahre) 2. Aus der Lösung der Aufgabe 1 ist ersichtlich, dass die Replikation des menschlichen Genoms an mehreren Orten gleichzeitig starten muss, da sie für das gesamte Genom etwa 20 h dauert. Wieviele Origins müssen demnach auf dem Genom mindestens vorhanden sein? 833 Origins 1 Origin: Replikation dauert 6 x 10 7 s = 1 Mio min = ,7 h / 20 h = 833,3 Origins

6 3. Weshalb findet die Replikation ausschliesslich in Richtung statt? Die DA-Polymerase benötigt das 3'-OH-Ende, um ukleotide anhängen zu können. Damit ist die Richtung der Replikation definiert. 4. Worin liegt der Unterschied in der Funktion einer Topoisomerase und einer Helicase? Elternmoleküle DA der ersten Generation 2. Generation Die Topoisomerase überwindet die Superwindung der DA, indem sie den einen Strang spaltet, abwickelt und wieder verschliesst. Damit macht sie die DA der Helicase zugänglich, die nun die Stränge voneinander trennen kann / 15 / Generation Informationsfluss Transkription Translation DA RA Protein Zellkern Cytoplasma 1. Allgemeines Transkription erster Schritt der Proteinbiosynthese Basensequenz der DA wird in mra (Botenoder messenger-ra) umgeschrieben dabei auch Bildung von tra (Transfer- oder Transport-RA) und rra (ribosomale RA) tra: Transport aktivierter Aminosäuren zu Ribosomen rra: Bestandteil der Ribosomen Prokaryoten 1 RA-Polymerase bestehend aus Core (Kern) mit den Untereinheiten α 2, β und β sowie dem σ- Faktor Eukaryoten 3 RA-Polymerasen aus bis zu 12 Untereinheiten RAP I synthetisiert rra RAP II und III synthetisieren mra und tra RA-Polymerasen benötigen keinen Primer und haben keine Reparaturfunktion! 2. Initiation (Start) RA-Polymerase bewerkstelligt Abschreiben eines Gens Verwendung von DA als Substrat sowie den Ribonucleotid- Triphosphaten ATP, UTP, CTP und GTP führt zu einem zum DA-Strang komplementären mra-strang Polymerase bindet an bestimmte ucleotidsequenz (Promotor) Prokaryoten: 10 ucleotide vor dem Transkriptionsstart (Pribnow-Schaller-Box); Erkennung dieser Sequenz durch σ- Faktor, der nach der Bindung an die DA abdissoziiert Eukaryoten: unmittelbar vor dem Startpunkt (Goldberg- Hognes-Box); Sequenz: TATAA

7 3. Elongation (Kettenverlängerung) Polymerase synthetisiert mra-strang, der komplementär zum Matrizen-DA-Strang ist ucleotide: ATP, UTP (anstelle von TTP), CTP und GTP Synthese erfolgt in 5-3 -Richtung Entwindung der DA durch RA-Polymerase-Protein- Komplex, Synthese der mra und sofortiges Verschliessen der DA 4. Termination (Ende der Transkription) 3 Stop-Signalsequenzen in der DA: ATT, ATC, ACT vorgelagerte GC-reiche Sequenzen, die Haarnadelschleifen ausbilden können Transkriptionsabbruch Beteiligung von Proteinen: Rho-Protein führt unter ATP- Spaltung zur Freisetzung der mras Reifung der RA (Processing) Unterteilung eukaryotischer Gene in Exons (codierende Sequenzen) und Introns (nichtcodierende Sequenzen) pro Gen bis zu 50 der 65 bis nt langen Introns möglich Spleißen: Entfernen der Intronsequenzen, erfolgt im Zellkern Beteiligung von Proteinen Modifikationen der mra Aufbereitung der mra für den Transport aus dem Zellkern durch die Kernporen in das Cytoplasma; erfolgt noch vor dem Spleißen Capping (cap = Kappe): Anhängen einer Art Kappe aus mehreren Methylguaninmolekülen (Veränderung des Guanins) an das 5 -Ende; wichtig für die Bindung an das Ribosom während der Translation Polyadenylation: Anhängen einer bis zu 200 ucleotide langen Sequenz aus Adenylatresten (Poly-A-Schwanz) an das 5 -Ende; vermutlich Stabilisierung der mra am Ende wird die mra mit Hilfe von Proteinen aus dem Zellkern in das Cytoplasma zu den Ribosomen transportiert Codogen Codon - Anticodon

8 Der Genetische Code Sprache der Gene wird mit Hilfe der Ribosomen in die Sprache der Proteine übersetzt deutsche Sprache: 26 Buchstaben; Computersprache: 2 Zeichen (0 und 1) Speicherung von Informationen durch Kombination der Zeichen, d.h. Wörter und Sätze genetische Sprache: 4 Buchstaben (A, T, C, G) Proteinsprache: 20 Buchstaben (Aminosäuren) Triplett-Code: Verschlüsselung der 20 Aminosäuren durch unterschiedliche Kombination der 4 Basen: 4 3 = 64 Möglichkeiten 61 Tripletts codieren für Aminosäuren; 3 sind Stop-Codone, für die es keine Aminosäure gibt; Proteinsynthese bricht an der Stelle ab eindeutig: eine bestimmte ucleotidsequenz legt eine bestimmte Aminosäuresequenz fest degeneriert: die Mehrzahl der AS wird durch mehr als ein Triplett codiert kommafrei: die Tripletts schliessen lückenlos aneinander nicht überlappend: ein ucleotid ist immer nur Bestandteil eines Tripletts universell: der genetische Code gilt für alle Organismen gleichermassen Translation 1. tra und Ribosomen an der Translation beteiligt: Enzyme, Proteine, Ribosomen, mit Aminosäuren beladene tras und die mra tra = Übersetzermolekül, trägt an einem Ende die spezifische AS und am anderen Ende das Anticodon (passend zur mra) Anticodon-Schleife zum Abtasten der mra; D- und T-Schleife dienen der Anheftung an das Ribosom Das Enzym Aminoacyl-tRA-Synthase belädt die tra im Cytoplasma mit den Aminosäuren.

9 Ribosomen Orte der Translation Zellen besitzen tausende Ribosomen (E.coli ca ) in Eukaryoten frei oder gebunden an das Endoplasmatische Reticulum oder die Kernmembran vorkommend, auch in Mitochondrien und Chloroplasten zu finden Unterteilung in grosse und kleine Untereinheit Prokaryoten: 70S Ribosomen (50S und 30S Untereinheit) Eukaryoten: 80S Ribosomen (60S und 40S Untereinheit) Typischer Aufbau eines eukaryotischen Ribosoms 3D-Modell eines E.coli-Ribosoms mit kleiner (gelb) und grosser (blau) Untereinheit. Die mra ist braun, die beiden tra-moleküle sind magenta und grün. 2. Ablauf der Translation Die Codon-Sequenz der mra wird in die Aminosäuresequenz des Proteins übersetzt mra enthält Start- und Stop-Codon (für Beginn und Ende der Translation wichtig) mra fädelt sich in Ribosom ein mit Aminosäuren beladene tras tasten mit ihrem Anticodon mra Stück für Stück ab bis zum fertigen Protein Bildung von Peptidbindungen zwischen den Aminosäuren 3 Phasen: Initiation (Start), Elongation (Kettenverlängerung) und Termination (Ende) Initiation kleine UE des Ribosoms und die Start-tRA (trägt Methionin) binden an die mra Startcodon: AUG Zwischen Sartcodon AUG und der Start-tRA kommt es zur Basenpaarung durch Wasserstoffbrücken Methionin: erste AS, trägt H 2 -Gruppe am Ende Anlagerung der grossen UE an die kleine UE; grosse UE besitzt 2 Bindungsstellen für tra-moleküle (Eingang und Ausgang)

10 Elongation Start-tRA-Komplex wandert ein Codon weiter an den P-Ort A-Ort (Eingang) ist frei für neue tra (Abb. Prolin) nach Bindung der Prolin-tRA an die mra wird zwischen den AS Methionin und Prolin eine Peptidbindung geknüpft tra für Methionin verlässt das Ribosom Ribosom rutscht ein Codon weiter in Richtung verbliebene tra wandert dann an den P- Ort (Ausgang); A-Ort (Eingang) wird frei Vorgang geht weiter in 5-3 -Richtung immer neue passende, beladene tra-moleküle binden an A- Ort, Peptidbindung wird geknüpft, tras rutschen an P-Ort bis Stop-Codon auftritt Abb.: Basenpaarung desanticodons der tra mit dem Codon der mra sowie die Peptidbindung Termination (Ende) Stop-Codons: UAA, UAG und UGA Abbruch der Synthese, da keine passende tra vorhanden Ribosomen-Untereinheiten fallen von der tra ab Proteine tragen Signalsequenz am Ende für Transport Polysomen eine mra fädelt sich oft in mehrere Ribosomen hintereinander gleichzeitige Entstehung von Polypeptidketten (Proteinen) mit steigender Kettenlänge Signaltransduktion 2. Signalmoleküle 1. Definition Übertragung extrazellulärer (von aussen) Signale ins Zellinnere bzw. Umwandlung extrazellulärer Signale in zellinterne Signale, Signalverstärkung und Vermittlung einer spezifischen Zellantwort Hydrophile (wasserlösliche) Signalmoleküle (löslich oder auf Zelloberflächen) Zelloberflächenrezeptoren Hydrophobe (wasserunlösliche) Signalmoleküle (Steroide, Vitamine, Tyroxin) intrazelluläre Rezeptoren Beispiele: Proteine, Peptide, Aminosäuren, ucleotide, Steroide (Cortisol, Sexualhormone, Vitamin D), Fettsäurederivate, Stickstoffmonoxid, Kohlenstoffmooxid

11 Zellen besitzen ein ausgefeiltes System, um auf Signale von aussen reagieren zu können: GTP-bindende Proteine (wichtige Klasse von Transmembranrezeptoren) Rezeptoren mit enzymatischer Wirkung (Transmembranproteine, die ausserhalb der Zelle das Signalmolekül binden und innen die enzymatische Reaktion auslösen) Intrazelluläre Rezeptorproteine (Signal gelangt durch die Zellmembran und verbindet sich mit dem Rezeptor) Prozesse im Inneren der Zelle: 1. Anhängen von Phosphatgruppen an andere Proteine durch Proteinkinasen 2. Abspaltung von Phosphatgruppen an andere Proteine durch Proteinphosphatasen Erläuterung zur Abbildung Signaltransduktion: 1. Ein G-Protein-abhängiger Rezeptor wird durch ein Signal aktiviert. Dadurch wird ein second messenger aktiviert (Ca 2+ oder camp). Dieser aktiviert seinerseits Kinasen. Deren Aktivierung führt zur Expression ganz bestimmter Gene. 2. Durch ein äußeres Signal dimerisiert der Tyrosinkinaserezeptor. Im Inneren phosphoryliert er bestimmte Kinasen. Diese aktivieren dann ganz bestimmte Transkriptionsfaktoren, die bestimmte Gene exprimieren. 3. Ein Steroidhormon diffundiert durch die Zellmembran. Im Inneren der Zelle verbindet es sich mit einem Rezeptor. Dieser Komplex kann nun in den Kern diffundieren und dort die Expression bestimmter Gene auslösen. 3. Phasen der Signaltransduktion Bindung des Signalmoleküls an Membranrezeptoren Weiterleitung des Signals über die Zellmembran hinweg Intrazelluläre Signaltransduktion Steuerung von Transkription, Translation, Stoffwechsel, etc. Ligand (z.b.) Hormon durchdringt die Zellmembran Bindung des Liganden an einen Rezeptor innerhalb der Zelle, Weiterleitung des Signals in der Zelle 4. Signalübertragung durch Transmembranrezeptoren Übertragung einer Information über die Zellmembran hinweg äusseres Signal (primärer messenger) bindet an einen Rezeptor auf der Zellmembran und löst im Zellinneren eine Reaktion aus, z.b.: Einleiten der Genexpression (Transkription, Translation) Veränderung der Aktivität eines Enzyms Umorganisieren des Cytoskeletts der Zelle Veränderung der Durchlässigkeit der Membran Einleiten der Mitose Einleiten der Apoptose (Selbstmord der Zelle) Abb.: Transmembran- Rezeptor äusserer Teil ragt in Extrazellularraum und bindet Signalmoleküle durch mittleren Teil erfolgt Verankerung des Proteins in der Zellmembran (z.t. bis zu 7 Membrandurchgänge) innerer Teil ragt ins Cytoplasma und löst eine Reaktion aus

12 5. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Wichtige Klasse von Rezeptoren, die einen second messenger (2. Botenstoff im Inneren der Zelle) aktivieren camp-weg: Das G-Protein aktiviert die Adenylatcyclase (Enzym), die camp bildet. Das entstandene camp (second messenger, 2. Botenstoff) aktiviert das Zielprotein. Ca 2+ -Weg: Das G-Protein aktiviert ein Enzym, das seinerseits die Öffnung von Ionenkanälen für Ca 2+ (second messenger) bewirkt. Das freigesetzte Ca 2+ aktiviert das Zielprotein.