Systeme zum Nachweis. Vor und Nachteile

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1 Gesundheitsdirektion Systeme zum Nachweis von Antibiotikarückständen in der Milch: Vor und Nachteile

2 2 Inhalt I II III IV V Welche Messverfahren gibt es? Welche Anforderungen müssen Messverfahren erfüllen? Wahl des Messverfahren? Wie misst das Kantonale Labor Zürich? Fazit

3 3 Messverfahren Mikrobiologische Verfahren (Hemmstofftests) Immunchemische Verfahren (ELISA) chemisch-physikalisch Messverfahren (LC-MS/MS, LC-HRMS)

4 Mikrobiologische Verfahren Kanton Zürich 4 Hemmung des Wachstums ausgewählter Testkeime Name Kultur EU 4-Plattentest B. subtilis ph 6 B. subtilis ph 7.2 B. subtilis ph 8 M. luteus Premi Test Nouws Antibiotic Test (NAT) und weitere B. stearothermophilus B. subtilis ph 8.5 K. rhizophila ph 8 Y. ruckeri ph 6.5 B. pumilus ph 7 B. cereus ph 6

5 5 Nachweisvermögen Beispiel: Hemmstofftest Quelle: NRL Österreich (AGES Wien) Tetracycline Macrolide Nafcillin Cefacetril, Cefquinom, Ceftiofur Chinolone Cefacetril, Cefquinom, Ceftiofur Tylosin Sulfonamide Penicilline B. cereus B. subtilis M. luteus E. coli B. stearothermophilus Aminoglycoside Cephalosporine

6 Immunchemische Verfahren Kanton Zürich 6 Sandwich-ELISA (Beispiel) 1 coat-antikörper auf Oberfläche Mikrotitterplatte 2 Zugabe der Probe mit Analyt (Antigen) 3 Zugabe eines 2. Antikörpers zur Detektion 4 Zugabe eines enzym-gebundenen Antikörpers 5 Zugabe eines durch Enzym umsetzbaren Substrates

7 «Schnelltests» Kanton Zürich 7

8 8 Delvo T Test (früher Delvo SP Test) Erfahrungen des NRL Österreich (AGES Wien) Nachweisvermögen der Antibiotika grossteils am MRL geprüft. Gut funktionieren (Nachweisvermögen MRL): Sulfonamide ß-Lactame (Ausnahme: Cefquinom und Desfuroylceftiofur > MRL) Tetracycline (Ausnahme: 4-Epimere: > MRL) Schlecht funktionieren (Nachweisvermögen > MRL): Trimethoprim Aminoglykoside (Ausnahme: Neomycin MRL) Makrolide Lincosamide Chinolone Rifaximin Colistin

9 chemisch-physikalische Messverfahren Kanton Zürich 9 Kopplung Flüssigchromtographie mit Massenspektrometrie (HPLC-MS, UHPLC-MS/MS, UHPLC-HRMS)

10 10 Aufarbeitung Milchprobe Aufreinigung Festphasen Extraktion Aufkonzentrieren Zentrifugation Extrakt UHPLC-MS/MS (HRMS)

11 Ultrahochdruckflüssigchromatografie (UHPLC) Kanton Zürich 11 2 mm bar bar 3 Partikelgrösse 2 µm t=2 min bar bar 4 t=0 min t=5 min

12 12 Ionisation Nebulizer Cone UHPLC MS N 2 Heater Corona discharge needle Scimmer atmospheric pressure vacuum

13 13 Massenspektrometrie Messung m/z von Ionen (Beispiel Quadrupol) Quelle:

14 14 Massenspektrometrie LC-MS medium selectivity Tetracyclines in fish (100 µg/kg)

15 15 Massenspektrometrie Tandem-Quadrupole Quadrupole 1 Quadrupole 2 (collision cell fragmentation) Quadrupole 3

16 16 Massenspektrometrie LC-MS medium selectivity LC-MS/MS high selectivity Tetracyclines in fish (100 µg/kg)

17 17 Massenspektrometrie Hochauflösende Massenspektrometrie: z. B. Time-of-flight Quelle: Massengenauigkeit: Da

18 18 Nachweisvermögen Beispiel: Multi-TAM-Methode Milch KLZH (114 Wirkstoffe, UHPLC-HRMS) Wirkstoffgruppe LOD [µg/kg] f = MRL/LOD Chinolone Sulfonamide 2 50 Tetracyline Penicilline Cephalosporine Nitroimidazole Makrolide Lincosamide

19 19 Inhalt I II III IV V Welche Messverfahren gibt es? Welche Anforderungen müssen Messverfahren erfüllen? Wahl des Messverfahren? Wie misst das Kantonale Labor Zürich? Fazit

20 Akkreditierung - Validierung Anforderungen an Messlabor: EN17025 akkreditiert Methode im akkreditieren Bereich Methode validiert gemäss 2002/657/EG Beherrschung der Methode mit Ringversuchen belegt Kanton Zürich 20 cc-a: Mass zur Erkennung FP cc-b: Mass zur Erkennung FN

21 21 Screeningergebnisse RV Jahr Wirkstoffe 2015 Sulfonamide/Trimethoprim Makrolide exkl. b-lactame 2014 Tetracycline Aminoglycoside Lincosamide/Makrolide 2013 Tetracyline Chinolone b-lactame Kokkzidistatika 2009 Makrolide Chinolone Aminoglycoside Total FN mikrobio. Tests FN biochem. Tests FN chem./phys. Tests FN 7 % 23 % 0 % 0 % 5 % 15 % 0 % 0 % 7 % 21 % 0 % 4 % 53 % 73 % 50 % 22 % Quelle: Proficiency test for antibiotics in chicken muscle, 2015

22 Gehalt in µg/kg Kanton Zürich 22 Messunsicherheit Bereich in dem der wahre Wert liegt 1.2 Höchstwert Messwert 0.4 Fall 1: verkehrsfähig Fall 2: keine Beurteilung möglich Fall 3: keine Beurteilung möglich Fall 4: nicht verkehrsfähig

23 23 Inhalt I II III IV V Welche Messverfahren gibt es? Welche Anforderungen müssen Messverfahren erfüllen? Wahl des Messverfahren? Wie misst das Kantonale Labor Zürich? Fazit

24 Geeignetes Messverfahren Kanton Zürich 24 Mikrobiologische Verfahren Immunchemische Verfahren (ELISA) physikalischen Messverfahren (LC-MS/MS, LC-HRMS)

25 25 Screeningergebnis Ergebnis positiv 2002/657/EG Bestätigungsverfahren

26 Vergleich Screening Kanton Zürich 26 Bestätigung/ Quantifizierung Mikrobiologische Verfahren + Immunchemische Verfahren (ELISA) + chem./phys. Messverfahren (LC-MS/MS, LC-HRMS) + +

27 27 Analyse ja, aber welche? Was weiss ich: Verabreichtes Medikament? Was will ich wissen: Rückstandskonzentration? Ware lebensmittelrechtlich konform? Bemerkung Spezifische Analyse vs. Multimethode > MRPL, > MRL

28 28 Inhalt I II III IV V Welche Messverfahren gibt es? Welche Anforderungen müssen Messverfahren erfüllen? Wahl des Messverfahren? Wie misst das Kantonale Labor Zürich? Fazit

29 und was macht das KLZH? Messverfahren 3 UHPLC-HRMS ELISA (nur Harnscreening auf Aminoglycoside und Chloramphenicol) Kanton Zürich 29 Aufwand, Leistungen über 30 Jahre Erfahrung 500 Stellen-% Proben/Jahr 50 % des NFUP Grenztierärztliches Monitoring und Expressanalysen seit anfangs 2018 NRL für Fremdstoffe in Lebensmitteln tierischer Herkunft

30 30 Daten aus der Praxis NFUP Milchproben untersucht mit Multi-TAM-Methode im KLZH Anzahl Proben untersucht 426 Wirkstoff mit Rückständen <MRL 9 Cloxacillin (3) Tetracylin (2) Sulfadimidin (1) Tetracyclin, Cloxacillin (1) Spiramycin (2) mit Rückständen >MRL 1 Sulfadimidin, Sulfadiazin, Sulfathiazol

31 31 Inhalt I II III IV V Welche Messverfahren gibt es? Welche Anforderungen müssen Messverfahren erfüllen? Wahl des Messverfahren? Wie misst das Kantonale Labor Zürich? Fazit

32 32 Alle Messverfahren haben Vor- und Nachteile man muss sie kennen!

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