Direktnachweis mit Agglutination nicht mehr üblich Direktnachweis von Toxinen auf Zellkultur nur für Forschung

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1 Konventioneller Nachweis der Bakterien in Patientenmaterial Gram-Präparat von Direktpräparat Normalflora berücksichtigen, z.b. bei Sputum Beispiele von Hinweis auf Erreger im Gram-Präparat Prinzip der Gram-Färbung Schwiergkeiten bei Gram-Färbung Beispiele anhand von Dias im Kurs Allenfalls auch Nativpräparate (KOH) für Pilze Methylenblaufärbung (auch in Giemsa-Färbung enthalten) Direktnachweis von Antigenen Beispiel von Pneumokokken-Antigen im Urin und Liquor Beispiel von Legionella-pneumophila Serotyp 1 im Urin Direktnachweis mit Agglutination nicht mehr üblich Direktnachweis von Toxinen auf Zellkultur nur für Forschung Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 1

2 Normalflora des Menschen Der Mensch ist mit 10 mal mehr Bakterien besiedelt als er Körperzellen besitzt. Diese Bakterien sind für den Menschen in der Regel nützlich. Nicht alle Bakterien, die man im Mikroskop sieht, sind Erreger Beispiel Sputum mit viel Epithelzellen nicht zur Kultur geeignet Gram-Färbung in 100-facher Vergrösserung zeigt Zellen der Mundschleimhaut 1000-fache Vergrösserung des Ausschnitts zeigt Tausende von Bakterien in einem Klumpen Epithelzellen Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 2

3 Pneumokokken und Haemophilus influenzae im Respiratorischen Material Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 3

4 Bakterien-Direktnachweis mit Färbung Zellen werden gleichzeitig erfasst Diese Zusatzinformation gibt keine PCR etc. Meningokokken Staphylokokken Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 4

5 Gram-Färbung und Bakterienzellwand Gram-positive Zellwand Gram-Färbung Murein Kristallviolett/ Lugol Alkohol Fuchsin Gram-negative Zellwand Murein Kristallviolett/ Lugol Alkohol Fuchsin Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 5

6 Prinzip der Gram-Färbung (1) Geschichte 1884 Gram war ein Pathologe in Berlin. Er versuchte, Kerne mit Gentianaviolett blau und Cytoplasma mit Lugol braun zu färben. Gleichzeitig wollte er Bakterien im Gewebe besser darstellen. In Histologieschnitten konnte er die Farbstoffe mit Alkohol wegspülen, um das gleiche Präparat wiederholt anzufärben. Dabei sah er Bakterien, die auch nach Alkohol blau blieben. Gram erkannte, dass sich Bakterien auch entfärben liessen, z. B. Salmonellen, aber auch Pneumokokken Roux Gram-Färbung. Gewisse Bakterien lassen sich nach Gentianaviolett/Lugol mit Alkohol entfärben und mit Carbolfuchsin rot gegenfärben Gram-negative Bakterien. Andere lassen sich nicht mehr entfärben und bleiben blau Gram-positive Bakterien Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 6

7 Prinzip der Gram-Färbung (2) Gram-Farbstoffe sind Anilinverbindungen (Benzolring-NH 2 ) verbunden mit Chromophor Farbstoffe sind geladen Beispiel: Eosin ist negativ geladen, bindet an positiv geladene Strukturen Cytoplasma, Erythrozyten werden rot gefärbt. Hematoxilin ist positiv geladen, bindet an negativ geladene Strukturen Zellkerne (Nucleinsäuren) werden blau gefärbt. Methylenblau ist auch ein Anilinfarbstoff, aber auch ein Redox-Indikator Farbstoffe für Gram-Färbung am IMM Zürich Kristallviolett: 4% in Alkohol 1:10 in H 2 O/(ca.2%) Phenol 0.4% - 1 Min. auf hitzefixiertes, abgekühltes Präparat geben - fakultativ kurz abspülen mit Wasser Lugol: 100g KJ, 50g J in 1 Liter H 2 O1:10ca. 1% - mind. 2 Min. überschichten, darf aber auch länger sein: einige Min. Aceton/Alkohol 1:2 bis zur völligen Entfärbung, ca. 1-2 Min. - kurz mit Wasser spülen Certistain Merck: 1% in Alkohol 1:10 in Wasser 0.1% Endkonz bis 1 Min. Achtung vorher und nachher kurz mit Wasser spülen Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 7

8 Schwierigkeiten und Hinweise für Gram-Färbung Wichtige Hinweise für Gram-Färbung GNS nicht geteilt Farblösungen müssen möglichst frei sein von Niederschlägen Filtration Farbniederschläge können als Gram-positive Kokken fehlinterpretiert werden Struktur von Bakterien ist in der Regel scharf abgegrenzt Unter Therapie nicht typische Morphologie, GNS nicht geteilt Im Zweifel mit Methylenblau-Färbung kontrollieren In der Methylenblaufärbung sind alle Bakterien blau Gram-negative Wasserbakterien können falsch positive Resultate verursachen Vorsicht bei einigen Geräten Bakterien können falsches Gramverhalten zeigen Pneumokokken falsch Gram-negativ Acinetobacter sp. falsch Gram-positiv Bakterien zeigen ihre Morphologie am besten im Flüssigmedium Flüssig-Präparat zur Unterscheidung von Stäbchen / Kokken Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 8

9 Direktnachweis von Antigenen Streptococcus pneumoniae - Binax Now-Schnelltest Antigennachweis (Polysaccharid) aus Urin und Liquor mit einem immunchromatographischen Schnelltest Schnelldiagnose einer Pneumokokkenpneumonie oder Pneumokokkenmeningitis Falls unsicher, ob entfärbte Pneumokokken oder Meningokokken im Liquor Schnelltest hilft zur Unterscheidung Analoger Test für Legionella pneumophila Serotyp 1 aus Urin Seit der Einführung dieser Schnellteste nahmen die Meldungen in der Schweiz zehnfach zu Serologie ist nicht mehr aktuell, nur in epidemiologischen Studien. Heute ergänzt durch PCR aus Respirationstrakt Legionellen PCR aus dem Wasser war die erste kommerzielle PCR Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 9

10 Sensitivität und Spezifität des Pneumokokken- Binax für Pneumokkken aus dem Urin (1) Sensitivität Spezifität Antigennachweis aus Urin Firmenangabe (retrospektiv) 86% 94% (Blutkultur für Pneumokokken positiv) Firmenangabe (prospektiv) 90% 78% (pos. Blutkultur; outpatients) Firmenangabe (prospektiv) 90% 71% (pos. Blutkultur; Spital) Antigennachweis aus Liquor Firmenangabe (prospektiv) 97% 99% Literaturdaten Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 10

11 Sensitivität und Spezifität des Pneumokokken- Binax für Pneumokkken aus dem Urin (2) Angaben aus Literatur Sensitivität Spezifität Antigennachweis aus Urin Gutiérrez et al. (2003) CID, 36: % 90% (prospektiv, CAP, pos. Blutkultur, Pleura oder Sputum) Smith et al. (2003) JCM, 41: % 97% (prospektiv, pos. BK), Antigen nach 3 Tagen unter Therapie noch positiv Correspondenz im CID: PPV 54%, NPV 95% Roson et al. (2004) CID, 38: ,9% 100% (CAP, nicht schwer immunsuppr. Patienten) wenn hohes Risiko für Pneumonie 94% wenn Sputum positiv für Pneumokokken 97% wenn Blutkultur positiv für Pneumokokken 92% Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 11

12 Nachweis von Clostridium difficile Toxin Antibiotika unterdrücken im Darm normale Bakterien Andere Bakterien vermehren sich; zum Beispiel Clostridium difficile Clostridium difficile bildet Cytotoxin B, welches Darm schädigt Normale Fibroblasten-Kultur Cytotoxischer Effekt auf Kultur Heute kaum mehr eingesetzt, eher EIA für Toxin A und B oder neu zuerst Nachweis von GDH mittels EIA und anschliessend PCR Konvenitoneller Direktnachweis der Bakterien in Patientenmaterial R. Zbinden Seite 12