Manuelle. Extraktion. DNA Extraktionskits
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- Franka Ritter
- vor 5 Jahren
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Transkript
1 Manuelle Extraktion DNA Extraktionskits
2 XpressDNATM Tissue / Cell Line Kit... Tissue / Cell Line Kit Extraktion reiner genomischer DNA aus tierischem Gewebe Tierische Gewebe sind eine wichtige Quelle von Nukleinsäuren für die genetische Analyse und die Erstellung von Genexpressionsprofilen. Obwohl viele traditionelle Methoden zur Extraktion von DNA verwendet werden, sind sie zeitaufwendig und umständlich. Die Optimierung der DNA-Extraktion aus jedem Gewebetyp bleibt jedoch ein wesentlicher Engpass für viele Downstream-Anwendungen. Abb. 1 Um dieses Problem zu überwinden, war es wichtig, eine Methode zu entwickeln, die genomische DNA konsequent aus verschiedenen tierischen Geweben extrahieren kann (Abb. 1). Die XpressDNATM Technologie bietet eine einfache und flexible magnetische Nanopartikelbasierte Methode, die die Extraktion genomischer DNA aus frischen, gefrorenen oder Ethanolkonservierten Gewebetypen ermöglicht (Abb. 2 & 3). Konstante DNA-Ausbeuten im Vergleich zu anderen Extraktionsmethoden Abb. 2 Genomische DNA wurde aus verschiedenen tierischen Geweben wie Herz, Gehirn, Niere, Leber, Milz, Muskel, Rattenschwanz und Fischflosse (Bande L2 - L8) mittels XpressDNATM Tissue Mini-Kit extrahiert und auf 0,8 % Agarosegel untersucht. Bande L1: 1kb DNA Leiter; Bande L9: eine Positivkontrolle
3 XpressDNATM Tissue / Cell Line Kit... Hohe Ausbeuten an reiner DNA aus ethanolkonservierten Fischgeweben Abb. 3 Genomische DNA wurde mit dem XpressDNATM Tissue Mini Kit aus 50 mg Ethanolkonservierten Geweben extrahiert. Bande: L -1kb DNA-Leiter; Bande: E1 - E9 - DNA aus neun verschiedenen Ethanolkonservierten Fischgeweben. Fazit: Der XpressDNATM Tissue Mini Kit ermöglicht die effiziente und zuverlässige Extraktion ge-nomischer DNA aus einer Vielzahl von Gewebeproben. Der Kit, der für die Verarbeitung von mg Probengröße verfügbar ist, arbeitet konsistenter als die traditionellen Extraktionsmethoden und liefert höhere Ausbeuten an reiner DNA. Das XpressDNATM-Protokoll wurde entwickelt, um hochmolekulare, langkettige DNA zu extrahieren, die frei ist von Protein- und RNA-Verunreinigungen sowie PCR-Inhibitoren. Das einmal aufgeschlossene und lysierte Gewebe wird mit einer Suspension mit magnetischen Nanopartikeln vermischt, welche die DNA auf der Oberfläche der magnetischen Nanopartikel bindet. Die gebundene DNA wird dann mit alkoholischen Lösungen gewaschen, um Proteine und andere Verunreinigungen zu entfernen, bevor sie im Elutionspuffer gelöst wird. Die so extrahierte DNA eignet sich für Downstream-Anwendungen wie PCR, Restriktionsverdau, Sequenzierung etc. (Abb. 4). Der XpressDNATM MagnaStand ist ein Magnetabscheider, der die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proben während der Auftrennungsschritte der magnetischen Nanopartikel ermöglicht. Der XpressDNATM Magna Stand besteht aus Magneten mit seltenen Erden, die eine effektive Magnetstärke zur Verarbeitung der verschiedenen Volumina der Kit-Protokolle gewährleisten.
4 XpressDNATM Tissue / Cell Line Kit... Hochreine DNA für die Weiterverarbeitung Abb. 4 1% der mit dem XpressDNATM Tissue Mini Kit eluierten DNA ( ng) wurde in PCRAmplifikationsreaktionen verwendet. Abbildung 4: (A) Die DNA aus vier verschiedenen frischen Geweben wurde mit zwei verschiedenen Primer-Sets, COI bzw. Cyt b, amplifiziert. (B) DNA aus neun verschiedenen ethanolkonservierten Geweben wurde mit COI-bzw. Cyt b-spezifischen Primern amplifiziert. L1: bp Leiter. (C) Genomische DNA, die mit dem XpressDNA Tissue/Cell Line Kit aus CHO-Zelllinien extrahiert wurde. Die Banden 1-3 stellen DNA dar, die aus 0,5 x 106 Zellen, 1 x 106 Zellen und 1,25 x 106 Zellen isoliert wurden.
5 XpressDNATM Blood Kit... Blood Kit Der XpressDNATM Blood Kit bietet ein einfaches und schnelles System zur Isolierung hochwertiger genomischer DNA aus Blut, ob frisch oder gealtert. Die XpressDNATM-Technologie bietet eine einfache und flexible, auf magnetischen Nanopartikeln basierende Methode, die die Extraktion von hohen Mengen reiner DNA ermöglicht, wie aus dem 260/280-Verhältnis und den Ergebnissen der Agarosegelelektrophorese deutlich wird (Abb. 5 und 6). Qualität von mit XpressDNATM Blood Kit extrahierter DNA durch Prüfung des Verhältnisses 260/280. Abb. 5 Die oben gezeigten Daten wurden jeden zweiten Tag und über einen Zeitraum von 2 Monaten gesammelt und zeigen, dass die Qualität der DNA bei der Extraktion mit diesem Kit hoch bleibt. Statistik: Gesamtzahl der während eines Zeitraumes von 66 Tagen entnommenen Proben = 120+ Durchschnittliche Ausbeute bei 400µl Blut: -12 µg Ausbeute 260/280-Verhältnis = 1.80 Ausbeute 260/280-Verhältnis = 2.01
6 TissueKit / Cell Line Kit... XpressDNATM Blood... Hohe Ausbeuten an reiner DNA aus Blut Abb. 6 Genomische DNA wurde mit dem XpressDNATM Blood Kit aus 400µl frischem Blut extrahiert. Bande 1: 1kb Leiter, Banden 2 bis 5: mit Xpress-DNATM-Blutkit extrahierte DNA Fazit: Die mit dem XpressDNATM Blood Kit extrahierte DNA ist für alle Downstream-Anwendungen wie PCR, Realtime-PCR, Restriktionsverdau und Sequenzierung geeignet (Abb. 7). PCR-Amplifikation von Jak2 aus genomischer DNA extrahiert mit XpressDNATM Blood Kit Die Eingangskonzentration der Template-DNA betrug ng und das Reaktionsvolumen 20µl. Bande 1: 100 bp-leiter, Bande 2: Positive Kontroll-DNA mit 53ng/µl Konzentration und einer Reinheit von 1.80 (A260/280-Verhältnis) Bande 3: DNA extrahiert mit XpressDNATM Blut Kit Bande 4: Negativ-Template-Kontrolle Bande 5: DNA extrahiert mit XpressDNATM Blut Kit Abb. 7
7 XpressDNATM Blood Kit... Abb. 8 Resumée: Die mit XpressDNATM Kits extrahierte DNA ist für alle DownstreamAnwendungen wie PCR, RealTime PCR, Restriktionsverdau und Sequenzierung geeignet.
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