Molekulargenetischer Nachweis und Genotypisierung von HPV

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1 Molekulargenetischer Nachweis und Genotypisierung von HPV Dr. Sabine Sussitz-Rack Institut für Labordiagnostik und Mikrobiologie Vorstand: Prim. Prof. DDr. Pranav Sinha

2 Humanes Papillomavirus HPV HPV ist ein kleines ds-dna-virus mit lediglich 8 Genen. Die genetische Information ist in nicht umhüllten Capsiden verpackt.

3 Humanes Papillomavirus HPV 6 dieser Gene codieren für Proteine, die für die Virusvermehrung gebraucht werden (frühe Proteine E1-E5). Die beiden anderen Gene sind für den Zusammenbau des Capsids notwendig (L1 und L2) enthält Epitope, die für die Immunneutralisation notwendig sind.

4 Virusgenom Für die kanzerogene Wirkung verantwortlich sind die Onkogene E6 und E7 E6 Protein bindet an p53 und führt auch zur Telomeraseaktivierung E7 Protein interagiert mit p21 und dem Rb Protein und aktiviert Gene für die Zellproliferation

5 Humanes Papillomavirus HPV HPV ist extrem heikel in der Auswahl seiner Zielzellen. Infiziert werden ausschließlich die basalen Zellen von Haut oder Schleimhautepithel. Diese Zellen liegen der Basalmembran an und sind als basale Stammzellen in der Lage, Epithelzellen zu ersetzen. Sie proliferieren

6 Infektionsverlauf Die meisten HPV-Infektionen verlaufen transient über circa 4-20 Monate, wobei Hochrisiko-Viren länger zu persistieren scheinen als Niedrigrisiko-Viren Trottier H., Franco E. L. The epidemiology of genital human papillomavirus infection Vaccine Mar 30; 24 Suppl 1: S1-15

7 Abstrichproben Für den Nachweis des humanen Papilloma Virus aus Urogenitalproben kommt der sorgfältigen Probengewinnung eine wesentliche Bedeutung zu, da die Erreger intrazellulär in Zylinderepithelzellen liegen und Zellmaterial im Abstrich enthalten sein muss.

8 Abstrichproben Kein anderes als das von uns empfohlene und validierte Entnahmebesteck verwenden, da nur damit eine optimale Durchführung des Tests möglich ist. Bürste bis auf den Boden des Transportröhrchens einführen. Schaft an der Bruchlinie abbrechen und Röhrchen fest verschließen.

9 Abstrichproben Ein negativer HPV-Befund schließt das Vorhandensein viraler DNA aber nicht vollständig aus: a. zu wenig Epithelzellen im Abstrich (Ort und Qualität des Abstrichs) b. geringe Virusproduktion die Virusproduktion unterliegt zum Teil starken Schwankungen Bei zytologischem Verdacht empfiehlt sich eine Kontrolluntersuchung der PCR in einigen Wochen.

10 Wahl der Teste Obsolet, da zu wenig empfindlich 1. Southern Blot 2. In-situ-Hybridisierung 3. Immunhisto- oder Zytochemie Empfohlen durch Fachgesellschaften 1. PCR Vorteil: empfindlich, spezifisch, HPV Typen werden erfasst Nachteil: störanfällig, kein Grenzwert definiert, ab dem klinische Relevanz 2. Hybrid Capture Assay Vorteil: schnell, spezifisch, 18 HPV Typen werden erfasst Nachteil: Diskriminierung nur zwischen low risk und high risk Typen möglich, keine Genotypisierung

11 PCR Detektion und Typisierung des PCR Produktes mittels RFLP und Gel Dot Blot Assay EIA oder Reversen Line Blot Assay möglich

12 PCR reverser Line Blot Assay Typ PCR Patientenprobe Sichbarmachung der Infektion

13 HPV Type Express Bio Products MY09/11 single step PCR mit allel spezifischer reverser Hybridisierung (Reverse Line Blot Assay LBA)

14 HPV Type Express

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16 HPV Type Express Low risk Typen: 6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81 High risk Typen: 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68, 73,82 und 26,53,66 Somit 11 low risk Typen und 18 high risk Typen

17 Hybrid Capture Assay (HC2) Beim Hybrid Capture II HPV-Test (Digene, USA) handelt es sich um ein Signal-verstärkendes Hybridisierungsverfahren, das im Unterschied zur PCR ohne Amplifikation des nachzuweisenden Erreger-Genoms auskommt

18 Aussage des Hybrid Capture HPV-Tests Die Hybridiserung der Patientenproben erfolgt mit 2 verschiedenen 'Sonden-Cocktails'. Sonde A erkennt die HPV-Typen 6, 11, 42, 43, 44, die mit einem geringen Krebsrisiko assoziert sind ('Low oncogenic risk'). Sonde B reagiert mit den HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, bei denen das Krebsrisiko als intermediär bis hoch eingestuft wird ('High oncogenic risk').

19 Aussage des Hybrid Capture HPV-Tests Der Test erlaubt damit nicht nur die Aussage, ob eine HPV-Infektion vorliegt, sondern - im positiven Fall - auch, ob die Infektion durch Viren der 'Low Risk' und/oder der 'High Risk'- Gruppe verursacht ist.

20 PCR versus HC2-Assay HPV Typisierung von hoher Relevanz, da die Persistenz eines Hochrisiko-HPV-Typs ein deutlich erhöhtes kanzerogenes Risiko darstellt. 10 Jahresinzidenz einer schweren Dysplasie beim Nachweis von HPV 16 oder 18 beträgt 17% bzw. 13%, hingegen bei einem HC2-High-Risk-positivem Ergebnis nur 3% (Khan et al., J Natl Cancer Inst 2005; 97: ) Genotypisierung von HPV-Typen ist nur mit der PCR möglich und nicht mit dem HC2-Assay

21 PCR versus HC2-Assay Der Direkthybridisierungstest (HC2- Assay) erfasst einige HPV-Typen nicht, die eine schwere Dysplasie und Zervixkarzinome verursachen z.b. HPV 53, HPV 66, HPV 73, HPV 82.

22 HPV Typisierung mittels PCR Differenzierung zwischen Reaktivierung bei persistierender HPV-Infektion und Neuinfektion/Reinfektion mit einem anderen Genotyp Nachweis einer Infektion mit mehreren HPV-Typen

23 HPV-Genotypisierung Risikoabschätzung durch Differenzierung kanzerogener HPV Typen Überwachung der Persistenz einer HR-Infektion als wichtigem Progressionsmarker (S. Venturoli et al. Journal of Medical Virology 2008; 80: ) Prognoseabschätzung Behandlungs-Outcome HPV 16 und 18 erhöhtes Rezidivrisiko (A. R. Kreimer et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006; 15/5: ) zuverlässige Detektion HPV-negativer Proben mit sehr hohem negativen prädiktiven Aussagewert