Klonierung von Säugern durch Zellkerntransfer
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- Bernd Küchler
- vor 8 Jahren
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Transkript
1 Klonierung von Säugern durch Zellkerntransfer Gentechnik und Genomics WiSe 2007/2008 Kristian M. Müller Institut für Biologie III Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
2 Können differenzierte Zellen einen Organismus bilden? Wird durch Differenzierung das Genom irreversibel modifiziert? In den 60er Jahren des 20. Jarhundet erhält J. B. Gurdon nach Kerntransplantation aus frühen Embryonalzellen von Xenopus laevis erwachsene Frösche klonte S.M. Willadsen durch Kernaustausch embryonaler Zellen Schafe (Nature, 1986, 320, 63) publiziert die Gruppe von Ian Wilmut die Klonierung eines Schafs durch Zellkerntransfer kultivierter embryonaler Zellen (Nature 1996,380, 64) wird das Schaf Dolly geboren, das durch Zellkerntransfer einer Euterzelle gewonnen wurde (Nature 1997, 385, 810) berichten Schnieke et al. (Roslin Institute, PPL Therapeutics) über die Geburt transgener Schafe, die durch Genmanipulation von Fibroblasten und anschließenden Zellkerntransfer erzeugt wurden (Science 1997, 278, 2130). Seit 1996 wurden über mehrere erfolgreiche Klonierungen durch somatischen Zellkerntransfer berichtet berichtet eine Gruppe den Kerntransfer einer humanen männlichen Fibroblastenzelllinie in frisch gewonnene Eizellen und die Entwicklung von Blastocysten (Stemm Cells Jan 17, 2008, online).
3 Dolly * Dolly ist das erste aus einer differenzierten Zelle (Euterzelle) klonierte Säugetier. Im Alter 6 1/2 Jahren wurde Dolly, eine mehrfache Mutter, nach einer Lungenentzündung eingeschläfert.
4 Dolly und Kollegen Die ersten klonierten Kühe, Japan 1998 Die ersten klonierten Schweine, PPL Therapeutics Virgina, 2000 Cc erste klonierte Katze 2001 Idaho Gem erster Klon der Pferde-Familie, 2004
5 Ein kritischer Blick ist wichtig
6 Die frühen Experimente
7 Klonierung von Dolly
8 Die Entstehung von Dolly im Detail Wilmut und Kollegen experimentierten mit verschiedenen Zelllinien (Embyonalzellen, Zellen eines Foeten, Euterzellen eines 6 Jahre alten trächtigen Schafs). Die Zellen wurden in vitro für einige Tage vermehrt und durch Serumentzug in das G 0 - Stadium überführt. Aus den Eileitern von Spendertieren wurden befruchtungsreife Eizellen (Metaphase II Stadium) gewonnen und die in der Metaphase-Platte angerodneten Chromosomen abgesaugt. Donor-Zellkerne bzw. ganze Zellen wurden dann mit dem Rezipienteneizelle verschmolzen. Hierzu wird ein elektrischer Impuls eingesetzt, der auch die Aktivierung der der fusionierten Zelle bewirkt. Die Eizelle beginnt dann mit der ersten Furchungsteilung. Die manipulierten Eizellen wurdenin abgebundenen Eileitern in vivo 6 Tage inkubiert und dann der Entwicklungsstand evaluiert. Embryonen, die sich zum Morula oder Balstocystenstadium entwickelten wurden in Leihmütter eingesetzt. Der Gynäkologe 1998, 31, 91
9 Die biologischen Grundlagen der Reprogrammierung MPF: M-Phase Promoting Factor, bewirkt nuclear membrane beakdown (NEBD) und premature chromosome condensation (PCC) I. Wilmut, Nature Medicine 2002, 8, 215
10 Reprogrammierung Im Zytoplamsa der Eizelle sind RNA Moleküle und Proteine maternaler Herkunft, die die Entwicklung des Embroys steuern. Im den ersten Zellzyklen nach der Fusion erfolgt eine Remodellierung der Kern und Chromatinstruktur. Eine Stadienspezifische Kern- und Chromatinstruktur (DNA Methylierung, Histon Methylierung und Acetylierung) wird gebildet. Die Remodellierung bestimmt die Wirkung der Faktoren, die die Transkription des embryonalen Genoms bewirken. Der Zeitpunkt der Aktivierung des embryonalen Genoms ist für verschiedene Spezies unterschiedlich: Maus 2-Zell Stadium, Mensch 4- Zell Stadium, Schafe und Kühe 8- bis 16-Zell Stadium. Vermutlich ist daher das Klonieren von Schafen einfacher, da mehr Zeit für eine Repogrammierung zur erfügung steht. Klonierte Mäuse zeigen eher Abnormalitäten wie Übergewicht als z.b.klonierte Kühe. Vermutlich weichen fast alle Klone von einem normalen Embryo ab.
11 Die Telomere von Dolly sind verkürzt Telomerase arbeitet in der Keimbahn, nicht in somatischen Zellen Teleomere verkürzen sich; bei Schafen nach einem Jahr mit ca kbp pro Jahr. In Euter-Zellkultur wird eine Verkürzung von ca kbp pro Verdopplung beobachtet. Die Telomere der 1-jährigen Dolly entsprechen in ihrer Länge dem Alter des Spendertiers (6 Jahre) Die jährliche Verkürzung bei Dolly entspricht dem Durchschnitt. TRF: terminal restriction fragments Die Ursache der Verkürzung liegt vermutlich am alter des Spenders und der Zellkultur. Cloning 1999, 1, 119
12 Nuclear Transfer Embryonic Stem Cells ICM: inner cell mass TE: Trophectoderm Nature Genetics 2007, 39, 295
13 Die Überlebensrate von Zellen Nature Genetics 2007, 39, 295
14 rot: passive Demethylierung des maternalen Genoms. blau: aktive Demethylierung des paternalen Genoms. violett: methylierung nach Nuclear Transfer und hypermethylierung des TE. Methylierung
15 X Chromosom Inaktivierung (XCI) maternal X rot paternal X blau
16 Entwicklung von fetalen (fesc) und nucklear transfer (ntesc) embryoanlen Stammzellen
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