ZELLULARE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN DER FIBRÖSE NACH IONENBESTRAHLUNG

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1 ZELLULARE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN DER FIBRÖSE NACH IONENBESTRAHLUNG ' c Untersuchungen an Fibroblasten als in vitro-modell für gesundes Gewebe b dem Fachbereich Biologie der Technischen Universität Darmstadt zur Erlangung des akademischen, Grades eines Doctor rerum naturalium vorgelegte Dissertation von Claudia Fournier aus Weinheim/Bergstraße Technische Universität Darmstadt Berichterstatter: Prof. Dr. G. Kraft ^ ^ B ^ M o t hvk - G ' E Mitberichterstatter: Prof. Dr. K. Nixdorff schnittspihnwaße 10 Mitberichterstatter: Prof. Dr. P. Dancker D Darmstadt Mitberichterstatter: Prof. Dr. H.P. Rodemann lnv.-nr. Tag der Einreichung: 12. Mai 1999 Tag der mündlichen Prüfung: 8. Juli 1999 Darmstadt 1999 D 17

2 1. Zusammenfassung Einleitung Physikalische Eigenschaften von Strahlung Fibroblasten und extrazelluläre Matrix (ECM) Aufbau und Funktion der extrazellulären Matrix (ECM) : Das Fibroblasten/Fibrozyten-Zellsystem Strahlenbiologische Untersuchungen in vitro Zellzyklus-Verzögerung nach Bestrahlung * Zellinaktivierung Inaktivierung nach fraktionierter-bestrahlung Biologische Wirkung von Hoch-LET-Bestrahlung Die Relative Biologische Wirksamkeit.'...'' Fibröse - ein häufiger Spätschaden nach Bestrahlung Klinische Manifestation der Fibröse Fibröse als Folge der Interaktion verschiedener Zellsysteme Der molekulare Mechanismus von Fibröse: die besondere Rolle von TGFß.-..-.; Induktion des Zellzyklus-Arrestes durch TGFß Tumortherapie mit schweren Ionen 26 «z 1 -. ' 3. Problemstellung Material und Methoden... ^ Material.... : ; Zeil-Linien.... :....'...-. '.' Fibroblasten HeLa-Zellen...:...' Methoden......,..:... ; Sterilisation ; 'Zellkultur " Kultivierungsbedingungen...: Subkultivierung der Monoläyer-Kulturen Lahgzeitlagerung der Zellen Etablierung von Primärkulturen aus Explantaten Bestimmung der Wachstumskinetik Bestimmung der Koloniebildungsfähigkeit Mykoplasmentest Serumtest Bestrahlungsexperimente Bestrahlungseinrichtungen und Dosimetrie Bestrahlung der Zellen mit Röntgenstrahlen /3.3. Bestrahlung der Zellen mit Schwerionenstrahlen Inaktivierung und Bestimmung der relativen biologischen Wirksamkeit... /.....'.....'.' Bestimmung des Fraktionierungseffekts bei Zellüberleben... 42

3 Durchflußzytometrie (Zyklusphasen-Verteilung) Chromosomenpräparation und Färbung Chromosomenpräparation Färbung mit Giemsa G-Banding.., Premature Chromosome Condensation (PCC-Technik) Bestimmung des Differenzierungsmusters der Fibroblasten Bestimmung der Kollagen- und Gesamtproteinsynthese ELISA zur Bestimmung der TGFß 1-Proteinmenge Immun-Neutralisation von TGFß Cokultur von bestrahlten und unbestrahlten Fibroblasten Northernblot zum Nachweis von TGFß-mRNA (Fibroblasten) ;,.,...'.. so Westernblot zum Nachweis von P21 (Fibroblasten) Ergebnisse Charakterisierung der verwendeten Zeil-Linien , Mykoplasmen-Infektion Karyogramm der AG-Zellen Nachweis von Chromosomenaberrationen Wachstumskinetik.-, Koloniebildungsfähigkeit in Abhängigkeit von der Zelldichte Koloniebildungsfähigkeit im Langzeitversuch Differenzierungsmuster im Langzeitversuch Zellüberleben nach Bestrahlung,., Zellüberleben nach Röntgenbestrahlung Vergleich zwischen proliferierenden und kontaktinhibierten Kulturen Relative biologische Wirksamkeit und Wirkungsquerschnitt Zellüberleben nach fraktionierter Bestrahlung...; Bestrahlung in einem ausgedehnten Bragg-Peak..., Veränderungen des Differenzierungsmusters nach Bestrahlung 80 * Änderungen des Differenzierungsmusters in Abhängigkeit von der Strahlenqualität Veränderung des Differenzierungsmusters nach fraktionierter Bestrahlung Differenzierungsmuster von unbestrahlten Fibroblasten in Cokultur mit bestrahlten Fibroblasten Strahleninduzierte Änderung der Kollagen-Produktion bei Fibroblasten Kollagen-Produktion nach Bestrahlung mit Strahlenarten verschiedener Qualität Kollagen-Produktion im in viyro-langzeitversuch Kollagen-Produktion nach fraktionierter Bestrahlung Produktion und Sekretion von TGFß..,... k Abhängigkeit von der Zellkonzentration Abhängigkeit von der Zellzyklus-Phase.. 94

4 Abhängigkeit vom Serumgehalt des Kulturmediums TGFß-Produktion und -Sekretion nach Röntgenbestrahlung TGFß-Produktion und -Sekretion nach 195' MeV/u C-Ionen- Bestrahlung......: TGFß-Produktion und -Sekretion nach 11,0 MeV/u C-Ionen- Bestrahlung , TGFß-Produktion und -Sekretion im\in v/fro-langzeitversuch :.;... ~: Genexpression von TGFß nach C-Ionen-Bestrahlung Immun-Neutralisation von TGFß : Chromosomen-Analyse mittels PCC nach Immun-Neutralisation von TGFß.,, Untersuchungen mit Fibroblasten der Schweinehaut Überlebensexperimente nach in vzvro-bestrahlung von PSl-Zellen Vergleich der Protein-Produktion nach in vitro- und nach in vivo- Bestrahlung... ^...:.: Änderung des Differenzierungsmusters nach Bestrahlung Expression des Zellzyklus-Regulatorpröteins P21 nach Bestrahlung Einfluß des fötalen Kälberserums auf das Differenzierungsmuster und auf die Produktion von Kollagen und TGFß Einfluß auf die Entwicklung der Zellzahl nach Bestrahlung Abhängigkeit des Differenzierungsmusters von fötalem Kälberserum, Abhängigkeit der Kollagenproduktion von fötalem Kälberserum., Abhängigkeit der TGFß-Produktion von fötalem Kälberserum /..' Zusammenfassung Diskussion Grundlagen der Untersuchungen Charakterisierung der Zeil-Linien " Relative biologische Wirksamkeit und Fraktionierungseffekte bei Bestrahlung mit C-Ionen Strahlenarten Zellüberleben nach Röntgenbestrahlung Relative biologische Wirksamkeit von Kohlenstoff- und Nickel- Ionen-Strahlung Fraktionierungseffekte Bestrahlung'in einem ausgedehnten Bragg-Peak Zusammenfassung Strahleninduzierte Änderungen des Differenzierungsmusters von humanen Fibroblasten (AG-Zellen) Strahleninduzierte Steigerung der ECM-Proteinproduktion bei humanen Fibroblasten Strahleninduzierte Änderung des Differenzierungsmusters und der

5 Matrixprotein-Produktion bei Fibroblasten der Schweinehaut TGFß als Mediator der strahleninduzierten terminalen Differenzierung Immun-Neutralisation von TGFß : Einfluß von fötalem Kälberserum auf das Differenzierungsmuster, die Synthese von Matrixproteinen und die TGFß-Produktion von Fibroblasten..., Expression des Zellzyklus-Regulatorproteins P Zusammenfassung Ausblick 161 Literaturverzeichnis 162 Anhang A 176 Abkürzungsverzeichnis 176 Anhang B 177 Materialien 177 B.l. Medien und Seren für die Zellkultur 177 B.2. Chemikalien. 178 B.3. Lösungen und Puffer 180 B.4. Antikörper und Enzyme. 184 B.5. Nukleotide und Nukleinsäuren 185 B.6. Einwegmaterial und Geräte 185