Weitergabe genetischer Information: DNA-Replikation Beispiel: Escherichia coli.

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1 Weitergabe genetischer Information: DNA-Replikation Beispiel: Escherichia coli. zirkuläres bakterielles Chromosom Replikation (Erstellung einer identischen Kopie des genetischen Materials) MPM 1 DNA-Polymerasen in Escherichia coli Bezeichnung Aufbau Enzymatische Aktivitäten Funktion in der Zelle Moleküle/ Bakterienzelle DNA-Polymerase I (Pol I) DNA-Polymerase II (Pol II) DNA-Polymerase III (Pol III) DNA-Polymerase IV (DinB) DNA-Polymerase V UE: Untereinheit 1 UE, 103 kda DNA-Polymerase 3-5 -Exonuclease 5-3 -Exonuclease 1 UE, 90 kda DNA-Polymerase 3-5 -Exonuclease 3 UE, α: 130 kda ε: 27,5 kda θ: 10 kda DNA-Polymerase 3-5 -Exonuclease DNA-Reparatur 400 DNA-Reparatur, vor allem im Zuge der SOS-Antwort 40 DNA-Replikation UE, 40 kda DNA-Polymerase DNA-Reparatur, vor allem im Zuge der SOS-Antwort 3 UE, 2-mal UmuD 1-mal UmuC DNA-Polymerase MPM 3

2 DNA-Polymerase I Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I ( Die DNA-Polymerase I hat 3 enzymatische Aktivitäten: DNA-Polymerase Exonuclease Exonuclease MPM DNA-Polymerase Finger Daumen Handfläche MPM 5

3 5-3 -DNA-Polymerase Finger Daumen Handfläche MPM 6 DNA Polymerase Aktivität Stabilisierung des korrekt gepaarten Nucleotids durch Stapelwechselwirkung Matrize Primer MPM 7

4 3-5 -Exonuclease Proofreading MPM Exonuclease: Proofreading Aktivität Ein inkorrekte eingebautes Nucleotid verringert die Synthesegeschwindigkeit der Polymerase Bei einer Mispaarung werde die letzte 3-4 Basen ungepaart und haben eine erhöhte Affinität für das aktive Zentrum der Exonuclease Nach der Entfernung der fehlgepaarten Base bildet sich wieder ein korrekter Primer-Matrizen-Doppelstrang MPM 9

5 5-3 -Exonuclease MPM 10 Essentielle Faktoren der DNA-Replikation in E. coli DNA-Polymerasen III und I Primase DNA-Helikasen SSB (Einzelstrang-Bindeprotein) Topoisomerasen DNA-Ligase... mehrere weitere Faktoren MPM 11

6 Semikonservative Replikation DNA-Polymerase benötigt zur DNA-Synthese einen einzelsträngigen Matrizenstrang, der als Syntheseergebnis in dsdna überführt wird, sowie ein freies 3' Ende (Primer). Zirkuläre dsdna verfügt aber weder über ein freies 3' Ende, noch über Einzelstrangbereiche. Das Bakterielle Chromosom kann daher von der DNA- Polymerase allein nicht repliziert werden (eukaryotische Chromosomen auch nicht). Fragen: Wo beginnt die Replikation einer zirkulären DNA? Wie wird der Primer synthetisiert? Wie werden die komplementären Eltern-Stränge voneinander getrennt? MPM 12 Replikationsursprung Die Replikation beginnt am Replikationsursprung (Engl.: origin of replication: ori). Bei Eubakterien gibt es genau einen Origin pro Chromosom. Die Einleitung der Replikation am Origin wird Initiation genannt. Das zur DNA-Synthese benötigte freie 3' Ende wird durch die Primase als kurzes RNA-Stück synthetisiert, das wiederum durch die DNA-Polymerase III verlängert wird. Diese Verlängerung wird Elongation genannt. Der RNA-Primer wird später wieder entfernt. Es bilden sich zwei Replikationsgabeln, die sich vom Origin entfernen. Das Chromosom ist vollständig repliziert, wenn sich die Replikationsgabeln am Terminationspunkt wieder treffen. MPM 13

7 Replikationsursprung MPM 14 Entwindung von doppelsträngiger DNA MPM 15

8 Helikase DNA-Helikasen können einzelsträngige DNA binden, an ihr unter ATP-Verbrauch entlangwandern und dadurch dsdna entwinden. Je nach Entwindungs-Richtung lassen sich 5'-3' und 3'-5' Helikasen unterscheiden. Die für die Replikation entscheidende Helikase ist ein Homohexamer und wird DNA-B genannt DNA-B wird am Origin geladen und bewegt sich dann in 5'-3' Richtung. MPM 16 Nachweis von Helikaseaktivität 200 b radioaktive markierte DNA kochen ATP Helikase b ssdna-ring Schnitt der DNA kochen ATP Helikase b b + MPM 17

9 DNA-Helikase MPM 18 Entwinden der DNA SSB Die durch die DNA-Helikasen freigelegten Einzelstrangbereiche werden schließlich vom Einzelstrangbindeprotein SSB (single strand binding protein) stabilisiert. SSB bindet ssdna und verhindert die Paarung der komplementären Stränge solange, bis die DNA-Polymerase den Tochterstrang synthetisiert. MPM 19

10 Topologische Komplikationen bei der DNA-Replikation Replikation Trennung möglich? Nein. Die Stränge sind topologisch fixiert und können nur nach transienten Strangbrüchen voneinander getrennt werden. Topoisomerasen katalysieren eine solche Reaktion. MPM 20 Topoisomerase + MPM 21

11 Topoisomerase+ dsdna MPM 22 Topoisomerase+ dsdna MPM 23

12 MPM 24 Reaktionsmechanismus der Topoisomerase I Reaktionsmechanismus von Topoisomerase I: Das Enzym führt einen Einzelstrangbruch ein und bildet ein kovalentes Intermediat mit der neuentstandenen freien 5'-Phosphatgruppe. Die kovalente Protein-DNA-Bindung wird unter Rückbildung des Zucker-Phosphodiester-Rückgrates gelöst. MPM 25

13 Reaktionsmechanismus der Topoisomerase I... der transiente Strangbruch erlaubt ein "Durchfädeln" des nicht-unterbrochenen Stranges MPM 26 Das Problem, topologisch fixierte DNA-Stränge voneinander zu trennen, entsteht nicht erst im Anschluss an die Replikation, sondern muss schon bei der "Freilegung" der Einzelstränge gelöst werden. MPM 27

14 Der Versuch, DNA-Stränge in doppelhelikaler, zirkulärer DNA zu trennen, führt zu Torsionsspannungen, die die Replikationsgabel stoppen würden. Topoisomerasen werden daher nicht nur zur Trennung der vollständig replizierten DNA-Moleküle, sondern bereits für die Replikation selbst benötigt. MPM 28 Topologie der DNA "Relaxed Circle": Die Windungszahl entspricht der einer idealen Doppelhelix (10,4 Basenpaare pro Windung) "Supercoil": Die Windungszahl weicht von der einer idealen Doppelhelix ab und die zirkuläre DNA nimmt die Form einer Superhelix an. Die Zahl der Windungen der Superhelix entspricht der Differenz aus idealer und tatsächlicher Windungszahl. Negatives Supercoiling beschreibt "unterwundene" und positives "überwundene" DNA. MPM 29

15 Supercoiling aus elektronenmikroskopischer Perspektive MPM 30 Elektrophoretischer Nachweis von DNA-Topoisomerase I-Aktivität 0 relaxed 5 30 min Topo I - Laufrichtung neg. supercoiled + MPM 31

16 Negatives Supercoiling erleichtert die Trennung der DNA-Stränge und kann in einen "Relaxed Circle" nur unter Energieeinsatz durch die Gyrase (DNA-Topoisomerase II) eingefügt werde. MPM 32 Gyrase Topo I Während Topoisomerase I einen Einzelstrangbruch ausführt und ohne ATP-Hydrolyse auskommt, setzt die Gyrase (Topoisomerase II) einen Doppelstrangbruch und operiert unter ATP-Verbrauch. Gyrase kann superhelikale DNA nicht nur entspannen, sondern auch Spannungen ("negatives Supercoiling") einführen, die später die Trennung der Einzelstränge erleichtern. Gyrase kann darüberhinaus "Verknotungen" lösen, an denen Topo I scheitert (z.b. Catenane) MPM 33

17 Mechanismus von Topoisomerase II MPM 34