Kohlenwasserstoffe Früherkennung. und Langzeitbiomarker. Naturwissenschaften, der Universität Hamburg. vorgelegt von

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1 Intoxikation durch krebserzeugende halogenierte - Kohlenwasserstoffe Früherkennung und Langzeitbiomarker Dissertation Zur Erlangung der Würde des Doktors der Naturwissenschaften des Fachbereichs Biologie, der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften, der Universität Hamburg vorgelegt von Stefan Kloth aus Neubrandenburg Hamburg, Februar 2013

2 Inhaltsverzeichnis [ 1 Einleitung Begasungsmitteleinsatz im internationalen Warenverkehr Begasungsmittel Brommethan Dichlorethan Dichlormethan Metabolismus halogenierter Kohlenwasserstoffe Möglichkeiten der Expositionserfassung Ambient-Monitoring Biomonitoring Expositions-Monitoring Effekt-Monitoring Hämoglobin-Addukte Oxidativer Stress und 8-OHdG Zirkulierende DNA Zielsetzung der Arbeit 16 2 Material und Methoden Material I Laborgeräte Verbrauchsmaterialien (Glas- und Plastikmaterialien) Chemikalien und Reagenzien Puffer und Lösungen 20

3 II Inhaltsverzeichnis Oligonukleotidprimer Software Methoden Biochemische Methoden ELISA zur Konzentrationsbestimmung von 8-OHdG im Urin Molekularbiologische Methoden DNA-Gewinnung aus Serumproben Gewinnung von DNA aus Urinproben Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Validierung der Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Polymerasenkettenreaktion (PCR) Quantitative real-time PCR Analytische Bestimmung der Konzentration der Hämoglobin-Addukte Gewinnung des Erythrozytenhämolysates Isolierung des Globins Interner Standard Vergleichsstandards Herstellung des Kalibrierstandards Derivatisierung des Globins Gaschromatographisch-massenspektrometrische Arbeitsbedingungen Analytische Bestimmung der Hämoglobin-Addukte Kalibrierung Berechnung der Analyseergebnisse Validierung der Methode 43

4 Inhaltsverzeichnis III Nachweisgrenzen Bestimmung der Kreatinin-Konzentration im Urin Statistik 45 3 Ergebnisse Hämoglobin-Addukte Nachweis erhöhter MEV-Konzentrationen im Blut der Patienten Vergleichbare HEV-Konzentration im Blut der Patienten und Kontrollen Fallstudie eines 6 Personen-Kollektives mit wiederholter Begasungsmittel- Exposition Hydroxydesoxyguanosin (8-OHdG) Die 8-OHdG-Konzentrationen im Urin von P 1 ist im Vergleich zur Ko signifikant erniedrigt OHdG korreliert nicht mit der zirkulierenden oder mitochondrialen DNA im Serum und Urin Freie zirkulierende Gesamt-DNA Kein signifikanter Unterschied in der Konzentration freier zirkulierender DNA im Serum von Patientengruppen und Kontrollgruppe Kein signifikanter Unterschied in der Konzentration zirkulierender Gesamt- DNA im Urin zwischen Kontroll- und Patientengruppen Keine Korrelation der zirkulierenden Gesamt-DNA im Serum und Urin Analyse der freien zirkulierenden mitochondrialen DNA (mtdna) im Serum und Urin der Kontroll- und Patientengruppen Der relative Gehalt des 79 bp Fragmentes ist im Serum von P 1 und P 2 im Vergleich zur Ko erhöht 65

5 IV Inhaltsverzeichnis Kein signifikanter Unterschied im Gehalt der mtdna-230 im Serum zwischen Kontroll- und Patientengruppen Es gibt einen linearen Zusammenhang zwischen dem relativen Gehalt der mtdna-79 und der mtdna-230 im Serum Die zirkulierende Gesamt-DNA korreliert mit dem relativen Level der zirkulierenden mitochondrialen DNA im Serum der Patienten, nicht aber bei den Kontrollen Kein signifikanter Unterschied im mtdna-79-gehalt im Urin zwischen Patientengruppen und Kontrollkollektiv Kein signifikanter Unterschied der mtdna-230 im Urin zwischen Patientenund Kontrollgruppen Im Urin gibt es einen linearen Zusammenhang zwischen mtdna-79- und mtdna-230-fragment Keine Korrelation zwischen freier zirkulierender DNA und den mtdna- Fragmenten im Urin Keine Korrelation zwischen den mtdna-fragmenten im Serum und im Urin Bestimmung der Integrität der mtdna im Serum und Urin Signifikanter Unterschied in der Integrität der mtdna im Serum Signifikanter Unterschied in der Integrität der mtdna im Urin bei Kontrollund Patientengruppen Keine Korrelation der mtdna-integrität in Urin und Serum Ermittlung der Validität der Tests mit Hilfe von ROC-Kurven MEV ist ein valides Hämoglobin-Addukt für Nichtraucher und Raucher Die Integrität der mtdna im Serum ist ein valider Marker 84

6 Inhaltsverzeichnis V 4 Diskussion Hämoglobin-Addukte Oxidativer Stress und 8-OHdG Zirkulierende Gesamt-DNA im Serum und Urin Zirkulierende mitochondriale DNA im Serum und Urin 98 5 Zusammenfassung 103 Literaturverzeichnis 105 Anhang 120 Publikationsliste 124

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