Biochemische Übungen II Teil 3: Flow Cytometry/FACS. Dr. Richard Weiss

Transkript

1 Biochemische Übungen II Teil 3: Flow Cytometry/FACS Dr. Richard Weiss

2 A) Flow Cytometry

3 Durchflußzytometrie (flow cytometry) Ermöglicht die simultane Messung mehrerer physikalischer Charakteristika einzelner Partikel (in der Regel Zellen): Relative Zellgröße Granularität bzw. Interne Komplexität Relative Fluoreszenzintensität

4 Relative Zellgröße und Granularität Neutrophiler Granulozyt (~15µm) mittlere Granularität

5 Relative Zellgröße und Granularität Eosinophiler Granulozyt (~16µm) hohe Granularität

6 Relative Zellgröße und Granularität Basophiler Granulozyt (~14µm) sehr hohe Granularität

7 Relative Zellgröße und Granularität Lymphozyt (~12µm) keine Granula

8 Relative Zellgröße und Granularität Monozyt (~16-20µm) sehr feine Granula

9 Relative Fluoreszenzintensität A) Eigenfluoreszenz (z.b. Eosinophile, GFP) B) Färbung mit fluorochrom markierten Antikörpern

10 Relative Fluoreszenzintensität A) Eigenfluoreszenz (z.b. Eosinophile, GFP) B) Färbung mit fluorochrom markierten Antikörpern

11 Relative Fluoreszenzintensität A) Eigenfluoreszenz (z.b. Eosinophile, GFP) B) Färbung mit fluorochrom markierten Antikörpern

12 Haupt-Komponenten eines Durchflußzytometers Flüssigkeitssystem Transportiert die Zellen in einem Flüssigkeitsstrahl zum Meßpunkt, an dem der Laser auf die Zelle trifft Optik Ein oder mehrere Laser (488nm Argonlaser bei FACScan, BD) Linsen zur Fokussierung des Lasers Optische Spiegel und Filter, die die spezifischen Wellenlängen der emittierten Lichtsignale zu den entsprechenden optischen Detektoren leiten Elektronisches System Wandelt optische Signale (Photonen) in relative elektronische Signale um (Digitalisierung für Computeranalyse)

13 Flüssigkeitssystem Transport und Fokussierung der Zellen im Zentrum des Laserstrahls Nur eine Zelle pro Zeiteinheit darf den Laser passieren Probenflüssigkeit wird in einen Hüllstrom (sheath fluid) injiziert. Die sheath fluid reißt die Zellen im Probenstrom mit und fokussiert sie im Zentrum der Meßzelle = hydrodynamische Fokussierung Die Zellen werden in der Meßzelle nacheinander von dem Laserstrahl getroffen

14 Flüssigkeitssystem Druck Probenflüssigkeit > Druck Hüllstrom Durch Erhöhung des Drucks kommt es zu einer höheren Durchflußrate

15 Optik Argonlaser mit 488nm Wellenlänge ( blauer Laser ) Detektoren für Streulicht und Fluoreszenzen: Streulicht (Scatter) entsteht, wenn Partikel einfallendes Laserlicht beugen Forward-scatter (FSC) ist proportional der Zelloberfläche bzw. Zellgröße Side-scatter (SSC) entsteht an Grenzfächen in der Zelle mit einem geänderten Brechungsindex (Zellmembran, Zellkern, granuläres Material in der Zelle,...)

16 Optik Der SSC wird im 90 -Winkel zum einfallenden Laser detektiert.

17 Elektronisches System Die vom optischen System fokussierten und getrennten Lichtsignale treffen auf die Detektoren Erzeugen elektrische Signale proportional zur Intensität des einfallenden Lichts Die elektrischen Signale werden entweder linear (Scatter) oder logarithmisch (Fluoreszenzen) verstärkt und über einen Analog/Digital-Wandler in digitale Signale umgewandelt, die am Computer weiterverarbeitet werden

18 Schematischer Überblick

19 Analyse aus Blut Bereits durch die Analyse von FSC und SSC ist es möglich, die Zell-Typen in einer heterogenen Zell- Population zu unterscheiden Auf diese Weise lassen sich etwa Leukozytenpopulationen, wie Eosinophile, Neutrophile, Monocyten und Lymphocyten z.b. aus Blut differenzieren

20 Analyse aus Blut lysed whole blood (mouse) Neutrophile Lymphozyten SSC FSC Eosinophile Monozyten

21 CD Antigene Die Klassifizierung weiterer Untergruppen, wie z.b. die Einteilung der Lymphozyten in B-Zellen und T-Zellen erfolgt über die Analyse der Expression bestimmter Oberflächenantigene, den sogenannten CD-Antigenen Diese Sub-Klassifizierung erfolgt über die Bindung von fluoreszenz markierten monoklonalen Antikörper an spezifische CD-Antigene = Immunphänotypisierung

22 CD Antigene Ausgewählte CD-Antigene von Maus und Mensch CD3 T-Zellen assoziiert mit dem Antigenrezeptor von T-Zellen CD4 T Helferzellen Co-Rezeptor für MHC class II Monocyten Moleküle, Rezeptor für gp120 von Makrophagen HIV-1 und HIV-2 CD8 cytotoxische T Zellen Co-Rezeptor für MHC class I CD45 alle hämatopoetischen Tyrosinphosphatase Zellen CD45R/ B-Zellen Isoform von CD45 B220

23 Fluorochrome Absorbieren Licht einer für den Farbstoff charakteristischen Wellenlänge (Absorptions-Spektrum) Elektronen werden dadurch auf ein höheres Energieniveau angehoben Wenn die Elektronen auf das energetische Grundniveau zurückfallen, emittieren sie Licht-Photonen einer höheren Wellenlänge (Emissions-Spektrum) Da unser Flow-Cytometer nur einen Argon-Laser besitzt, können nur Farbstoffe verwendet werden, die bei 488nm absorbieren

24 Emissions-/Adsorption-Spektren Beim Vergleich der Emissionen wird deutlich, daß sich die Spektren der einzelnen Fluorochrome überlappen. Um die Fluoreszenzsignale dennoch den verschiedenen Fluorochromen zuordnen zu können, befinden sich optische Filter vor den einzelnen Detektoren. Der grau schraffierte Bereich kennzeichnet gewöhnlich verwendete Bandpass-Filter.

25 Verwendete Filter Longpass/Shortpass-Filter (LP bzw. SP) Leiten Licht einer Wellenlänge weiter, die über (LP) bzw. unter (SP) dem angegebenen Wert auf dem Filter liegt Bandpass-Filter (BP) Der erste Wert gibt diejenige Wellenlänge an. Die zu 100% den Filter passiert Der zweite Wert gibt die Bandbreite an (50% Transmission) Ein BP-Filter transmittiert also Licht einer Wellenlänge von nm zu50% mit einer maximalen Transmission bei 530nm (100%) Dichroitische Spiegel werden eingesetzt, um Licht zusätzlich zu reflektieren

26 Schematischer Überblick

27 Kompensation Da optische Filter nicht alle spektralen Überschneidungen der einzelnen Fluorochrome beseitigen können, ist eine elektronische Subtraktion, die sogenannte spektrale Kompensation nötig, um diese Fluoreszenzen zu entfernen Falsche Kompensation führt zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen!

28 Kompensation Durchflußzytometische Messung von FITC- und PE-marierten Beads (ohne Kompensation). Die FITC Emission ist auch bei derjenigen Wellenlänge hoch, bei der das PE-Signal gemessen wird. Deshalb erscheinen die FITC-beads als falsch positiv für eine PE-Markierung

29 Kompensation Durchflußzytometische Messung von FITC- und PE-marierten Beads (mit Kompensation). Durch die elektronische Kompensation erscheinen die PEmarkierten beads nur als PEpositiv und die FITC-markierten beads als nur FITC-positiv.

30 B) FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

31 FACS Ultraschall-Generator zerlegt Zellsuspension am Ausgang der Düse in einzelne Tröpfchen (nur eine Zelle pro Tropfen) Bevor die Suspension die Düse erreicht, wird der Fluoreszenztest gemacht

32 FACS Wenn eine Fluorochrom-haltige Zelle das Messfenster passiert, gelangt ein Fluoreszenzsignal zu den Lichtdetektoren (Photomultiplier tubes, PMT) und das Gerät sorgt dafür, daß der Tropfen, der die fluoreszierende Zelle enthält, eine elektrische Ladung erhält Markierte Zellen reisen also in geladenen Tropfen, unmarkierte Zellen aber in ungeladenen Tropfen durch das Gerät, so daß nur die ersteren im elektrischen Feld zwischen den Ablenkplatten eine Änderung der Fallrichtung erfahren.

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34 FACS Wird heutzutage nur mehr bei komplizierteren Sortiervorgängen eingesetzt (2 oder mehr Sort- Parameter) Bei einfachen Reinigungen und wenn große Mengen an Zellen gereinigt werden müssen ist MACS effizienter

35 C) Praktikumsbeispiel

36 Reinigung von Leukocyten aus Mausblut BLUT (2-3ml) Plasma 56% Zellul. Bestandteile 44% Fibrinogen Serum Thrombozyten /µl Leukozyten /µl Erythrozyten 6-12 Mio/µl Granulozyten Monozyten Lymphocyten 10-60% 0-3% 35-90% Eosinophile 0-7% Neutrophile 10-60% Basophile 0-1% B-Zellen T-Zellen

37 Reinigung von Leukocyten aus Mausblut

38 Reinigung von Leukocyten aus Mausblut Probe: 150µl Mausblut versetzt mit 10mM EDTA Für die FACS Auswertung müssen zuerst die Erythrocyten aus der Blutprobe entfernt werden: Osmotischer Schock (z.b. ACK-Puffer, FACS-Lyse,...) Reinigung der Lymphocyten über isopyknische Zentrifugation (Sucrosegradient, z.b. Ficoll)

39 Ficoll Reinigung Ficoll ist ein ungeladenes Sucrose-Polymer, dessen Dichte so eingestellt ist, daß Erythrozytenaggregate und tote Zellen die Ficollschicht passieren. Granulozyten dringen in die Ficollphase ein, während Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten sich in der Interphase ansammeln durch eine isopyknische Zentrifugation werden Periphere mononukleare Zellen (B-Zellen, Monozyten, NK-Zellen, T-Zellen, Thrombozyten) von Erythrozyten, Granulozyten und toten Zellen getrennt Nach Zentrifugation wird die Interphase abgenommen und dreimal mit FACS Buffer (PBS, 1% BSA, 2mM EDTA) gewaschen und in FACS Buffer gelöst

40 Ficoll Reinigung

41 Färbung der Proben für das FACS Aus den Blutproben soll die Anzahl der T- und B- Zellen bestimmt werden, sowie die T-Zellen in CD4 und CD8 Zellen typisiert werden: anti-cd3-fitc, anti-cd19-pe Doppelfärbung anti-cd4-fitc, anti-cd8-pe Doppelfärbung

42 Histologische Färbung Zusätzlich soll ein Teil der Probe zur Veranschaulichung histologisch gefärbt werden (Panoptische Färbung nach Pappenheim) Dazu wird ein Cytospin angefertigt

43 FACS-Auswertung

44 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut Ungefärbte Probe Einstellen der Detektoren

45 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut Ungefärbte Probe Einstellen der Detektoren Erhöhung der Spannung auf dem FSC und SSC Detektor

46 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut Ungefärbte Probe Einstellen der Detektoren Erhöhung der Spannung auf den FL1 und FL2 Detektoren

47 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut CD3-FITC gefärbte Probe Einstellen der Kompensation

48 Spectral overlap

49 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut CD3-FITC gefärbte Probe Einstellen der Kompensation Das auf FL2 überstrahlende Signal von FL1 wird abgezogen

50 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut CD19-PE gefärbte Probe Einstellen der Kompensation

51 Spectral overlap

52 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut CD19 gefärbte Probe Einstellen der Kompensation Das auf FL1 überstrahlende Signal von FL2 wird abgezogen

53 Beispiel 1: Lysiertes Mausblut CD3-FITC/CD19-PE doppeltgefärbte Probe, kompensiert.

54 Auswertungsbeispiel Ficoll Leukozytenprep Verunreinigung mit Granulozyten Verunreinigung mit Monozyten Erys, Debris Lymphocyten Lymphoblasten

55 Auswertungsbeispiel Ficoll Leukozytenprep 11.02% 14.44% 0.35% 0.46% 19.13% 25.07% 60.02% 45.80% Region Gate setzen markieren