Regulation der Expression, Funktion und Internalisierung von muscarinischen Acetylcholinrezeptoren

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1 00G Regulation der Expression, Funktion und Internalisierung von muscarinischen Acetylcholinrezeptoren INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde im Fachbereich Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von * WOLFGANG LENZ aus Traben-Trarbach Berlin 1995

2 i 1. Verwendete Abkürzungen 1 2. Zusammenfassung 4 3. Einleitung Signalübertragung G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Signaltransduktion durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Familie und Struktur heterotrimerer G-Proteine Funktionsweise der G-Proteine Acetylcholinrezeptoren Muscarinische Acetylcholinrezeptoren Bedeutung der machr für den Organismus Reinigung und Klonierung der Muscarinrezeptoren Funktion und Verteilung der Muscarinrezeptor-Subtypen Strukturvergleich der Muscarinrezeptor-Subtypen Desensibüisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren Fragestellung Material und Methoden Material Chemikalien Radioaktive Chemikalien Enzyme Methoden machr-ligandbindungsversuche 39

3 [ 3 H]-QNB-Bindungsassay an Membranhomogenaten [ 3 H]-QNB-Sättigungsversuche zur Bestimmung der Rezeptoraffinität für[ 3 H]-QNB [ 3 H]-QNB-Carbachol-Kompetitionsversuche [ 3 H]-NMS-Bindungsassay an intakten Zellen Bestimmung der subzellulären Verteilung der machr Proteinbestimmung von Membranproteinen Zellkultur Messung der machr-mrna durch Lösungshybridisierung Isolation von RNA aus Zellkulturen Bestimmung der RNA-Konzentration Synthese der RNA-Sonden Reinigung der RNA-Sonden RNA/RNA-Lösungshybridisierungsassay RNase-Protektionsanalyse auf Harnstoff/Polyacrylamidgelen Untersuchung der machr-mrna durch Northern-Analyse Isolation von Poly(A) + RNA Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese Northern Blot Synthese der DNA-Sonde durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Northern-Hybridisierung Autoradiographie Messung der [ 3 H]-Uridin- und [ 3 H]-Leucin-Inkorporierung Messung der machr-vermittelten Hemmung der durch Forskolin stimulierten camp-akkumulation in intakten Zellen Bestimmung der Rezeptor-stimulierten GTP-Hydrolyse Membranpräparation für GTPase-Assay Bestimmung der GTPase-Aktivität Bestimmung der machr-vermittelten Phospholipase C-Stimulation Bestimmung der Aktivität der Proteinkinase A (PKA) Präparation von DNA Bakterienkultur 67

4 Reinigung und Präzipitation von DNA Reinigung von synthetischen Oligonucleotiden Bestimmung der DNA-Konzentration Präparation von Plasmid-DNA aus 1-2 ml Bakterienkulturen Präparation von Plasmid-DNA aus ml Bakterienkulturen Präparation von Plasmid-DNA aus 500 ml Bakterienkulturen Präparation der einzelsträngigen Form der M13-Bakteriophagen-DNA Manipulation von DNA Restriktionsenzymbehandlung von DNA AufiüllreaktionvonDNA-5-Überhangenden Phosphorylierung von synthetischen DNA-Linkern DephosphorylierungvonDNA-5-Phosphatenden Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Ligation, Analyse von DNA und RNA Agarosegelelektrophorese Polyacrylamidgelektrophorese Sequenzierung von DNA Einfuhren von DNA in Bakterienzellen Herstellung kompetenter Bakterien Transformation kompetenter Bakterien Vektor-Konstruktion und Expression des WT- und der mutierten machr in CHO-Zellen Vektor-Konstruktion durch Deletionsmutagenese Vektor-Konstruktion mit Hilfe gerichteter Mutagenese Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen Isolation einzelner G418-resistenterZellklone Permeabilisierung von MDCK-Zellen mit Streptolysin GTP[yS]-Bindungsassay Präparation von Cytosol aus Rattenhirn 89 III

5 5. Ergebnisse Downregulation der m4-muscarinrezeptoren in N1E-115 und AtT-20-Zellen Beteiligung der Rezeptor-Internalisierung an der Desensibilisierung von m4-muscarinrezeptoren Rolle der Rezeptor-G-Protein-Interaktion für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren Internalisierung von Muscarinrezeptoren in permeabilisierten MDCK-Zellen Bedeutung Membran-proximal lokalisierter Threonin-Reste für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren Diskussion Regulation der durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vermittelten Signaltransduktion r Regulation der Muscarinrezeptor-Genexpression in N1E-115 und AtT-20-Zellen Beteiligung der Rezeptor-Internalisierung an der Desensibilisierung von Muscarinrezeptoren Rolle der Aktivierung heterotrimerer G-Proteine für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren Internalisierung von Muscarinrezeptoren in permeabilisierten MDCK-Zellen > Bedeutung Membran-proximal lokalisierter Threonin-Reste für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren Bedeutung und Regulation der Downregulation und Internalisierung von Muscarinrezeptoren 165 IV

6 7. Literaturverzeichnis 167 Abstract 183 Eigene Publikationen 184 Lebenslauf 186