Novel functions of the Nrf3 transcription factor in keratinocytes

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1 Diss. ETH No Novel functions of the Nrf3 transcription factor in keratinocytes A dissertation submitted to the ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences Presented by CLAUDIA DEFILA FLÜKIGER Dipl. Natw. ETH Zurich, Switzerland born on April 5 th, 1975 citizen of Sent GR and Dürrenroth BE, Switzerland Accepted on recommendation of Prof. Dr. Sabine Werner, examiner Prof. Dr. Ulrike Kutay, co-examiner Dr. Richard Grose, co-examiner 2012

2 Zusammenfassung Die Familie der Nrf Transkriptionsfaktoren spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Genen, die für antioxidative Proteine und detoxifizierende Enzyme kodieren. Im Gegensatz zum sehr intensiv untersuchten Familienmitglied Nrf2, welches eine wichtige Funktion bei der Erhaltung der zellulären Redoxhomöostase ausübt, ist nur sehr wenig über Nrf3 bekannt. In unserem Labor wurde bereits gezeigt, dass Nrf3 in Maushaut sowie in kultivierten Keratinozyten exprimiert wird, und dass dessen Expression während des Wundheilungsprozesses ansteigt. Da das Ausschalten von Nrf3 in Mäusen zu keinem offensichtlichen Phänotypen führte und wir in Nrf3 Knockoutmäusen keine Abnormitäten im Aufbau der Haut oder in der Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten nachweisen konnten, nahmen wir an, dass Nrf3 nur unter Stressbedingungen benötigt wird. Daher war das Ziel meiner Doktorarbeit, die Funktion von Nrf3 mit Hilfe von Nrf3- Knockoutmäusen und kultivierten Keratinozyten dieser Mäuse nach UV- Bestrahlung und Verwundung zu untersuchen. Ein weiteres Ziel war es herauszufinden, ob und - wenn ja - wie Nrf3 in diesen Stresssituationen aktiviert wird. Wir konnten zeigen, dass UVB-Bestrahlung von Keratinozyten die Translokation von Nrf3 vom endoplasmatischen Retikulum in den Zellkern induziert und dass die durch UVB verursachte Erhöhung der Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies dabei von Bedeutung ist. Diese Translokation in den Kern scheint biologische Konsequenzen zu haben, denn Keratinozyten, die aus Nrf3 Knockoutmäusen isoliert wurden und daher kein Nrf3 exprimieren, waren nach Bestrahlung mit UVB besser gegen Apoptose geschützt als Zellen von Wildtyp-Mäusen. Dies konnten wir in in vivo sowie in Zellkultur nachweisen. Interessanterweise zeigte sich, dass der Effekt von Nrf3 auf die UV-induzierte Apoptose nicht auf einen Antagonismus der Nrf2- Funktion zurückzuführen ist, sondern auf einer Erhöhung der Menge an p63 beruht. p63 gehört zur Familie der p53-transkriptionsfaktoren und spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung mehrschichtiger Epithelien. Mittels Knockdown-Experimenten in kultivierten Keratinozyten

3 konnten wir zeigen, dass die durch die Reduktion der Nrf3 Expression verursachte Hemmung der UVB-induzierten Apoptose durch gleichzeitige Reduktion der p63 Expression aufgehoben wurde. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit stand die Rolle von Nrf3 bei der Keratinozytenmigration und -adhäsion im Vordergrund. Wir konnten zeigen, dass das Fehlen von Nrf3 zu verbesserter Haftung von Keratinozyten an verschiedene Substrate führt und die Migrationsgeschwindigkeit erhöht wird. Der gegenteilige Effekt wurde in kultivierten Keratinozyten von transgenen Mäusen beobachtet, welche eine konstitutiv aktive Nrf3 Mutante exprimieren: Diese Zellen zeigten eine reduzierte Adhäsion und die Migrationsgeschwindigkeit war reduziert. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Migrationsfähigkeit von Keratinozyten tatsächlich von der Menge an funktionellem Nrf3 abhängig ist. Die in vivo Relevanz dieser Befunde wurde durch Wundheilungsexperimente dokumentiert, bei denen eine beschleunigte Heilung in Nrf3-defizienten Mäusen nachgewiesen wurde. Die Resultate meiner Doktorarbeit zeigen erstmals eine Rolle von Nrf3 bei der UVB-Antwort der Haut sowie bei der Migration und Adhäsion von Keratinozyten in vivo und in vitro. Zudem wurde ein bisher nicht gezeigter Zusammenhang zwischen Nrf3 und p63 nachgewiesen.

4 Summary The family of Nrf transcription factors plays an important role in the regulation of genes encoding antioxidant proteins and detoxifying enzymes. In contrast to the thoroughly investigated Nrf2 transcription factor, one of the key regulators of the cellular antioxidant defence, little is known about the regulation and function of Nrf3. Our laboratory previously showed that Nrf3 is expressed in mouse skin as well as in cultured keratinocytes and that its expression increases in keratinocytes upon wounding. These findings indicated a function of Nrf3 in the skin. However, ablation of Nrf3 in mice revealed no obvious phenotype. In particular, we could not observe any alterations in skin architecture or in keratinocyte proliferation or differentiation. This suggested that expression of Nrf3 in keratinocytes is only important under stress conditions. Therefore, it was the goal of this thesis project to identify the functions of Nrf3 in UV-irradiated and wounded skin using Nrf3 loss-of-function studies in vitro and in vivo. A second goal was to determine whether and how Nrf3 gets activated under these conditions. We found that UVB irradiation induces translocation of Nrf3 from the endoplasmic reticulum to the nucleus, which is mediated through an UVBinduced increase in intracellular reactive oxygen species. The nuclear translocation is likely to be functionally important, as keratinocytes from Nrf3 knockout mice were protected from UVB-induced apoptosis in vitro and in vivo. This finding indicates that endogenous Nrf3 increases the susceptibility of keratinocytes to UVB-induced apoptosis. Interestingly, this activity is not mediated via Nrf2 antagonism, but rather through regulation of p63, a member of the family of p53 transcription factors with important functions in development and maintenance of stratified epithelia. Results obtained by knockdown experiments in cultured human keratinocytes support this hypothesis, since the UVB-protective effect associated with the reduction in Nrf3 expression was abolished by concomitant reduction of p63 expression levels.

5 In a second part of my project I focussed on the role of Nrf3 in keratinocyte migration and adhesion. We showed that loss of Nrf3 improves adhesion to various substrates and enhances velocity of cultured keratinocytes, whereas keratinocytes isolated from transgenic mice expressing a constitutively active Nrf3 mutant showed impaired adhesion and migration. These findings strongly suggest that the migratory capability of keratinocytes depends on the levels of active Nrf3. The enhanced adhesion and migratory capacity of Nrf3-deficient keratinocytes is functionally important in vivo, since Nrf3 knockout mice showed accelerated wound closure as compared to their wild-type littermates. The results of this thesis revealed novel roles of Nrf3 in the UVB response and in adhesion and migration of keratinocytes in vitro and in vivo and identified a novel crosstalk between Nrf3 and p63.