Immunologische Methoden. 31. Oktober 2013, Ruhr-Universität Bochum Karin Peters,

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1 Immunologische Methoden 31. Oktober 2013, Ruhr-Universität Bochum Karin Peters,

2 Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten

3 Charakterisierung von Antikörpern Spezifität: Erkennt der Antikörper nur ein spezifisches Epitop? Affinität: Avidität: Isotyp: Bindungsstärke eines Antikörpers an eine einzige Antigenbindungsstelle Gesamte Bindungsstärke mit mehr als einer Bindungsstelle IgG, IgM, IgE, IgA und IgD definiert durch die konstante Region des Antikörpers Idiotyp: Antikörper mit der gleichen Spezifität

4 Herstellung von Antikörpern: Eigenschaften des Antigens

5 Herstellung polyklonaler Antikörper Tag Immunisierung mit 0,5mg Peptid konjugiert an KLH subcutan mit Freudschem Adjuvanz Blutentnahme

6 Herstellung monoklonaler Antikörper HGPRT=Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase HAT-Medium=Hypoxanthin, Aminpterin, Thymidin

7 HAT-Medium Aminopterin: Hypoxantin: Thymidin: blockiert den de novo Syntheseweg für Purine und Thymidin Abbauprodukt aus dem Purinstoffwechsel, kann über den salvage-pathway zur Purinsynthese eingesetzt werden mittels HPGRT muss zugeführt werden, da die Synthese durch Aminopterin blockiert ist

8 Heidelberger Präzipitationstest Prinzip: Die gleiche Menge Antikörper wird mit steigender Antigenkonzentration inkubiert

9 Immunpräzipitate Klinische Relevanz: Immunekomplexe lagern sich in Gefäßwänden und Organen ab z. B. Lupus erythematodes: Immunkomplexe lagern sich in den Glomeruli ab und aktivieren das Komplementsystem

10 Hämagglutination und Blutgruppenbestimmung

11 Coombs-Test

12 Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten

13 ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

14 Indirekter ELISA 1) Beschichtung mit dem Antigen Blockierung freier Bindungsstellen 2) Bindung eines spezifischen Antikörpers 3) Bindung eines enzymgekoppelten Zweitantikörpers 4) Substrat Farbiges Produkt 5) Messung der Absorbtion

15 Beispiel 1: Detektion von Allergen spezifischem IgE Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Antigen (Spezifisches Allergen) + Serum-IgE + Detektionsantikörper (IgG-Anti-IgE) + Substrat

16 Beispiel 2: Messung von IgE mittels Sandwich ELISA Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Fänger-Antikörper (IgG-Anti-IgE) + Serum-IgE + Detektionsantikörper (IgG-Anti-IgE) + Substrat

17 Kompetitions-ELISA

18 Western Blot (Immunoblot)

19 H.R. Gelderblom Robert-Koch-Institut, Berlin HIV-Nachweis durch Western Blot

20 Nachweis von Antikörperreaktionen durch Luminiszenz HRP: horseradish peroxidase Western-Blot

21 Fluoreszenz λ=488 nm Laser Fluorochrome Antibody λ=530 nm Emission Photodetector Fluorochromes Excitation (nm) Emission (nm)

22 Immunfluoreszenz Nachweis von Antigenen auf Zellen oder Gewebe mittels Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind Macrophagen (grün) in der roten Pulp der Milz

23 Wofür wird die Immunfluoreszenz verwendet? In der Medizin: Nachweis von Autoantikörpern In der Biologie: Nachweis bestimmter Zelltypen im Gewebe Lokalisation von Proteinen in der Zelle

24 Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten

25 Isolierung mononukleärer Zellen (Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation) Verdünntes Blut Ficoll (Density = 1,078) Zentrifugation Thrombozyten Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) Erythrozyten Granulozyten Zellkultur in vitro

26 Durchflusszytometrie

27 Zelluläre Parameter Laser (488 nm) Forward scatter (FSC) Cell size Side scatter (SSC) granularity

28 Messung der Lichtstreuung 1) Größe: Die Stärke des Vorwärtsstreulichts (FSC) ist proportional zur Zellgröe. 2) Granularität: Zellen ohne Granula induzieren nur geringes Seitwärtsstreulicht (SSC)

29 Messung der Lichtstreuung Das gemessene FSC und SSC wird für jede Zelle in einem x/y Diagramm = dot plot dargestellt 1) Granulozyten 2) Monozyten 3) Lymphozyten 2-Parameter dot plot

30 Fluoreszenzmessung mit dem Durchflusszytometer Analyse von Lymphozyten- Subpopulationen Problem: Lymphozyten können nicht anhand ihres Streulichts unterschieden werden Daher müssen sie mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert werden: z. B. Fluorescein anti-cd3 für T-Zellen Phycoerythrin anti-cd19 für B-Zellen

31 Ergebnisanalyse Für jede Zelle wurden fünf Parameter gespeichert: FSC SSC 1.) Fluoreszenz (grün) 2.) Fluoreszenz (orange) 3.) Fluoreszenz (rot) B-Lymphozyten T-Lymphozyten Auswahl der Zellen entsprechend ihrer spezifischen FSC/SSC Characteristika = gating

32 Leukämie Healthy control

33 HIV-Infektion Healthy control Patient shows reduced numbers of T-helper-cell in peripher blood

34 Intrazelluläre Zytokinfärbung Kultivierung von T-Helfer-Zellen unter verschiedenen Bedingungen Zugabe von Brefeldin A: hemmt die Zytokinsekretion Fixierung in Formaldehyd Permeabilisierung mit Saponin Färbung mit anti-ifn-γ-fluorescein und anti-il-4-phycoerythrin

35 Fluorescence assisted cell sorting FACS =Fluorescence Assisted Cell Sorting Jede Zelle befindet sich in einem einzelnen Tropfen. Jeder Tropfen erhält eine elektrische Ladung und wird mit Hilfe von Ablenkplatten sortiert. Ablenkplatten Sortierte Zellen Matthias Stiehm,

36 Magnetische Zellsortierung (MACS) Zellisolierung mit spezifischen Antikörpern, die an magnetische Partikel gebunden sind Prinzip: Anlegen eines Magnetfelds Zellen werden mit Antikörpern beladen, die magnetische Partikel tragen und auf eine Säule geladen Unmarkierte Zellen werden herausgewaschen Nach Entfernen des Magnetfelds werden die markierten Zellen eluiert

37 Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten

38 Nachweis einer Immunreaktion in vivo (Tuberkulosetest) Tine-Test Heute ersetzt durch den Mendel-Mantoux-Test, bei dem die Menge des injizieten Tuberculins genau festgelegt ist.

39 Antigenspezifische Th1-Zellen Typ-IV Reaktion (Hypersensitivitätsreaktion des verzögerten Typs) IFN-γ, Chemokine, TNF-α IFN-g IFNg-Receptor APC Lokale Entzündung

40 Elispot-Assay: erkennt Zytokin-produzierende Zellen in vitro

41 CFSE Assay zur Proliferationsmessung O CH 3 CH 3 O O O O OH O O O primäre Amine, Esterasen, ph>7 O OH O O N O O Protein NH O + N-Hydroxysuccinimid + 2 Moleküle Essigsäure Lymphozyten des menschlichen Blutes markiert mit CFSE Carboxyfluorescein Diacetatsuccinimidylester. Die Zellen wurden mit Phytohaemagglutinin stimuliert und 5 Tage inkubiert.