Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

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1 Aus dem Institut für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bermannsheil Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. K. M. Müller Myokardbiopsien nach Herztransplantation - immunhistochemische Befunde zur Expression von TNF-α, CMV und Ki-67 und ihre Beziehung zu klinischen Befunden - Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Alexandra Stephanie Hahn aus Würselen 2002

2 Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. med. G. Muhr Prof. Dr. med. K. M. Müller Tag der mündlichen Prüfung: 01. Juli 2003

3 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis...I Abkürzungsverzeichnis... IV 1. Einleitung Herztransplantation Geschichte der HTx Indikationen und postoperatives Management Komplikationen der Herztransplantation und deren Früherkennung Transplantatimmunologie Überwachung der Transplantatfunktion, hämodynamische Veränderungen nach Herztransplantation und Abstoßungsdiagnostik Veränderungen der Hämodynamik Cholesterinspiegel Akute-Phase-Proteine Endomyokardbiopsie Histomorphologische Untersuchung des Myokards und histopathologische Klassifikation der Abstoßungsreaktion Histologie des gesunden Herzens Histologie des Herzens nach Herztransplantation und Klassifikation der Abstoßungsreaktion TNF-α-Expression im Myokard Allgemeine Bemerkungen zu TNF-α TNF-α in Beziehung zur akuten Transplantatabstoßung CMV-Expression im Myokard Allgemeine Bemerkungen zu CMV CMV in Beziehung zur akuten Transplantatabstoßung Ki-67-Expression im Myokard Allgemeine Bemerkungen zu Ki Ki-67 in Beziehung zur akuten Transplantatabstoßung Ziel der Arbeit Material und Methoden Patienten und Untersuchungsmaterial Methoden: Histologische Präparate Histologische Aufbereitung der Präparate Immunhistochemische Aufbereitung der Präparate...22

4 II 2.3. Methoden: Klinische Werte Hämatologische und klinisch-chemische Analytik Klinische Untersuchung Statistische Auswertung Ergebnisse Immunhistochemische Untersuchungen TNF-α Immunhistochemischer Nachweis der TNF-α-Expression durch Kardiomyozyten und intramyokardiale Endothelzellen in Beziehung zur akuten Abstoßungsreaktion Immunhistochemischer Nachweis der TNF-α-Expression in Beziehung zu klinischen Parametern CMV Immunhistochemischer Nachweis der CMV-Expression durch Kardiomyozyten und intramyokardiale Endothelzellen Ki Immunhistochemischer Nachweis der Ki-67-Expression durch Kardiomyozyten und intramyokardiale Endothelzellen in Beziehung zur akuten Abstoßungsreaktion, den klinischen Parametern sowie den immunhistochemischen Befunden Klinische Parameter Hämodynamik: arterieller Mitteldruck (MAD) und Noradrenalin Akute-Phase-Proteine: CRP und Fibrinogen Cholesterinspiegel Cyclosporinspiegel Diskussion Immunhistochemische Befunde TNF-α Immunhistochemisch nachweisbare TNF-α-Expression durch Kardiomyozyten und intramyokardiale Endothelzellen in Beziehung zur akuten Abstoßungsreaktion Immunhistochemisch nachweisbare TNF-α-Expression in Beziehung zu klinischen Parametern CMV Immunhistochemisch nachweisbare CMV-Expression durch Kardiomyozyten und intramyokardiale Endothelzellen in Beziehung zur akuten Abstoßungsreaktion Immunhistochemisch nachweisbare CMV-Expression in Beziehung zu klinischen Parametern Ki

5 III Immunhistochmisch nachweisbare Ki-67-Expression in Kardiomyozyten und intramyokardialen Endothelzellen in Beziehung zur akuten Abstoßungsreaktion Immunhistochemisch nachweisbare Ki-67-Expression in Beziehung zu immunhistochemischen und klinischen Befunden Klinische Parameter Hämodynamik: arterieller Mitteldruck (MAD) und Noradrenalin Akute-Phase-Proteine: CRP und Fibrinogen Cholesterinspiegel Cyclosporinspiegel Zusammenfassung Anhang Literaturverzeichnis...78 Danksagung Lebenslauf...102

6 IV Abkürzungsverzeichnis A-P-P: Akute Phase Proteine ATG: Anti-Thymozytenglobulin camp: cyclisches Adenosinmonophosphat CMV: Cytomegalievirus CRP: C-reaktives Protein EBV: Ebstein-Barr-Virus EC: Endothelzellen EMB: Endomyokardbiopsie EvG: Elastica-van-Gieson HE: Hämatoxylin-Eosin HHV: Humanes Herpesvirus HTx: Herztransplantation HWZ: Halbwertszeit IFN: Interferon IL-2, -6, -n: Interleukin-2, -6, -n ISHLT: International Society of Heart and Lung Transplantation KHK: koronare Herzkrankheit KM: Kardiomyozyten MAD: mittlerer arterieller Druck MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex NYHA: New York Heart Association PCNA: proliferationsassoziiertes zelluläres nukleäres Antigen PCR: Polymerase-Kettenreaktion QE: Quilty Effect TNF-α: Tumor-Nekrose-Faktor-α TVP: Transplantatvaskulopathie

7 1 1. Einleitung 1.1. Herztransplantation Geschichte der HTx Seit 1967 die erste homologe orthotope Herztransplantation (HTx) von Christiaan Barnard in Kapstadt durchgeführt wurde (Barnard, 1967), hat sich diese Therapiemethode zur Behandlung therapieresistenter terminaler Herzinsuffizienz zu einem etablierten Verfahren entwickelt. Bisher wurden weltweit über Operationen durchgeführt (Deng et al., 2000). Die 1981 erfolgte Einführung des 1972 durch Borel entdeckten Cyclosporin A, ein von Tolyplocadium inflatum produziertes Polypeptid mit selektiv immunsuppressiver Wirkung durch Inhibition der Ausschüttung des T-Zellaktivators IL-2, konnte die Langzeitergebnisse der Herztransplantationen wesentlich verbessern, da nun sowohl die Abstoßungsreaktionen als auch die Komplikationen der Immunsuppression beherrschbarer wurden. Mittlerweile werden 1- Jahresüberlebensraten von 79%, 5-Jahresüberlebensraten von 65% und 10-Jahresüberlebensraten von 45% erreicht (Schütz, 1992; Hosenpud et al.,1998; Pethig et al., 2000) Indikationen und postoperatives Management Herztransplantationen werden hauptsächlich bei Patienten mit therapieresistenter terminaler Herzinsuffizienz infolge dilatativer Kardiomyopathie (50%) oder KHK im Endstadium (41%) durchgeführt, deren Lebenserwartung ein Jahr nicht überschreitet und die möglichst jünger als 60 Jahre alt sind (Struck et al.,1981). Postoperativ muss eine lebenslange immunsuppressive Therapie, meist als Dreierkombination von Cyclosporin A (Sandimmun ), Azathioprin (Imurek ) und Prednison (Decortin ), zur Prophylaxe von Abstoßungsreaktionen durchgeführt werden. In der frühen postoperativen Phase kommt zusätzlich das gegen T-Lymphozyten gerichtete Antithymozytenglobulin (ATG) zum Einsatz (Hetzer et al., 1985; Schäfers et al.,1987). Oftmals wird im ersten postoperativen Jahr eine Infektionsprophylaxe besonders gegen Cytomegalievirus in Form von Hyperimmunglobulin durchgeführt. Zusätzlich erfolgt ein regelmäßiges Screening zur frühzeitigen Diagnose von Infektionen in Form von klinische Parameter und Laborparameter umfassenden Nachsorgeuntersuchungen (z.b. Bestimmung der Akute-Phase-Proteine, Blutdruckmessungen, echokardiographische Untersuchungen) (Schäfers et al., 1987; Pethig et al., 2000).

8 2 Zur weiteren postoperativen Kontrolle gehören die zur Erkennung sowohl von Abstoßungsreaktionen als auch von Spätkomplikationen der Cyclosporintherapie, insbesondere der Myokardfibrose, regelmäßig durchgeführten Endomyokardbiopsien, die durch perkutanen, transvenösen Zugang in die Vena jugularis interna aus dem rechten Ventrikel gewonnen werden und histologisch untersucht werden (Caves et al., 1974; Billingham, 1981). In der Regel erfolgt die Probeentnahme während der ersten vier Wochen wöchentlich, anschließend drei Monate lang einmal im Monat, danach vierteljährlich. Nach Ablauf eines Jahres werden zweimal jährlich Biopsien entnommen, nach zwei Jahren jährlich. In einigen Transplantationszentren wird bereits die Beschränkung auf Biopsieentnahme lediglich bei klinischem Verdacht auf Abstoßung diskutiert (van Gelder et al., 1998) Komplikationen der Herztransplantation und deren Früherkennung Der positiven Entwicklung Rechnung tragend wurden Methoden zur Nachsorge nach HTx entwickelt. Dabei stand in der Frühphase die Erkennung von Infektionen und Abstoßungsreaktionen im Vordergrund, da diese die Prognose im ersten postoperativen Jahr maßgeblich bestimmten. 35% der Todesfälle im ersten Jahr nach HTx waren durch akute Abstoßungsreaktionen bedingt, während bei 41% der Patienten eine Infektion zum Tode führte (Schäfers et al., 1987). Die Infektionen waren am häufigsten bakteriellen Ursprungs. Zumeist handelte es sich um gramnegative Erreger und Staphylokokken. Aber auch virale Infektionen, darunter besonders die durch Cytomegalievirus (CMV) verursachten, führten zu schweren Krankheitserscheinungen mit z.t. letalem Ausgang (Schäfers et al., 1987). Zur frühzeitigen Erkennung von Infektionen dienen die regelmäßigen, klinische und Laborparameter umfassenden Nachsorgeuntersuchungen. Die Entnahme von Myokardbiopsien mit Hilfe des 1972 durch Caves und Schultz entwickelten Biotoms erlangte rasch einen übergeordneten Stellenwert zur Frühdiagnostik von Abstoßungsreaktionen (Caves et al., 1974; Billingham, 1981). Diese waren bis dahin nur anhand klinisch ermittelter Parameter diagnostiziert worden, wenn bereits signifikante Veränderungen der Herzfunktion und somit oft irreversible Schädigungen der Kardiozyten aufgetreten waren. Im weiteren Verlauf tritt, bedingt durch die verbesserten Langzeitüberlebensraten, die chronische Abstoßung, die durch vaskuläre Infiltrate und proliferierende Endovaskulopathie gekennzeichnet ist, in den Vordergrund. Hierbei sind insbesondere die Koronararterien von einer vergleichsweise

9 3 frühzeitig einsetzenden Artherosklerose betroffen. Innerhalb von drei Jahren entwickeln 30% der Patienten eine Transplantatvaskulopathie (Heublein et al., 1990). Zur Früherkennung dieser Transplantatvaskulopathie (TVP) werden jährlich Koronarangiographien durchgeführt, aber auch die Entnahme von Endomyokardbiopsien (EMB) und die Durchführung von Stressechokardiographien und intravaskulärem Ultraschall sind wichtige Bestandteile der regulären Nachsorgeuntersuchungen (Pethig et al., 2000). Weitere Spätkomplikationen stellen die Entwicklung von Niereninsuffizienz oder Hypertension unter Cyclosporin A-Therapie und das Auftreten von Malignomen im Rahmen der Immunsuppression, speziell unter ATG-Behandlung, dar (Schäfers et al., 1987; Heublein et al., 1990) Transplantatimmunologie Eine zentrale Rolle in der Transplantatimmunologie kommt den Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) zu, die der immunologischen Differenzierung von Geweben als fremd oder eigen dienen (Wiley, 1988; Ustinov et al., 1993). Grundsätzlich unterscheidet man zwei Subtypen. MHC-Klasse I-Moleküle kommen auf allen kernhaltigen Zellen vor und binden endogen synthetisierte Peptidantigene, die durch zytotoxische CD8-positiven T- Lymphozyten erkannt werden. MHC-Klasse II-Antigene werden zusammen mit Fragmenten des Peptidantigens auf der Zellmembran von antigenpräsentierenden Zellen (Makrophagen, Lymphozyten und Endothelzellen) exprimiert und reagieren mit CD4-positiven T-Helfer- Lymphozyten (Springer, 1990). Die akute Abstoßungsreaktion von Allotransplantaten, also von Organen zwischen genetisch unterschiedlichen Individuen derselben Spezies, gehört in den Formenkreis der Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ, die im wesentlichen über T-lymphozytäre Mechanismen vermittelt wird. Ausgelöst wird die Immunantwort durch Reaktion der T- Lymphozyten mit den auf dem Spenderorgan zusammen mit den Molekülen des MHC-Komplexes präsentierten Fremdantigenen (Schütz, 1992). Es kommt zu einer Vermehrung und Aktivierung von zytotoxischen, CD8-positiven Lymphozyten und Killerzellen, welche zusammen mit Zytokinen und sekundär gebildeten Antikörpern die Myozytolyse und den damit verbundenen Funktionsverlust des Transplantates bewirken (Sanderson, 1981; Woodley et al., 1991). Die Bindung der CD4-positiven T-Helfer-Lymphozyten an die durch die Endothelzellen des Transplantats exprimierten MHC-Klasse II-Antigene führt zur Aktivierung weiterer T-Helferzellen und konsekutiv zur vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen und Zytokinen sowie zur Aktivierung der zytoxischen T-Zellen und der Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten

10 4 (Dallmann et al., 1989; Zimmermann et al., 1992; Pfau und Bender, 1993). Diese Aktivierungsvorgänge werden entweder über direkten Zellkontakt oder über lösliche Mediatorsubstanzen wie Zytokine vermittelt. Des Weiteren führen die nach Transplantation erfolgenden Immunprozesse zur gesteigerten Expression von Klasse II-Antigenen auf den Endothelzellen des Allografts, welche eine permanente Stimulation von Empfängerlymphozyten hervorruft und so zur Erhaltung einer regionalen Immunantwort beiträgt (Salomon et al., 1991). Die Gefäßendothelzellen partizipieren noch über weitere Mechanismen am zur Abstoßung führenden Entzündungsprozess, welche alle der Regulation durch Zytokine wie Tumor-Nekrose- Faktor (TNF), Interferon-γ und Interleukine unterliegen. Durch Synthese und Sekretion vasodilatorischer Substanzen wie Prostazyklin und EDRF (endothelial-derived relaxing factor) kommt es zu einer gesteigerten regionalen Durchblutung und so zur Akkumulation von Leukozyten und Entzündungsmediatoren. Die vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen führt ebenso wie die Permeabilitätssteigerung zur verbesserten Adhäsion und Transmigration von Leukozyten (Pober und Cotran, 1990). Morphologisches Korrelat dieser Immunprozesse ist die akute Abstoßungsreaktion, die mit Ausbildung eines interstitiellen Ödems, mononukleären Infiltraten, interstitiellen Hämorrhagien und Myozytennekrosen einhergeht (Gerbaulet et al., 1998) Überwachung der Transplantatfunktion, hämodynamische Veränderungen nach Herztransplantation und Abstoßungsdiagnostik Der Überwachung der Transplantatfunktion anhand der regelmäßigen Untersuchung hämodynamischer und laborchemischer Parameter kommt bei der Nachsorge herztransplantierter Patienten eine große Bedeutung zu, insbesondere im Hinblick auf die die Transplantatfunktion gefährdenden akuten und chronischen Abstoßungsreaktionen. Hierbei werden verschiedene Faktoren als mögliche Marker für eine drohende Abstoßung diskutiert. Dazu gehören hämodynamische Parameter wie Blutdruck und Katecholaminkonzentration, metabolische Faktoren wie Cholesterinspiegel sowie die Akute-Phase-Proteine Veränderungen der Hämodynamik Veränderungen der Hämodynamik nach Herztransplantation sind in zahlreichen Studien beschrieben worden. So kommt es frühpostoperativ zu einem signifikanten Abfall des arteriellen Mitteldrucks, der mit einem erhöhten Katecholaminbedarf einhergeht (Dammenhyn et al., 1991). Bis zum vierten postoperativen Tag haben sich Blutdruck und Katecholaminbedarf wieder

11 5 normalisiert (Dammenhyn et al., 1991), um dann ab dem ersten Monat posttransplantionell signifikant anzusteigen (Baroud et al., 1996), so dass arterieller Mitteldruck (MAD) und Katecholaminspiegel bei herztransplantierten Patienten signifikant höher liegen als bei den Kontrollgruppen (Kao et al., 1994; Doering et al., 1996; Stanford et al., 1997 und 1999; Piquard et al., 2000). Über 90% der Patienten entwickeln im ersten postoperativen Jahr eine arterielle Hypertonie (Olivari et al., 1989; Bortolotto et al., 1997), die insbesondere den diastolischen Druck betrifft (Bracht et al., 1996). Die immunsuppressive Therapie mit Cyclosporin A und eine gesteigerte Aktivierung des Sympathikus, dessen wichtigste Wirksubstanzen die Katecholamine Adrenalin und Noradrenalin sind, werden als Ursachen diskutiert (Bracht et al., 1996; Ventura et al., 1997). Zusätzlich ist der fehlende physiologische nächtliche Abfall des Blutdrucks auffällig (Idema et al., 1994; Bracht et al., 1996). Des Weiteren wurde bei herztransplantierten Patienten eine schwerwiegende Einschränkung der Belastungstoleranz festgestellt, da weder Schlagvolumen noch arterieller Mitteldruck bei Belastung adäquat gesteigert werden können (Kao et al., 1994) bzw. die Aufrechterhaltung normaler Werte signifikant höhere Katecholaminkonzentrationen erfordert (Doering et al., 1996). Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass freie Sauerstoffradikale, die u.a. im Rahmen der akuten Abstoßungsreaktion von aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden, einen signifikanten Abfall des MAD induzieren (Rowe et al., 1984), so dass das Monitoring des systemischen Blutdrucks im Zusammenhang mit der Katecholaminkonzentration möglicherweise wichtige Hinweise auf die Transplantatfunktion und die Beeinträchtigung derselben durch Abstoßungsreaktionen liefern kann Cholesterinspiegel In zahlreichen Studien konnte ein Zusammenhang zwischen erhöhten Cholesterinspiegeln und Entwicklung bzw. Fortschreiten der als chronische Abstoßungsreaktion auftretenden Transplantatvaskulopathie beobachtet werden (Babir et al., 1991; Park et al., 1996; Parameshwar et al., 1996; Pethig et al., 2000; Perrault et al., 2000). Bei Kindern konnte im ersten Jahr nach der Transplantation ein Anstieg des Cholesterinspiegels um 17% beobachtet werden, der auch im weiteren Verlauf persistierte (Di Filippo, 2001). Auch beim Erwachsenen kommt es nach Herztransplantation zum signifikanten Anstieg des Cholesterinspiegels (Farmer et al., 1991; Grady et al., 1991; Gullestadt et al., 1997; De Nofrio et al., 2000). Im ersten postoperativen Jahr wurde eine Steigerung um bis zu 35% beobachtet (Keogh et al., 1988). Bellotti et al. (1996) berichteten von einer bis zum dritten Jahr progredient verlaufenden Erhöhung der Cholesterinwerte. Eine ursächliche Beziehung zwischen Hyperlipidämie und akuter Abstoßung wurde bei Nierentransplantationen gefunden (Kasiske, 1999), und bei herztransplantatierten Patienten als

12 6 wahrscheinlich angenommen (Heublein et al.,1990). Diese Vermutung wird unterstützt durch die am Tiermodell gewonnene Erkenntnis, dass die Hypercholesterinämie die Empfänglichkeit von Gewebe für entzündliche Prozesse erhöht (Cerwinka et al., 2001) Akute-Phase-Proteine Verschiedene Studien zeigten, dass C-reaktives Protein (CRP), ein in der Leber synthetisiertes Akute-Phase-Protein, welches innerhalb von sechs Stunden bei entzündlichen Prozessen, zu denen auch akute und chronische Abstoßungsreaktionen zählen, ansteigt, einen Platz im Monitoring nach Herztransplantation verdient. Eisenberg et al. (2000) beobachteten, dass erhöhte CRP-Werte einerseits mit höhergradigen Abstoßungsreaktionen korrelieren und andererseits einen Vorhersagewert für Transplantatversagen darstellen. Laut van Gelder et al. (1998) kann daher mittels CRP-Messung eine prognostische Aussage bezüglich des Therapieerfolges getroffen werden. Bei Nierentransplantationen erwies sich CRP als sensitiver Marker für die akute Transplantatabstoßung (Van Lente et al., 1986; Evévquoz et al., 1993), dem es allerdings an Spezifität mangelt, da es auch bei Infektionen ansteigt (Evévquoz et al., 1993; van Gelder et al., 1998). Die simultane Messung von CRP, Myeloperoxidase und α2-makroglobulin im Urin scheint zwar eine ausreichende Sensitivität und Spezifität im Rahmen der Nierentransplantatabstoßung zu besitzen, stellt sich aber als sehr kostenintensiv dar. Zudem fehlt bislang der Nachweis, dass diese Ergebnisse auf die Abstoßung von Herztransplantaten übertragen werden können (Steinhoff et al., 1997). Auch Fibrinogen, ein weiteres Akute-Phase-Protein, welches bei Entzündungsreaktionen innerhalb von h auf den 2-3fachen Wert ansteigen kann und zudem als Gerinnungsparameter (Faktor I der Gerinnungskaskade) bei der Bluthämostase mitwirkt, steigt allgemein nach Herztransplantation und insbesondere bei Abstoßungsreaktionen an (Hunt et al., 1993; Segal et al., 2001) Endomyokardbiopsie Den Goldstandard der Diagnostik von akuten Abstoßungsreaktionen stellt nach wie vor die histomorphologische Untersuchung von Endomyokardbiopsien dar (Billingham et al., 1985; Sibley et al., 1986; Schütz, 1992).

13 Histomorphologische Untersuchung des Myokards und histopathologische Klassifikation der Abstoßungsreaktion Histologie des gesunden Herzens Gesunde Kardiomyozyten bestehen aus ca. 50 µm langen, netzartig untereinander verzweigten Fasern mit einem, gelegentlich auch zwei, zentralen Zellkernen und quergestreiftem Zytoplasma. Die Zellkerne enthalten normalerweise ein Kernkörperchen (Nukleolus) und fein verteiltes Chromatin. Funktionell bilden die Herzmuskelzellen ein Synzytium, in dem die einzelnen Zellen über sogenannte Gap junktions untereinander verbunden sind. Eine Muskelfaser besteht aus ca Myofibrillen, die das morphologische Korrelat der lichtmikroskopisch erkennbaren Querstreifung darstellen, da sie sich in einfach lichtbrechende, isotrope I-Bänder und doppelt lichtbrechende, anisotrope A-Bänder unterteilen. Die kleinsten kontraktilen Einheiten setzen sich aus den Aktin- und Myosinfilamenten zusammen und werden durch die Z-Streifen in Sarkomere unterteilt. Interstitielles Bindegewebe ist nur in geringem Maße vorhanden. In diesem verlaufen die arteriellen und venösen Blutgefäße Histologie des Herzens nach Herztransplantation und Klassifikation der Abstoßungsreaktion Am transplantierten Herzen treten Veränderungen sowohl an der Textur des Herzgewebes als auch an den Kardiozyten selbst im Rahmen von Abstoßungsreaktionen, ischämischen Schädigungen, immunsuppressiver Therapie etc. auf. Kennzeichen der akuten Abstoßung sind das Myozytenödem, welches mit dem Schweregrad der akuten Abstoßungsreaktion korreliert (Schnabel et al.,1996), ein im Verlauf zunehmendes Ödem des Interstitiums und mononukleäre Zellinfiltration zunächst des Interstitiums und später auch des Parenchyms. Bei höhergradigen Abstoßungen treten regressive Veränderungen bis hin zu Kardiomyozytennekrosen auf (Gerbaulet et al., 1998). Im Langzeitverlauf kommt es kompensatorisch zu einer Hypertrophie der nicht geschädigten Kardiomyozyten (Myles et al., 1987; Rowan et al., 1990). Zur Beurteilung dieser histologischen Veränderungen haben sich im Laufe der Zeit weltweit verschiedene Klassifikationen entwickelt, welche die Abstoßungsreaktionen entweder qualitativ oder quantitativ erfassen und sich in deren Graduierung unterscheiden. Als allgemeine Grundlage aller Klassifikationen wird die Stanford-Klassifikation angesehen, die eine qualitative Aussage

14 8 über das Vorliegen einer milden, mittelgradigen oder schweren Abstoßung macht (Billingham, 1979). Später entwickelten sich daraus Klassifikationen, die unterschiedliche Graduierungsskalen benutzten, um Abstoßungsreaktionen quantitativ zu erfassen. Dazu gehört z.b. die Hannover- Klassifikation (Kemnitz et al., 1987), welche die akute Abstoßungsreaktion in 5 Schweregrade (Grad A0-A5) unterteilt (s. Tabelle 1.1, S.9). Als Grundlage für eine einheitliche Nomenklatur hat die International Society for Heart and Lung Transplantation die ISHLT-Klassifikation entwickelt, da man die Notwendigkeit erkannte, eine international vergleichbare Klassifikation zu schaffen (Billingham, 1990). Sie unterteilt die akute Abstoßung in die Kategorien 0, 1A, 1B, 2, 3A, 3B, 4 und 5 (s. Tabelle 1.1, S.9). Der Schweregrad 0 (Hannover- und ISHLT-Klassifikation) lässt histologisch keine Abstoßungsreaktion erkennen. Grad A1 der Hannover-Klassifikation zeichnet sich durch ein interstitielles Ödem sowie leichte perivaskuläre und geringe endokardiale mononukleäre Infiltrate aus, während die ISHLT- Klassifikation allein das Auftreten von entzündlichen Infiltraten als Kennzeichen einer Abstoßung wertet. Eine beginnende Infiltration des Interstitiums sowie regressive Veränderungen der Kardiomyozyten mit perinukleärem Halo, Prämyozytolysen und eine zunehmende Anzahl von Kontraktionsbanden neben geringen perivaskulären und endokardialen Infiltraten wird als Grad A2 der Hannover-Klassifikation bezeichnet. Dies entspricht Grad 1B der ISHLT-Klassifikation. Grad A3 (Hannover-Klassifikation) ist durch zunehmende perivaskuläre, interstitielle und endokardiale Infiltrate sowie fokale Myozytennekrosen gekennzeichnet und umfasst Grad 2 und 3A der ISHLT-Klassifikation. Finden sich ausgeprägte interstitielle und perivaskuläre mononukleäre, zum Teil auch gemischtzellige Infiltrate mit Zunahme degenerativer Veränderungen und Nekrosen der Myozyten, so bezeichnet man dieses Stadium als A4 der Hannover-Klassifikation bzw. Grad 3B/4 nach der ISHLT-Klassifikation. Grad A5 (Hannover-Klassifikation) beschreibt die Rückbildung der Abstoßungsreaktion mit Abnahme der Infiltrate und Proliferation von Fibroblasten sowie Bildung von vaskularisiertem Granulationgewebe. Die Hannover-Klassifikation beschreibt neben der akuten Abstoßung auch Veränderungen infolge chronischer Abstoßung und kennzeichnet diese mit C0 oder C1, wobei C0 keinen Anhalt für chronische Abstoßung bietet und C1 durch interstitielle, z.t. endokardiale aggressive Fibrose und persistierende Vaskulopathie charakterisiert ist. Die Vaskulopathie wird unterteilt in B0-B2, wobei B0 für das Fehlen einer Vaskulopathie steht. F0 bzw. F1 bezeichnet eine nicht vorhandene bzw. vorhandene interstitielle Myokardfibrose.

15 9 Unter E1 werden nicht abstoßungsbedingte Veränderungen wie alte Biopsiestellen, subepikardiales Fettgewebe, Veränderungen durch Ischämie, bakterielle oder virale Myokarditiden zusammengefasst. Tabelle 1.1: Klassifikationen der akuten Abstoßungsreaktion nach HTx Grad 0 Grad 1A Grad 1B Grad 2 Grad 3A Grad 3B Grad 4 Grad 5 ISHLT-Klassifikation nach Billingham, 1990 keine Abstoßung fokales perivaskuläres oder interstitielles Infiltrat ohne Nekrose diffuses, aber spärliches Infiltrat ohne Nekrose einzelner Fokus mit aggressivem lymphozytärem Infiltrat und/oder fokaler Myozytenschädigung multifokale aggressive Infiltrate und/oder Myozytenschädigung diffuse aggressive Infiltrate mit Nekrosen diffuses, polymorphes Infiltrat mit Nekrose +/-Ödem +/-Hämorrhagie +/-Vaskulitis Abnahme der lymphozytären Infiltrate; Fibrosierung mit Fibroblastenproliferation und Kollagenfaserbildung und hämosiderinbeladenen Makrophagen A0 A1 A2 A3 A4 A5 Hannover-Klassifikation nach Kemnitz et al., 1987 keine Abstoßung interstitielles Ödem; leichte perivaskuläre und endokardiale mononukleäre Infiltrate zusätzlich: beginnende Infiltration des Interstitiums; regressive Veränderungen an Kardiomyozyten mit perinukleärem Halo (Prämyozytolysen); zunehmende Anzahl an Kontraktionsbanden zunehmende perivaskuläre, interstitielle und endokardiale, vorwiegend mononukleäre Infiltrate mit fokalen Myozytennekrosen Ausgeprägte, vorwiegend interstitielle und perivaskuläre mononukleäre, z.t. gemischtzellige Infiltrate mit Vaskulopathie und Zunahme degenerativer Veränderungen und Nekrosen der Myozyten Abnahme der Infiltrate und Fibroblastenproliferation; Bildung von Granulationsgewebe und Fibrosierung mit Kollagenfasern und Hämosiderinablagerungen Stanford- Klassifikation nach Billingham, 1979 keine Abstoßung leichte akute Abstoßung mäßig akute Abstoßung starke akute Abstoßung Abstoßung in Rückbildung Oftmals kann jedoch durch die allein histologische Beurteilung von Endomyokardbiopsien nicht unterschieden werden zwischen akuten Abstoßungsreaktionen, infektiösen Myokarditiden und den Veränderungen, die durch Ischämie und Reperfusion, wiederholte Probeentnahme an gleicher

16 10 Stelle oder die immunsuppressive Therapie entstehen (Billingham, 1990; Schowengerdt et al., 1996). Insbesondere seit der Einführung von Cyclosporin gestaltet sich Diagnose und Graduierung einer akuten Abstoßungsreaktion diffizil, da es einerseits zur Ausbildung von subendokardialen Infiltrationsherden, den sogenannten Quilty-Effect (QE)- Zonen kommt, die leicht mit den entzündlichen Infiltraten bei Abstoßung verwechselt werden können (Billingham, 1990) und andererseits durch selektive Hemmung der T-Lymphozyten Entstehung und Rückbildung der entzündlichen Infiltrate verzögert werden, so dass die präzise Differenzierung verschiedener Schweregrade nicht mehr möglich ist (Billingham, 1981; Rose und Path, 1986; Billingham, 1988 und 1990). Vor diesem Hintergrund erscheint die Einführung zusätzlicher weiterführender Untersuchungen sowohl des intrakardialen Gewebes einschließlich der infiltrierenden Entzündungszellen als auch der extrakardialen Veränderungen, Hämodynamik, Stoffwechsel, Laborwerte u.a. betreffend, zur Diagnose und Skalierung der Abstoßungsreaktionen sinnvoll. Für die weitere Untersuchung des Myokardgewebes kommt die immunhistochemisch nachweisbare Reaktion der Kardiomyozyten und intramyokardialen Endothelzellen mit TNF-α (Tumor-Nekrose- Faktor-α)-, CMV (Cytomegalievirus)- und MiB-1-Antikörpern in Frage TNF-a-Expression im Myokard Allgemeine Bemerkungen zu TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) ist ein proinflammatorisches Zytokin, das von einer Vielzahl von Zellen produziert wird, darunter Monozyten, Makrophagen, neutrophile Granulozyten, Endothel- und Epithelzellen und nach neueren Erkenntnissen auch Kardiomyozyten (Hancock et al., 1991; Kapadia et al., 1995; Josien et al., 1998). Es handelt sich um ein 26 kd schweres Protein aus 157 Aminosäuren, das auf Chromosom 6 (6p23) lokalisiert ist. Es bindet an die TNF-α-Rezeptoren R1 (-p55) und R2 (-p75) (Torre-Amione et al., 1995). Ursprünglich wurde es als ein auf Tumore nekrotisierend wirkendes Protein entdeckt (Carswell et al., 1975). Es zeigte sich jedoch, dass TNF-α ein pleiotrophes Wirkspektrum auf eine Vielzahl von Zellen entfaltet. So greift es regulatorisch und modulierend in die zelluläre und humorale Immunantwort ein und trägt somit wesentlich zur Regulation und Initiierung von Entzündungsprozessen bei, die neben der Abwehr bakterieller, parasitärer und viraler Infektionen insbesondere bei der akuten Allotransplantatabstoßung eine wichtige Rolle spielen (Tovey et al., 1988; Tovey, 1989; George et al., 1997; Josien et al., 1998). Es stimuliert Makrophagen, B- und T- Lymphozyten, was zu einer gesteigerten Proliferation und Differenzierung derselben führt. In der Folge werden vermehrt Zytokine, Antikörper, Komplementfaktoren und Prostaglandine produziert

17 11 und sezerniert. Zusätzlich steigert es die Bildung von akute-phase-proteinen in der Leber (Gresser et al., 1987; Tovey et al., 1988; Maury, 1989; Tovey, 1989). Des Weiteren regt es Endothelzellen an zur Proliferation, Zytokinsekretion, Bildung von Prostazyklinen und Expression verschiedener Moleküle wie Adhäsions-, MHC-Klasse I- und II- sowie prokoagulatorisch wirkende Moleküle (Pober und Cotran, 1990; Hancock et al., 1991; Bergese et al., 1995; Billingham, 1997; Salom et al., 1998). TNF-α beschränkt seine biologische Aktivität jedoch nicht auf immunologische Prozesse. Es spielt durch seine kardiodepressiven Eigenschaften auch eine wichtige Rolle bei vielen kardialen Erkrankungen (s ), die mit kardialer Dysfunktion einhergehen wie septischer Schock, chronische Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, Myokarditis und akute Transplantatabstoßung (Yokoyama et al., 1993; Torre-Amione et al., 1995; Meldrum, 1998). Des Weiteren ist es an der Regulation von Zellproliferation und Apoptose beteiligt (Kohase et al., 1986; Tovey et al., 1988; Josien et al., 1998). Weiterhin spielt es bei der Regulation des Lipidmetabolismus eine Rolle (Bolton et al., 2001). TNF-α entfaltet seine Wirkungen entweder direkt oder über Aktivierung anderer Zytokine wie IL- 1, IL-2, IL-6 und Interferone (Kohase et al., 1986; Tovey et al., 1988; Meldrum, 1998). Auch TNFα unterliegt dem regulatorischen Einfluss anderer Zytokine, so wird es z.b. durch IL-1, IL-2 und Interferon-β2 stimuliert (Tovey et al., 1988; Kahan, 1989; Pfau et al., 1993) und durch IL-4, IL-6 und IL-10 gehemmt (Smith et al., 1995; Salom et al., 1998). TNF-α- IgG1 ist ein monoklonaler Antikörper, der mit natürlichem und rekombinantem TNF-α, das entweder frei löslich oder membrangebunden, nicht aber rezeptorgebunden vorliegen kann, reagiert. Es besteht Kreuzreaktivität mit TNF-β / Lymphotoxin. Mit Hilfe des Antikörpers kann TNF-α in Western blots und immunhistochemisch in menschlichem Gewebe nachgewiesen werden (Tarlow et al., 1993) TNF-α in Beziehung zur akuten Transplantatabstoßung TNF-α trägt wesentlich zur Regulation und Initiierung von bei der Allotransplantatabstoßung eine wichtige Rolle spielenden Entzündungsprozessen bei (George et al., 1997). Es zeigte sich, dass die Gabe von TNF-α-Antikörpern die Überlebenszeit von Herztransplantaten in Ratten verlängerte (Seu et al., 1991; Lin et al., 1992; Coito et al., 1995) und die TNF-α-Expression in den mononukleären Entzündungsinfiltraten mit dem Schweregrad der akuten Abstoßungsreaktion korrelierte (Arbustini et al., 1991). Doch bewirkt TNF-α nicht nur durch die zytotoxische Immunreaktion und den damit verbundenen Zellverlust eine Alteration der Transplantatfunktion, sondern hat selbst eine direkt kardiodepressive

18 12 Wirkung (Meldrum, 1998), so dass milde Abstoßungsreaktionen trotz minimaler Nekrose der Kardiomyozyten mit einer Suppression der myokardialen Kontraktilität einhergehen können (Gulick et al., 1989). Einerseits vermindert TNF-α die myokardiale Kontraktilität, indem es die Empfänglichkeit des Herzens für beta-adrenerge Reize und Calcium sowie die Ausschüttung von Calcium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum während der Systole herabsetzt (Gulick et al., 1989; Yokoyama et al., 1993; Goldhaber et al., 1996), andererseits induziert es den apoptotischen Zelltod der Kardiomyozyten (Krown et al., 1996), so dass es eine Rolle bei der Pathogenese verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen spielt, darunter akuter Myokardinfarkt, chronische Herzinsuffizienz, Artherosklerose, Virusmyokarditis und akute Transplantatabstoßung (Meldrum, 1998). Da eine Korrelation der Expression in den Entzündungszellen mit der Abstoßungsreaktion gezeigt wurde und im Tierexperiment eine Expression von TNF-α im Myokard gefunden wurde, wurde in der vorligenden Arbeit untersucht, ob menschliche Kardiomyozyten und Endothelzellen nach Herztransplantation, insbesondere bei Transplantatabstoßungen, vermehrt TNF-α exprimieren und wie sich die Expression auf Transplantatfunktion, Hämodynamik und metabolische Situation auswirkt CMV-Expression im Myokard Allgemeine Bemerkungen zu CMV Das Cytomegalievirus (CMV) gehört zu den Herpesviren und zeigt einen Tropismus zu unterschiedlichen Geweben, u.a. des Respirationstraktes, der Nerven, Leber, Herz, Pankreas, des Verdauungstraktes und des Bindegewebes (Myerson et al., 1984). Wie alle Herpesviren kann auch das CMV im infizierten Gewebe persistieren (Doerr et al., 1985) und zu einer chronisch-latenten Infektion führen, die bei Reduktion der immunologischen Abwehr jederzeit reaktiviert werden kann (Kloft, 1983). Das Cytomegalievirus ist mit einem Durchmesser von nm das größte menschliche Herpesvirus. Es besitzt ein aus Doppelstrang-DNA aufgebautes Genom, das ca. 200 Proteine kodiert, ein ikosaedrisches Nukleokapsid aus 162 Kapsomeren und eine Lipoproteinhülle (Envelope) (Doerr et al., 1985). Nach Anheftung an die Wirtszelle fusioniert die Hülle mit der Zellmembran, das Nukleokapsid dringt in die Zelle ein und wandert zum Zellkern, wo die Transkription stattfindet und sich das Virus durch Einbau der Virus-DNA in die wirtseigene DNA replizieren kann, wozu es als speziesspezifisches Virus homologe Zellen benötigt (Kloft, 1983). Bei einer produktiven Infektion lysiert das Virus die Wirtszelle durch Produktion von

19 13 Virus-DNA bzw. viruskodierten Proteinen, während es bei einer latenten Infektion in der infizierten Zelle entweder in die Wirts-DNA integriert oder episomal lokalisiert persistiert. Die typische Morphologie des infizierten Gewebes umfasst die Bildung von bis auf 40 µm vergrößerten, sog. zytomegalen Zellen mit mikroskopisch sichtbaren, intranukleär oder seltener zytoplasmatisch lokalisierten Einschlusskörperchen, die einen Durchmesser von 17 µm erreichen können und durch einen Halo von der Kernmembran abgesetzt sind (Kloft, 1983; Doerr et al., 1985). Der monoklonale Maus-Antikörper dient dem immunhistochemischen Nachweis einer CMV- Infektion im Gewebe und reagiert mit einem 68 kd schweren Antigen, das im Kern von CMVinfizierten Zellen exprimiert wird. Immunreaktivität kann 24h nach der Infektion nachgewiesen werden und erreicht nach 24-48h einen frühen und nach 96h einen späten Intensitätspeak. Es besteht keine Kreuzreaktivität mit anderen Herpesviren CMV in Beziehung zur akuten Transplantatabstoßung Bei Transplantatempfängern spielen CMV-Infektionen eine führende Rolle. Man unterscheidet Primärinfektionen, die hauptsächlich durch Transplantat oder Blutprodukte eines CMVseropositiven Spenders auf einen seronegativen Empfänger übertragen werden (Wreghitt et al., 1988) und rekurrente Infektionen, die bei seropositiven Empfängern entweder durch Reaktivierung einer latenten Infektion im Rahmen der Immunsuppression oder durch Reinfektion mit seropositivem Spendermaterial auftreten. Die Inzidenz der CMV-Infektion bei CMV-Mismatch (Spender: CMV-positiv; Empfänger: CMV-negativ) variiert zwischen 64 und 92%, bei seronegativem Spender und Empfänger werden noch Infektionsraten von 15% erreicht (Metselaar et al., 1990). Rekurrente Infektionen treten je nach Autor in 30 bis 100% der Fälle auf (Dummer et al., 1985; Wreghitt et al., 1988). Die Klinik der akuten CMV-Infektion ist eher unspezifisch und ähnelt der einer akuten Abstoßungsreaktion mit Symptomen wie Fieber, Unwohlsein, Schwäche etc. (Milbradt et al., 1987). Die histologische Unterscheidung zwischen einer viralen Myokarditis und einer akuten Abstoßungsreaktion ist am HE-gefärbten Präparat nahezu unmöglich (Schowengerdt et al., 1996). Dies kann unter anderem auch darauf zurückgeführt werden, dass CMV-Infektionen häufig okkult im Gewebe auftreten, d.h. ohne, dass zytomegale Zellen oder typische Einschlusskörperchen auftreten (Myerson et al., 1994). Zusätzlich treten Abstoßungsreaktion und CMV-Infektion oftmals assoziiert auf, da einerseits die Abstoßung mit folgender erhöhter Immunsuppression der CMV- Infektion den Weg ebnet (Milbradt et al., 1987) und andererseits die CMV-Infektion die Abstoßung triggert (Lopez et al., 1974).

20 14 Daher ist eine frühzeitige CMV-Diagnostik wichtig, um rechtzeitig eine adäquate Therapie einzuleiten, da eine wirksame Therapie der CMV-Infektion möglich ist und eine fälschlicherweise eingeleitete Erhöhung der Immunsuppression fatale Folgen haben kann (Milbradt et al., 1987; Jäkel et al., 1992). Da die myokardiale Beteiligung an einer CMV-Infektion eine schwerwiegende Komplikation darstellt, die unter Umständen lebensbedrohlich werden kann (Pucci et al., 1994), erscheint die Ergänzung der laborchemischen CMV-Diagnostik mittels IgM-Bestimmung durch feingewebliche Untersuchungen sinnvoll, insbesondere da sich die okkult infizierten Zellen durch immunhistochemische Färbung mit CMV-Antikörpern bzw. durch in-situ-hybridisierung nachweisen lassen (Myerson et al., 1994). Hierbei liefern beide Methoden gleiche Ergebnisse. Der immunhistochemische Nachweis des CMV-Antigens ist aber weniger aufwendig und daher vorzuziehen (Strickler et al., 1990; Muir et al., 1998) Ki-67-Expression im Myokard Allgemeine Bemerkungen zu Ki-67 Das nukleäre, zellproliferationsassozierte Antigen Ki-67, welches in allen aktiven Phasen des Zellzyklus exprimiert wird, kann durch den monoklonalen Antikörper MiB-1 (Molecular Immunology Borstel-1) nachgewiesen werden (Gerdes et al.,1991). Bei dem Ki-67 Antigen handelt es sich um ein aus zwei Polypeptidketten bestehendes 345 bzw. 395 kd schweres Protein (Key et al., 1993), das frei oder assoziiert mit DNA existieren kann (Lopez et al., 1994). Es wird als Marker für proliferierende Zellen betrachtet, da es nur in proliferierenden Zellen vorhanden ist und in ruhenden Zellen fehlt (Gerdes et al., 1983). Weiterhin ist es während der DNA-Reparatur nicht nachweisbar (McCormick et al., 1993; Key et al., 1994). Das nukleäre Antigen, das mit Hilfe des Ki-67-Antikörper erkannt wird, wird in der G0-Phase des Zellzyklus nicht exprimiert, aber in der S-, G2- und M-Phase des Zellzyklus. Die Antigenexpression in der G1-Phase des Zellzyklus ist unterschiedlich: Von den Zellen, die die Anfangsstadien des Wechsels von der G0 zur G1-Phase durchlaufen, wird das Ki-67 Antigen nicht exprimiert, im Gegensatz zu den Zellen, die von der M-Phase des Zellzyklus in die G1-Phase des Zellzyklus kommen (Gerdes et al., 1984). Die Menge des Antigens variiert innerhalb des Zellzyklus und erreicht ein Maximum während der G2 und M-Phase (Sasaki et al.,1987; Wersto et al., 1988) gelang es Gerdes et al., einen monoklonalen Antikörper, der sich spezifisch gegen dieses proliferationsassoziierte Ki-67-Antigen richtet, zu isolieren und charakterisieren (Gerdes et al.,

21 ). Dieser Antikörper Ki-67 wurde durch die Immunisierung von Mäusen mit Hodgkinzellen hergestellt. MiB-1 ist einer von mehreren 1992 von Key et al. entdeckten monoklonalen Antikörpern, der sich gegen rekombinante Teile von Ki-67 richtet. Er lieferte in der immunhistochemischen Gewebefärbung von Gefrierschnitten äquivalente Ergebnisse wie Ki-67, wies allerdings eine höhere Affinität zu den Kernproteinen auf (Lopez et al., 1994). Mit seiner Hilfe gelang es Munakata and Hendricks erstmals durch Vorbehandlung der Schnitte in der Mikrowelle die Ki-67- Expression an Paraffinschnitten darzustellen. Das war bisher weder mit dem Ki-67-Antikörper noch mit MiB-1 möglich gewesen (Munakata and Hendricks, 1993) Ki-67 in Beziehung zur akuten Transplantatabstoßung Der monoklonale Antikörper MiB-1 erkennt das Kernantigen Ki-67, welches in allen aktiven Phasen des Zellzyklus exprimiert wird, in ruhenden Zellen jedoch nicht nachweisbar ist (Gerdes et al., 1991). Die Ermittlung von Proliferationsraten mittels MiB-1 erwies sich als hilfreich bei der Differenzierung hoch- von niedrigmalignen Neoplasien (Stenzel et al., 1996) und liefert wichtige prognostische Informationen beim onkologischen Monitoring (Brown und Gatter, 1990; Jansen et al., 1997). Doch auch in rein reaktiven Läsionen und sich physiologischerweise regenerierendem Gewebe konnten mittels MiB-1 Proliferationsraten beobachtet werden, welche die hochmaligner Tumoren erreichten (McCormick et al., 1993; Stenzel et al., 1996). So hielt die Immunfärbung mit MiB-1 Einzug in die Untersuchungen nach Herztransplantation und es zeigte sich, dass die Expression von Ki-67 in Entzündungsinfiltraten endomyokardialer Biopsien nach HTx mit dem Abstoßungsgrad korreliert. Die Anzahl der proliferierenden mononukleären Zellen erwies sich nicht nur als direkt proportional zum Schweregrad der akuten Abstoßung (Salom et al., 1994; Gerbaulet et al., 1998), sondern auch als prädiktiv für das Weiterbestehen bzw. Fortschreiten einer Abstoßungsreaktion (Salom et al., 1994). Des Weiteren konnte eine MiB-1-Immunreaktivität in intramyokardialen Endothelzellen beobachtet werden (Jäkel et al., 1992; Gerbaulet et al., 1996). Diese spielen eine wesentliche Rolle bei den nach Transplantation erfolgenden Immunprozessen, die akute Abstoßungsreaktion eingeschlossen (Pober und Cotran, 1990; Salomon et al., 1991; Ustinov et al., 1993). Die Frage, ob auch die Herzmuskelzelle ein Potential zur Teilung und Regeneration besitzt, wird noch kontrovers diskutiert. Lange Zeit ging man davon aus, dass Kardiomyozyten nicht wieder in den Zellzyklus eintreten können, da sie zu den stabilen und postmitotischen Zellen zählen.

22 16 Als Beweis wurde angeführt, dass die Entstehung einer bindegewebigen Narbe nach Herzinfarkt eine Regenerationsfähigkeit des Herzens ausschließt (Agah et al.,1997; Soonpaa und Field, 1998; Beltrami et al., 2001). Weiterhin wurde darauf hingewiesen, dass myokardiale Tumoren eine Rarität darstellen (Soonpaa und Field, 1998). Verschiedene Studien wurden über Zellproliferation im sich entwickelnden menschlichen Herzen durchgeführt, um herauszufinden, ob und wann die Muskelzellen endgültig den Zellzyklus verlassen. So fand Rumiantsev (1978) in einer Studie über die prä- und postnatale Entwicklung des Herzens, dass die Kardiomyozyten bis zum 18. postnatalen Tag ihre mitotische Aktivität einstellen. Dies konnte durch die Untersuchungen von Mayhew et al. (1997) und Huttenbach et al. (2001) bestätigt werden. In letzter Zeit jedoch konnten Untersuchungen zeigen, dass auch als stabil eingestuftes Gewebe Potential zur Proliferation aufweist: Kauhanen et al. (1998) z.b. zeigten, dass nach Immobilisation und nachfolgender Remobilisation in der Oberschenkelmuskulatur von Kaninchen eine mittels Ki-67-Expression nachgewiesene Proliferation auftrat, die in unbeschädigter Muskulatur fehlte. In Leberbiopsien von Patienten mit Leberzirrhose oder chronischer Hepatitis konnte das Ki-67- Antigen mittels MiB-1 in Zellkernen von Hepatozyten nachgewiesen werden (Matsumoto et al.,1999). Zudem wurde die Existenz von regenerierenden Neuronenzellen im menschlichen Gehirn dokumentiert, wobei hier nicht MiB, sondern ein die DNA-Replikation nachweisbarer Marker (BrdU) verwendet wurde (Kirschenbaum et al., 1999; Kornack und Rakic, 1999; Horner et al., 2000; Kornack und Rakic, 2001; Mattson und Klappner, 2001). Verschiedene Studien wiesen mitotische Aktivität in Form von Expression der proliferationsassoziierten Antigene Ki-67 und PCNA in Herzmuskelzellen nach Myokardinfarkt bzw. bei terminaler Herzinsuffizienz nach (Quaini et al.,1994; Petrovic et al., 2000; Beltrami et al., 2001; Leri et al., 2001). Nach Herztransplantation und bei akuten Abstoßungsreaktionen wurden von zahlreichen Autoren Veränderungen an den Kardiomyozyten und deren Zellkernen beschrieben, die auf das Wirken von proliferations- und wachstumsfördernden Faktoren schließen lassen. In den ersten beiden Wochen nach orthotoper HTx konnte von Schnabel (1997) die Entstehung einer Hypertrophie, nicht aber Hyperplasie der Kardiomyozyten beobachtet werden. Des Weiteren wies er auf eine signifikante Zunahme der Hypertrophie in den der Transplantation folgenden Jahren hin. Auch Rowan und Billingham (1990) fanden eine Hypertrophie der Kardiomyozyten bei Langzeitüberlebenden nach HTx.

23 17 Im Gefolge der Myozytenschädigung im Rahmen schwerer Abstoßungsreaktionen tritt laut Myles et al. (1987) eine kompensatorische Hypertrophie der noch nicht geschädigten Myofibrillen auf. Bei höhergradiger Schädigung fanden Rose und Uys (1991) eine starke Fältelung der Kernmembran und auch Kottke-Marchant und Ratliff (1990) stellten an regenerierenden Zellkernen Oberflächeneinstülpungen und große Nukleoli fest. McMahon und Ratliff (1990) beobachteten im Zusammenhang mit akuten Abstoßungsreaktionen nach HTx nicht nur Abbau und Verlust von Myofibrillen, sondern auch eine Neubildung, die sogenannte Myofibrillogenese. Des Weiteren fanden sie ultrastrukturelle Ähnlichkeiten mit der embryonalen Kardiomyogenese, was darauf hindeutet, dass Herzmuskelzellen die Fähigkeit zur Regeneration besitzen. Unterstützt wird diese Hypothese durch das Vorhandensein von zwei Zellkernen in einem regenerierendem Myozyten, was als Karyokinesis (Kernteilung in Abwesenheit von Zellspaltung) interpretiert werden könnte (McMahon und Ratliff, 1990). Dies deutet darauf hin, dass Kardiomyozyten ein höheres Potential zur Teilung haben als bislang vermutet. Auch dass das Verhältnis von binukleären zu mononukleären Herzzellen konstant 25% zu 75% beträgt, unabhängig von Alter und Hypertrophie (Olivetti et al., 1996), sowie die Beobachtung von sich mitotisch teilenden Kardiomyozyten (Kajstura et al.,1998; Beltrami et al., 2001) weisen eindeutig darauf hin, dass die Myozyten sowohl zu Karyo- als auch zu Zytokinesis, ergo zu Mitose, fähig sind. Dieses wiederum wirft die Frage auf, ob als Reaktion auf die Zellschädigung im Rahmen der akuten Abstoßungsreaktion eine Proliferation der Kardiomyozyten auftritt, die mit der Expression des Ki-67-Antigens einhergeht Ziel der Arbeit Als Hauptkomplikation nach Organtransplantation gilt neben der Infektion die akute Abstoßungsreaktion, die sowohl frühpostoperativ, als auch jederzeit im späteren Verlauf auftreten kann. Dadurch kommt der Früherkennung von Abstoßungsreaktionen in jeder Phase nach Herztransplantation eine zentrale Bedeutung zu. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, in wieweit ein Zusammenhang besteht zwischen histomorphologischen und immunhistochemischen Befunden bei Herzbiopsien mit Zeichen der Abstoßungsreaktion und klinischen Parametern, die ebenfalls als diagnostische Parameter für eine Abstoßungsreaktion diskutiert werden. Dazu wurden die klinischen Veränderungen bei Vorliegen von leichtgradigen Abstoßungsreaktionen im Vergleich zu tolerierten Transplantaten im Zeitraum von drei bis fünf Jahren nach Herztransplantation untersucht. Weiterhin wurde untersucht,

24 18 inwiefern es zu unterschiedlicher, immunhistochemischer Expression von TNF-α, CMV und Ki-67 bei transplantierten im Vergleich zu nicht transplantierten Herzen der Kontrollgruppe (explantierte Herzen, im Rahmen diagnostischer Untersuchungen entnommene Myokardbiopsien von Patienten mit Hypertonie oder Kardiomyopathie) kommt. Diese immunhistochemischen Expressionsintensitäten sowie verschiedene klinische bzw. laborchemische Parameter wurden bei Vorliegen oder Fehlen einer histologisch nachweisbaren Abstoßungsreaktion untersucht und geprüft, ob sie mit der Stärke der Abstoßungsreaktion in Beziehung stehen und inwiefern sie sich als prognostische Faktoren für das Auftreten einer histologisch nachweisbaren Abstoßungsreaktion eignen. Die Akute-Phase-Proteine CRP und Fibrinogen, Veränderungen der Hämodynamik und des Cholesterinspiegels sowie die Beziehungen mit der immunsuppressiven Therapie mit Cyclosporin A wurden als potentielle klinische Marker untersucht. Da TNF-α eine wesentliche Rolle bei Regulation und Initiierung von den an der akuten Transplantatabstoßung beteiligten Entzündungsprozessen spielt (Tovey et al., 1988; Tovey, 1989; George et al., 1997; Josien et al., 1998), eine Korrelation der TNF-α-Expression in den Entzündungszellen mit der Abstoßungsreaktion gezeigt wurde und im Tierexperiment eine Expression von TNF-α im Myokard gefunden wurde, wurde untersucht, ob menschliche Kardiomyozyten und Endothelzellen TNF-α exprimieren und ob sich eine etwaige Expression bei Transplantatabstoßungen verändert. Da TNF-α die Bildung von akute Phase Proteinen in der Leber steigert (Gresser et al., 1987; Tovey et al., 1988; Maury, 1989; Tovey, 1989), bei viralen Infektionen vermehrt gebildet wird (Tovey et al., 1988; Tovey, 1989), bei der Regulation des Lipidmetabolismus eine Rolle spielt (Bolton et al., 2001) und selbst kardiodepressive Wirkung besitzt (Meldrum, 1998), wurde weiterhin untersucht, ob eine Beziehung besteht zwischen intramyokardialer TNF-α-Expression und Hämodynamik, metabolischer Situation, laborchemischen Parametern, insbesondere CRP und Fibrinogen, und einer laborchemisch erfassten CMV-Infektion. Da die sichere Diagnose einer myokardialen CMV-Infektion durch die rein histologische Beurteilung von Endomyokardbiopsien oftmals nicht möglich ist (Myerson et al., 1994), wurde in der vorliegenden Arbeit Myokardgewebe zum Zeitpunkt einer laborchemisch nachweisbaren CMV-Infektion auf die Expression von CMV-Antigen durch Kardiomyozyten und Endothelzellen untersucht. Des Weiteren wurde einer potentiellen Wechselwirkung zwischen CMV-Infektion und Abstoßungsreaktion nachgegangen. Weiterhin wurde untersucht, ob ein immunhistochemisch nachweisbarer, myokardialer CMV-Befall zu Veränderungen der Hämodynamik, insbesondere des Blutdrucks und der Katecholaminkonzentration, sowie zum Anstieg der Akute-Phase-Proteine führt. Außerdem untersucht wurde eine Beziehung zwischen dem Cyclosporinspiegel und der