Fumarat-Atmung. Verschiedene Elektronendonatoren und -akzeptoren bei E. coli. Fumarat-Atmung. Fumarat-Atmung. Nitrat-Atmung.

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1 Verschiedene Elektronendonatoren und -akzeptoren bei E. coli Fumarat-Atmung Die Fumarat-Reduktase kann Elektronen von Komplex I akzeptieren, oder von der Formiat-Dehydrogenase. In beiden Fällen wird ein Protonengradient erzeugt. Fumarat dient als terminaler Akzeptor, es handelt sich hier um anaerobe Atmung Q Ubichinon, MK Menachinon, DMK 2-Demethylmenachinon Fumarat-Atmung Die Kopplung von Fumarat-Reduktase mit Formiat- Dehydrogenase verläuft durch die Plasmamembran (Formiat- Dehydrogenase außen), dabei werden zwei unterschiedliche Cytochrome b verwendet, und Menachinon (ähnelt dem Ubichinon). Struktur der Fumarat-Reduktase (Membranteil unten, Flavoprotein (blau) oben, FeS- Zentren in beiden Bereichen) Fumarat-Atmung Fumarat-Atmung kommt bei Enterobacteriacae (E. coli), obligaten Anaerobiern, Propionibakterien und sogar bei anaerob lebenden Würmern vor. Anaerobe Atmung Verschiedene bei Bakterien verwendete terminale Elektronenakzeptoren: Besonders wichtig sind neben O 2 Nitrat, Sulfat, CO 2, Fe 3+ und Fumarat. Die Reduktion von Nitrat geschieht zu zwei Zwecken: zum Einbau in zelleigene Moleküle (Nitratassimilation, Nitratammonifikation) über Nitrit zu Ammonium, und zur Energiegewinnung (Nitratatmung, Denitrifikation) zu molekularem Stickstoff N 2. Der assimilatorische Weg (Nitratreduktase B, Nitritreduktase, die Enzyme arbeiten mit NADH oder Ferredoxin) wird von Ammonium reprimiert (dann ist er ja überflüssig), die Nitratatmung (Nitratreduktase A, Nitritreduktase, die Enzyme sind membranintegriert und arbeiten mit Elektronen der Atmungskette) wird im Anaeroben eingeschaltet (sonst wird Sauerstoff verwendet).

2 Nitrat-Atmer wie Paracoccus denitrificans (Elektronen von H 2 ), Bacillus licheniformis (Elektronen von C 2 -Verbindungen) oder Thiobacillus denitrificans (Elektronen von Schwefel oder Thiosulfat) sind für ihre Biosynthese auf Ammonium oder organische N-Verbindungen angewiesen, da ihnen der assimilatorische Weg fehlt! E. coli besitzt eine membrangebundene Nitratreduktase mit FeS-Cluster und Cyt b, bei der Reaktion wird ein Protonengradient aufgebaut. Das Nitrit kann aber nur assimilatorisch weiter reduziert werden. Aber auch das dient indirekt dem Energiegewinn: durch den Verbrauch von Reduktionsäquivalenten kann Acetyl-CoA zur ATP-Synthese genutzt werden, statt reduziert zu werden. Der Elektronenfluß ist bei Nitratatmung und normaler Atmung sehr ähnlich, nur wird im letzten Transfer der Nitratatmung kein Proton transloziert. Denitrifikation ist ein für die Landwirtschaft bedeutender (schädlicher) Prozess, da Dünger-Stickstoff aus dem Boden entzogen wird. Gute Belüftung (reprimiert die ) ist eine Gegenmaßnahme. Bei Überdüngung (oft mit Jauche in Schweinezuchtgebieten) vermindert die Denitrifikation (z.b. im Klärwerk) das Auswaschen von Nitrat in Bäche, Flüsse und Seen und damit deren Umkippen. Anammox Seit 1990 kennt man neben der Denitrifikation einen weiteren biochemischen Prozess, der molekularen Stickstoff produziert, Anammox (Anaerobe Ammoniumoxidation). Dabei reagieren Ammonium und Nitrit zu N 2 mit ΔG = -357,8 kj/mol! Entdeckt wurde die Reaktion bei einem Klärwerkbewohner, Brocadia anammoxidans, einer Planctomycete. Da der autotrophe Organismus auch noch CO 2 verbraucht, hat er ein großes Potential als Anti-Treibhausgasorganismus, mit nutzbarem Energiegewinn. Die CO 2 -Fixierung läuft übrigens über den reduktiven Acetyl-CoA-Weg (siehe Homoacetatgärung).

3 Anammox Das Schlüsselenzym, Hydroxylamin- Oxidoreduktase, scheint in einem eigenen Organell, dem Anammoxosom lokalisiert zu sein. Die Membran des Organells erinnert an Archaenmembranen, sie enthält leiterförmige Fettether und -ester (Ladderane). Dazu ist Brocadia anammoxidans der einzige bekannte Organismus, der Hydrazin (N 2 H 4 ) produzieren kann. Anammox Der Stoffwechselweg scheint auch im Meer eine große Rolle im Stickstoffhaushalt zu haben. Seit kurzem kennt man da die Anammox-Bakterie Scalindua sorokinii, und hat aus rdna- Untersuchungen schon Hinweis auf über 2000 andere Arten. Vermutlich werden im Meer mindestens 24%, ev. bis 70% des N 2 durch diese Bakterien (Ordnung Brocardiales) produziert. Metaboliten des Schwefel- Stoffwechsels Auch bei der Reduktion von Sulfat kann das zu assimilatorischen Zwecken (Bakterien, Pilze, Pflanzen) und zu dissimilatorischen Zwecken (Sulfat-Atmung: Desulfovibrio, Desulfotomaculum und die gleitenden Bakterien Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema) geschehen. Alle Sulfat-Atmer sind obligat anaerob. Metaboliten des Schwefel- Stoffwechsels In beiden Fällen wird das Sulfat zuerst von ATP-Sulfurylase adenyliert, die Spaltung des entstehenden Pyrophosphats macht die Reaktion irreversibel (>APS, Adenosin-5 - phosphorylsulfat). Die Rückreaktion wird bei der Pyrosequenzierung zur DNA-Sequenzierung eingesetzt. Wird der DNA-Polymerase das passende dntp angeboten, wird das Nucleotid in die wachsende DNA eingebaut und Pyrophosphat frei. Die ATP- Sulfurylase produziert damit aus APS ATP, das z.b. mit Luciferase als Lichtblitz detektiert wird. Metaboliten des Schwefel- Stoffwechsels Metaboliten des Schwefel- Stoffwechsels Bei der assimilatorischen Reduktion wird die Ribose noch an 3 phosphoryliert (>PAPS, Adenosin-3 -phosphat-5 - phosphorylsulfat), zur Reduktion dient NADPH. Bei der Sulfatatmung wird APS durch Elektronen der Atmungskette reduziert. In beiden Fällen wird Sulfit als Reduktionsprodukt abgespalten. Assimilatorisch wird es direkt (6 e - ) zum Sulfid reduziert, dissimilatorisch in Stufen über Trithionat (S 3 O 6 2-) und Thiosulfat (S 2 O 3 2-) bis zum Sulfid (S 2-, H 2 S).

4 Energieproduktion in Desulfovibrio auf Lactatmedium Die Schwefel-Atmer (Desulfurikanten) verwenden die Ausscheidungsprodukte der Anaerobier, z.b. Lactat, Acetat, Butyrat, Formiat, Ethanol, Fettsäuren. Wasserstoffumsatz von Desulfovibrio auf Lactatmedium Eine periplasmatische Hydrogenase leitet Elektronen auf Cytochrom c 3, über den Hmc-Komplex werden sie der cytoplasmatischen Reduktase geliefert. Die zurückbleibenden H + dienen der ATP-Gewinnung. Sulfat-Atmung Falls die Elektronen aus Lactat oder Pyruvat stammen, ist durch die Nutzung des Acetyl-CoA weiter Energiegewinn möglich. Vielfach wird Wasserstoff (H 2 ) zur Sulfat-Atmung verwendet (z.b. Desulfovibrio desulfuricans). Andere Sulfat-Atmer oxidieren Acetat über Kohlenmonoxid (Kohlenmonoxid-Dehydrogenase) zu Kohlendioxid. Die Gegenreaktion (Bildung von Acetat aus CO 2 über CO) findet bei homoacetogenen Bakterien statt. Auch im Pansen der Wiederkäuer findet Sulfatatmung mit Bildung von H 2 S statt (Desulfotomaculum ruminis). Sulfat-Atmung Thiosulfat (S 2 O 3 2- ) kann als alleiniges Substrat die Atmungskette treiben. Dabei wird ein Teil des Schwefels oxidiert, ein anderer reduziert: Disproportionierung. Es entstehen Sulfat und Schwefelwasserstoff (ΔG = -21,9 kj/reaktion). Auch Elementarschwefel kann disproportioniert werden, zu Sulfat und Schwefelwasserstoff (ΔG = +40,8 kj/reaktion). Die energetisch ungünstige Reaktion kann durch Kopplung mit einer Reoxidation des H 2 S zu Schwefel mittels Braunstein ermöglicht (und zur ATP-Produktion über die Atmungskette genutzt) werden (MnO 2 + H 2 S > S + Mn OH -, ΔG = -140 kj/reaktion). Als Gesamtreaktion wird dabei Schwefel von Braunstein zu Sulfat oxidiert. Sulfat-Atmung Geologische Vorkommen von Schwefel und von sulfidischen Erzen sind teilweise durch sulfatreduzierende Bakterien erzeugt (teilweise auch durch Vulkanismus). Sulfatatmer beschleunigen die anaerobe Korrosion von Eisen. In Wasser schützt sich Eisen durch einen feinen Film aus Wasserstoff (4 Fe + 8 H + > 4 Fe H 2 ). Desulfurikanten verbrauchen den Wasserstoff, aus Eisenionen und H 2 S entsteht Eisensulfid. Kohlendioxid kann zu Acetat (siehe reduktiver Acetyl-CoA- Weg/Wood-Ljunddahl-Weg) oder zu Methan reduziert werden. Alle methanogenen Organismen gehören zu den Archaeen, z.b. Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanospirillum. Sie bilden neben Eubakterien und Eukaryonten die dritte Gruppe der Lebewesen. Sie besitzen kein Peptidoglucan, Glycerinether und Isoprenoide in der Membran, und ihre Ribosomen sind zwar 70S, ähneln aber eukaryontischen (keine Hemmung durch Cycloheximid, aber durch Diphterietoxin).

5 - Archaeen CarbonatAtmung Coenzyme bei der Methanbildung Methanogene kommen in Sümpfen (Sumpfgas) und Kläranlagen und im Pansen vor. Es sind obligate Anaerobier mit hoher Sauerstoffempfindlichkeit. Entsprechend besitzen sie weder Katalase noch Superoxiddismutase. Veratmet werden Wasserstoff, Formiat, Methanol oder Acetat. Oft kommen sie vergesellschaftet mit H2-Produzenten vor und begünstigen durch den Verbrauch des Wasserstoffs deren Stoffwechsel. Methan-Bildung aus Kohlendioxid Methan-Bildung aus Acetat CarbonatAtmung Coenzym F430 enthält Nickel

6 Auf Coenzym M (2-Mercaptosulfonsäure) wird intermediär von Cobalamin (Vitamin B 12 ) ein Methylrest übertragen. Überhaupt sind die Zwischenprodukte immer Coenzymgebunden, freies Methanol oder Formaldehyd treten nicht auf. Ist Wasserstoff der Elektronendonor, gibt er von außen die Elektronen an die Atmungskette in der Cytoplasmamembran ab. Dabei entsteht ein Protonengradient. Die Wasserstoffe des Methans, das im Cytosol entsteht, stammen aus Wasser! Die Atmungskette ist anders aufgebaut als bei Bakterien, es kommen keine Chinone oder Ferredoxine vor. Methanogene sind autotroph, ihren biosynthetischen Kohlenstoff können sie aus CO 2 gewinnen. Anorganische Stoffe können, besonders unter aeroben Bedingungen, auch als Elektronendonatoren genutzt werden, insbesondere NH 3, NO 2-, S 2-, Schwefel S, SO 3 2-, S 2 O 3 2- Finaler Elektronenakzeptor ist dabei O 2 über die Atmungskette. Es gibt fakultative und obligate Chemolithotrophe. Den obligaten fehlt meist die α-ketoglutaratdehydrogenase. Die Reduktionskraft der Substrate (außer Wasserstoff) reicht nicht zum Erzeugen von NADH (-320 mv, Nitrat/Nitrit +420 mv, NH 3 /NH 2 OH +899 mv). Falls kein Wasserstoff vorhanden ist, werden unter ATP-Verbrauch Elektronen gegen die Atmungskette gepumpt, um Reduktionsäquivalente für Biosynthesen zu produzieren. - Nitrifikation Nitrifizierer oxidieren Ammoniak zu Nitrit bzw. Nitrit zu Nitrat. Die beiden Umsetzungen finden in verschiedenen Organismen statt: Nitrosomonas europaea, Nitrosococcus oceanus, Nitrosospira briensis (Ammoniakoxidierer) produzieren Nitrit, Nitrobacter winogradsky, Nitrobacter agilis, Nitrococcus mobilis führen die Weiteroxidation zu Nitrat durch. Alle gehören zur Familie der gram-negativen Nitrobacteriaceae. Sie wachsen sehr langsam, mit Generationszeiten von Stunden. Die Energieausbeute der Reaktionen ist gering, daher muß viel Ammoniak/Nitrit umgesetzt werden.

7 Anammox und Nitrifikation Im Klärwerk wird diese Teilung der Ammoniumoxidation ausgenutzt. Zur Ammoniakentgiftung wird ein Teil des Ammoniums von Ammoniumoxidierern zu Nitrit oxidiert, und von Anammox-Bakterien im selben Klärbecken mit dem übrigen Ammonium zu N 2 entgiftet. Der Prozess braucht weniger Sauerstoff als der bisher übliche von Ammoniak über Nitrat in einem Becken, und Denitrifizierung in einem zweiten, anaeroben, und vermeidet die Bildung von NO und N 2 O. Praktischerweise bilden die beiden Organismen auch noch Granula (durch Biofilmbildung) und brauchen keine Zufütterung (bei der Nitratatmung braucht man ja einen Elektronendonor, meist wird da Methanol ins Becken gegeben). - Nitrifikation Nitrifikation Nitrifizierer zeigen lamelläre oder vesikuläre Membraneinstülpungen, die Mesosomen: Nitrosomonas (a, b); Nitrocystis (c); Nitrosolobus (d); Nitrosospira (e); Nitrobacter (f); Nitrosococcus (g); Nitrospina (h); - Nitrifikation Nitrifizierer führen zur Stickstoffauswaschung aus Böden, da Ammonium besser gebunden wird, während Nitrat schnell weggewaschen wird. Nitrifikation - von Ammoniak zu Nitrit Membranprotein Ammonium- Monooxigenase benötigt (!, es wird zugleich O 2 reduziert) 2 Elektronen, die über Cyt c und Ubichinon geliefert werden. Periplasmatische Hydroxylamin- Oxidoreduktase überträgt 4 Elektronen auf Cytochrom c. Nur 2 der Elektronen erreichen also die terminale Oxidase. Allerdings werden dabei auch Protonen transportiert (innen verbraucht bzw. außen erzeugt). Nitrifikation - von Nitrit zu Nitrat Die protonenmotorische Kraft wird durch Cytochrom aa 3 erzeugt.

8 Comammox und Nitrifikation Seit 2015 kennt man Bakterien (Gattung Nitrospira), die beide Schritte der Nitrifikation durchführen: COMplete AMMonium Oxidation). Ihre Ammoniumoxidase ist nur weitläufig mit der der typischen Ammoniumoxidierer verwandt und scheint unabhängig evolviert zu sein (ist also wohl nicht durch horizontalen Gentransfer in den Stamm gelangt). Thaumarchaeota - Ammonium-oxidierende Archaeen Die Thaumarchaeota wurde lange als mesophile Crenarchaeota klassifiziert und sind jetzt ein eigenes Phylum. Sie kommen im Meer, im Boden, in heißen Quellen und auf unserer Haut vor. Si e oxidieren auch Ammonium zu Nitrit mitels einer Monooxygenese. Im Gegensatz zu den Ammoniumoxidierenden Proteobakterien können sie schon von sehr geringen Ammonium-Konzentrationen leben und liefern im Meer den Nitritoxidiern (Bakterien, Gattung Nitrospina) die Grundlage zum Leben. In ihrer Kooperation sind die beiden - autotrophen - Organismengruppen für 15-45% der CO 2 - Fixierung in der Tiefsee verantwortlich. Thaumarchaeota - Ammonium-oxidierende Archaeen - Thiobacillus Mitglieder der gramnegativen, polar begeißelten Thiobacilli können verschiedene Schwefelverbindungen oxidieren: H 2 S, Schwefel, Thiosulfat, Dithionit (S 2 O 4 2- ), Tetrathionat (S 4 O 6 2- ). Produkt ist immer Sulfat. Das Zwischenprodukt Schwefel wird häufig als Reservestoff in der Bakterienzelle abgelagert (charakteristische helle Einschlüsse). T. thiooxidans, T. ferrooxidans (Elektronendonator auch Fe 2+), T. thioparus, T. denitrificans, und das Archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Thiobacilli fixieren CO 2 und sind also (obligat) autotroph. Statt Sauerstoff kann T. denitrificans auch Nitrat als Elektronenakzeptor einsetzen. - Thiobacillus Die durch die Sulfit-Oxidation gewonnenen Elektronen werden über Cytochrom c in die Atmungskette eingeschleust (Sulfit-Oxidase), oder durch Umkehr der Sulfatreduktion mit APS-Reduktase, wobei das Sulfat des APS phosphorolytisch vom Phosphat gespalten wird: eine Substratkettenphosphorylierung!. - Eisenoxidation Thiobacillus ferrooxidans kann auch Fe 2+ zu Fe 3+ oxidieren. Er lebt bei ph bis 2,5 in den Wässern von Eisenbergwerken. Auch das Archaeon Sulfolobus acidocaldarius kann Fe 2+ oxidieren. Diese Prozesse werden zur Eisenanreicherung in armen Erzen verwendet. Die sulfidischen Erze werden mit ihrem Abwasser immer wieder befeuchtet, dabei werden unlösliche Sulfide abgebaut, die Erzlauge reichert sich mit gelöstem Fe 3+ an: Erzlaugung.

9 - Eisenoxidation Eisenoxidation liefert wenig Energie (E o +0,77 V, O 2 /H 2 O +0,82 V!, mit Sauerstoff ΔG=-32,9 kj/elektron), daher müssen die Bakterien große Eisenmengen umsetzen. Eisenoxidierer erkennt man in der Natur daher eher an den großen Mengen an Fe 3+, schwerer an der geringen vorhandenen Biomasse. - Oxidation von H 2 Viele unverwandte Bakterien können Wasserstoff oxidieren, z.b. Alkaligenes eutrophus, viele Pseudomonaden, Paracoccus denitrificans, Mycobacterium gordonae, Bacillus sp. Das geschieht oft in Vergesellschaftung mit H 2 -Produzenten. Elektronenakzeptor können neben Sauerstoff auch Nitrat (> N 2, P. denitrificans), Sulfat (> Sulfid, Desulfovibrio vulgaris), Schwefel (> Sulfid, Campylobacter), CO 2 (> Methan, Methanobakterien) oder CO 2 (> Acetat, Acetobacterium) sein. Eine eigene Gruppe sind die fakultativ lithoautotrophen (CO 2 - Fixierung) Knallgasbakterien, die H 2 und O 2 umsetzen. - Oxidation von H 2 Es gibt zwei Klassen von Hydrogenasen, - membrangebundene, die die Elektronen in die Atmungskette einschleusen und H 2 sehr gut binden (Km µm) und - cytoplasmatische, die NADH erzeugen. Die meisten Organismen enthalten nur je einen Typ, Alcaligenes eutrophus beide. Unvollständige Oxidation Es entstehen Produkte, die (von anderen Organismen) noch weiter oxidiert werden können. Essigsäurebakterien sind gramnegative begeißelte Stäbchen, z.b. Acetobacter und Acetomonas. Bei den peroxidans - Typen (Acetobacter peroxidans, A. pasteurianum) wird Acetat intermediär angehäuft und dann weiter oxidiert, bei der suboxidans -Gruppe ist Acetat Endprodukt, es fehlt die Succinatdehydrogenase. Eine Alkoholdehydrogenase und eine Aldehyddehydrogenase arbeiten in Folge, sie liegen außerhalb der Cytoplasmamembran und schleusen die Elektronen in die Atmungskette ein. Coenzym ist jeweils Methoxatin, ein Pyrrol-Chinolin. Unvollständige Oxidation Unvollständige Oxidation Alkoholdehydrogenasen sind wenig spezifisch und oxidieren alle (primären und sekundären) aliphatischen Alkohole. Alkoholdehydrogenase CH 3 - CH 2 OH + PQQ CH 3 - CHO + PQQH 2 Aldehyddehydrogenase CH 3 - CHO + PQQ + H 2 O CH 3 - COOH + PQQH 2 CH 3 - CH 2 - OH CH 3 - COOH CH 3 - CH 2 - CH 2 OH CH 3 - CH 2 - COOH CH 3 - CHOH - CH 3 CH 3 - CO- CH 3 CH 2 OH - CHOH - CH 2 OH CH 2 OH - CO -CH 2 OH PQQ = Methoxatin

10 Unvollständige Oxidation Das wird technisch genutzt. Sorbit, das sich einfach aus Glucose herstellen läßt, wird zu Sorbose oxidert, die zur Vitamin C-Produktion dient. Technische Produktion durch Mikroorganismen Besonders Pilze scheiden bei Überangebot von Zuckern Intermediärprodukte des Citrat-Cyclus aus. Durch Limitierung bestimmter Ionen und Spurenelementen (>Enzymmangel, Stoffwechselblock) kann das weiter gesteigert werden. Aspergillus und Penicillium bilden aus Glucose Gluconsäure. Technische Produktion durch Mikroorganismen Technische Produktion durch Mikroorganismen Citronensäure wird von Aspergillus niger industriell produziert. Dazu sind ph 2,5-3,5 nötig, bei höherem ph entstehen Gluconsäure und Oxalsäure. Bei dem sauren ph ist kein steriles Arbeiten nötig. Ausgangsprodukt ist die billige Melasse, nach mehrtägiger Inkubation bei 30 C in offenen Pfannen wird die Citronensäure mit Kalk gefällt. Eisenmangel begünstigt die Produktion, da das Folgeenzym im Citratcyclus, Aconitase, ein Fe 2+ enthält.