Untersuchungen zu molekularen, strukturellen und biokatalytischen Aspekten des Vitamin B1-abhängigen Enzyms Transketolase A aus Escherichia coli.

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1 Untersuchungen zu molekularen, strukturellen und biokatalytischen Aspekten des Vitamin B1-abhängigen Enzyms Transketolase A aus Escherichia coli. Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I Biowissenschaften der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Peter Asztalos geboren am 18. August 1978 in Halle/Saale Gutachter: 1. Professor Dr. G. Hübner 2. Professor Dr. Y. Muller 3. Professor em. Dr. R. L. Schowen Tag der öffentlichen Verteidigung: 20. Februar 2008 urn:nbn:de:gbv: [

2 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Symbole Enzyme AHAS Acetohydroxysäure-Synthase (EC ) DXS 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase (EC ) PDC Pyruvat-Decarboxylase (EC ) PDH Pyruvat-Dehydrogenase (EC ) POX Pyruvat-Oxidase (EC ) TK s Transketolase (EC ) TKA Transketolase A Wildtyp aus Escherichia coli (ohne His 6 -tag) TK Transketolase A Wildtyp aus Escherichia coli mit His 6 -tag Glu 411 Ala Proteinvariante Glu 411 Ala der TK His 473 Ala Proteinvariante His 473 Ala der TK DV Proteindoppelvariante His 26 Ala/His 261 Ala der TK ytk Transketolase Wildtyp aus Saccharomyces cerevisiae htk Transketolase Wildtyp aus Homo sapiens Intermediate C5-ThDP C5-Thiamin C5-Thiazolium C6-ThDP C7-ThDP DHE-ThDP HE-ThDP HL-ThDP L-ThDP PL-ThDP 2-[2-(1,2,3,4-Tetrahydroxy-5-phospho-pentyl)]-ThDP 2-[2-(1,2,3,4-Tetrahhydroxy-5-phospho-pentyl)]-thiamin 2-[2-(1,2,3,4-Tetrahhydroxy-5-phospho-pentyl)]-3,4-dimethyl-5- hydroxyethyl-thiazoliumion 2-[2-(1,2,3,4,5-Pentahydroxy-6-phospho-hexyl)]-ThDP 2-[2-(1,2,3,4,5,6-Hexahydroxy-7-phospho-heptyl)]-ThDP 2-(1,2-Dihydroxyethyl)-ThDP 2-(1-Hydroxyethyl)-ThDP 2-Hydroxylactyl-ThDP 2-Lactyl-ThDP Phosphonolactyl-ThDP Auf die Benennung der Konfigurationen der einzelnen Chiralitätszentren der Intermediate wurde verzichtet.

3 Weitere Abkürzungen und Symbole A 280 Abb. ADP Amp app Apo B3LYP bp CD δ d Da E DFT DTE UV-Absorption bei 280 nm Abbildung Adenosin-diphosphat Ampicillin apparent Apoenzym, Protein ohne Cofaktor(en) Becke-3-Parameter-Lee-Yang-Parr Methode Basenpaare Circulardichroismus chemische Verschiebung (ppm) Schichtdicke (cm) Dalton Absorptionsänderung Dichtefunktionaltheorie 1,4-Dithioerythrit ε Extinktionskoeffizient (M -1 cm -1 ) E4P D-Erythrose-4-phosphat E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure F6P D-Fructose-6-phosphat Ferricyanid Kaliumhexacyanoferrat-(III) FPLC fast protein liquid chromatography Θ Elliptizität (mdeg) [Θ] MRW mean residue weight-elliptizität (deg cm 2 dmol -1 ) G3P D-Glycerinaldehyd-3-phosphat G3P-DH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase GA Glycolaldehyd Gl. Gleichung Gly-Gly Glycylglycin HAHL Hydroxyaceto-hydroxylactat Holo Holoenzym, Protein mit Cofaktor(en) HPA β-hydroxypyruvat IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid k, k app Geschwindigkeitskonstante, apparente Geschwindigkeitskonstante (s -1 ) kb Kilobasenpaar K D K M Dissoziationskonstante (M) Michaelis-Menten-Konstante (M)

4 K I λ LB-Medium MRW MW NADH obs OD PCR PEG pgsj427 PMSF R5P r.m.s. rpm S7P SDS-PAGE Tab. TCA ThDP tkta T M TPI Tris Inhibitorkonstante (M) Wellenlänge (nm) Luria-Bertani-Medium mean residue weight dh. mittlere Molmasse einer Aminosäure: 110 g mol -1 Molekulargewicht (Da) Nicotinamidadenindinukleotid (reduzierte Form) beobachteter Wert optische Dichte Polymerasekettenreaktion Polyethylenglycol Expressionsvektor der bakteriellen Transketolase A Phenylmethylsulfonylfluorid D-Ribose-5-phosphat root mean square, Standardabweichung vom Mittelwert Umdrehungen pro Minute D-Sedoheptulose-7-phosphat Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese Tabelle Trichloressigsäure Thiamindiphosphat Gen für die TKA Wildtyp Schmelztemperatur Triosephosphat-Isomerase Tris (hydroxymethyl)-aminomethan U units, Internationale Einheit (µmol min -1 ) UV ultraviolett X5P D-Xylulose-5-phosphat Anmerkung zur Terminologie Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Anglizismen sind kursiv gedruckt. Für Aminosäuren wurde der Dreibuchstaben-, für Nukleinsäuren der übliche Einbuchstaben-Code verwendet.

5 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG Transketolase Funktionen des Cofaktors ThDP MATERIALIEN & METHODEN Materialien Chemikalien, Enzyme, Bakterien Geräte & sonstige Materialien Molekularbiologische Arbeiten Expression und Reinigung Zellanzucht, homologe Genexpression und Zellernte Proteinreinigung Reinigung der Transketolase Wildtyp ohne His 6 -tag (TKA) Reinigung der Proteine mit His 6 -tag (TK und Varianten) Bestimmung der Molekulargewichte mittels Massenspektrometrie Elektrophoresen für DNA und Proteine Konzentrationsbestimmung von DNA, Proteinen und ThDP (-Analoga) Spektroskopische Methoden Fluoreszenzspektroskopie CD Spektroskopie Kinetische Messungen Bestimmung der enzymatischen Aktivität Schnelle Kinetiken (stopped-flow-absorptionsspektroskopie) H-NMR-Spektroskopie Untersuchungen zur C2-Deprotonierung nach KERN et al. (1997) Intermediatanalyse nach TITTMANN et al. (2003) Röntgenkristallographie Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) GC/MS-Analysen DFT-Rechnungen... 41

6 3. ERGEBNISSE & DISKUSSION Sequenzvergleiche von Transketolase-Primärstrukturen Molekularbiologische Arbeiten Rückmutation zu Transketolase Wildtyp (TKA) Herstellung von active-site-varianten der Transketolase A Insertion einer Sequenz für einen C-terminalen His 6 -tag Expression, Reinigung, strukturelle Integrität der Transketolase A (-varianten) Expression und Reinigung Massenspektrometrische Molekulargewichtsbestimmung Bestimmung des Sekundärstrukturgehalts der Proteine Charakterisierung der Transketolase A (-varianten) Fluoreszenzspektroskopische Bestimmung der Dissoziationskonstanten für ThDP und ThDP-Analoga Enzymatische Aktivität Schnelle Kinetiken ( 1 H-NMR und stopped-flow-absorptionsspektroskopie) Untersuchungen zur C2-Deprotonierung des enzymgebundenen Cofaktors ThDP Strukturelle Untersuchungen von Transketolase A Donorintermediatstrukturen der bakteriellen Transketolase A Struktur des Komplexes von Transketolase A mit Akzeptorsubstrat Strukturen der Holoenzymkomplexe von TK-Varianten mit ThDP sowie des Holoenzymkomplexes vom Wildtypenzym mit N3 -Pyridyl-ThDP Untersuchungen zur Existenz einer iminotautomeren Form des Cofaktors Nachweis einer AHAS-ähnlichen Reaktion der Transketolase A ZUSAMMENFASSUNG Ausblick REFERENZEN ANHANG...131