Forschungszentrum Karlsruhe

Transkript

1 Forschungszentrum Karlsruhe in der Helmholtz-Gemelnschaft Wissenschaftliche Berichte FZKA7106 Biochemische Charakterisierung der Isoprensynthase aus der Graupappel (Populus x canescens (Ait.) Sm.) und ihre Expression in Arabidopsis thaliana L. Anette Bachl Institut für Meteorologie und Klimaforschung von der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln genehmigte Dissertation Forschungszentrum Karlsruhe GmbH, Karlsruhe 2005

2 1 Einleitung Isoprenemission von Pflanzen und ihre Bedeutung für die Atmosphärenchemie Plastidäre Isoprenoidbiosynthese - Der MEP-Stoffwechsel Isoprensynthase - Das Schlüsselenzym der Isoprenbiosynthese Physiologische Funktion der Isoprenbildung bei Pflanzen Ziele der Arbeit 9 2 Material und Methoden Herkunft und Anzucht der verwendeten Organismen, Verwendete Bakterienstämme und ihre Kultivierung Escherichia co//-stämme Agrobacterium tumefaciens Verwendetes Pflanzenmaterial und dessen Anzucht Anzucht von Populus x canescens (Ait.)Sm Anzucht von Arabidopsis thaliana L Verwendete Vektoren und deren Eigenschaften Klonierungsvektoren (pcrii-topo; pcr2.1-topo, pbluescriptll SK) Expressionsvektoren (pgs72, pqe30, pqeöo, pqe60) Transformationsvektoren (pbinar, pmp90) Molekularbiologische Methoden Präparation von Nukleinsäuren Plasmidpräparation DNA-Extraktion aus A. thaliana " RNA-Extraktion aus Blättern und Protoplasten von A. thaliana AA Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren Agarosegelelektrophorese von Nukleinsäuren Polymeraseketten-Reaktion zur DNA-Amplifikation Primerdesign Reaktionsansätze und Temperaturprogramme 22

3 2.2.3 Klonierung und Umklonierung TOPO TA Cloning Kit Restriktion Reinigung und Ligation der DNA Transformation von Bakterien Chemische Behandlung von E. coli TG1 mit CaCI 2 und Transformation Elektroporation und Transformation von A. tumefaciens Selektion transgener Klone DNA-Sequenzierung ' Cycle sequencing" mit Farbstoff-markierten Terminatoren Kapillarelektrophorese und Analyse der Sequenzdaten Transformation von A. thaliana Floral Dip"-Technik Selektion transgener A. thaliana-ur\\en Herstellung und Transformation von Protoplasten aus A.toa/Zana-Blättem Herstellen von Protoplasten aus A. thaliana-b\ä\tern Transiente Transformation der Protoplasten Quantitative PCR mit reverser Transkriptase Umschreiben der mrna in cdna mit reverser Transkriptase Quantitative PCR mit SYBR Green Proteinbiochemische Methoden Herstellung von Proteinextrakten Zellaufschluss von E. coli Reinigung His-Tag-markierter Isoprensynthase über Affinitätschromatographie Zellaufschluss von Blättern Bestimmung der Proteinkonzentration Messung der Isoprensynthaseaktivität 38

4 Synthese von DMADP Standardenzymtest der Isoprensynthase Nachweis von Isopren über gaschromatographische head space" Analyse Bestimmung des nativen Molekulargewichts der Isoprensynthase mittels Gelfiltration über Superdex 200 HR 10/ Bestimmung des DMADP-Gehalts in Blättern von A. thaliana Versuchsaufbau zur Messung der Isoprenemission von transgenen E. coli - Kulturen und A. thaliana In v/vo'nachweis der Isoprenbildung transgener E. coli Messung der Isopren- und Monoterpenemission von A. thaliana Küvettenaufbau Quantifizierung der Isopren- und Monoterpenemission von A. thaliana am GC-MS Verwendete Kits und Bioreagenzien Verwendete Chemikalien und sonstige Verbrauchsmaterialien 50 3 Ergebnisse Herstellen von Derivaten des/sps-gens Markierung der vollständigen ISPS mit einem C-terminalen HA-Epitop Markierung der vollständigen ISPS mit einem C-terminalen His-Tag Funktionsnachweis der rekombinanten /sps-derivate Klonierung des funktioneilen Gens der ISPS in Expressionsvektoren In wvo-nachweis von Isopren aus transgenen E. coli -Kulturen Vergleich der biochemischen Eigenschaften rekombinanter und nativer ISPS Zeitabhängigkeit der Enzymaktivität heterolog exprimierter ISPS Substratabhängigkeit ph-abhängigkeit Temperaturabhängigkeit Natives Molekulargewicht der ISPS Zusammenfassende Tabelle der biochemischen Eigenschaften 73

5 3.4 Transformation von A. thaliana Nachweis der erfolgreichen Transformation von Agrobacterium tumefaciens Selektion transgener A. thaliana-lm\en über Kanamycinresistenz Genomischer Nachweis der Insertion des Resistenz- und des isps- Gens Nachweis über PCR Überprüfung der in A. thaliana inserierten Gensequenz der isps Nachweis der Genexpression der isps und der Isoprenemission transgener A. thaliana-pflanzen Qualitativer Nachweis der /sps-mrna über PCR Nachweis der Isoprenemission transgener A. thaliana-l\n\en Bestimmung der mrna-kopien der isps in transgenen Linien Nachweis der ISPS-Aktivität in Blattextrakten transgener A. thaliana- Linien Transiente Genexperession der isps in A. f/7a//ana-protoplasten Der DMADP-Gehalt von A. toa/zana-blättern 91 4 Diskussion MEP-Stoffwechsel und DMADP-Gehalt als Voraussetzung zur Expression des /sps-gens in A. thaliana Funktionsfähigkeit des /sps-genkonstruktes Höhe der Expression des /sps-gens in A. thaliana Biochemische Eigenschaften der Isoprensynthase und ihrer Derivate Ausblick 103

6 5 Literaturverzeichnis Anhang Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Tabellen Abkürzungsverzeichnis 120