6. Diskussion. Diskussion

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1 6. Nachdem Studien gezeigt hatten, das GM-CSF ein geeignetes Adjuvants für genetische Impfstoffe ist, um zelluläre und humorale Immunantworten zu induzieren, wurde dies hier vergleichend für DNA-Impfstoffe und adenovirale Vektoren untersucht. In verschiedenen Prime/Boost-Immunisierungen wurden dabei Vektoren eingesetzt, die entweder Fusionsproteine (GM-OVA) oder GM-CSF und das Modellantigen Ovalbumin bicistronisch exprimierten. Es konnte gezeigt werden, dass die biologische Aktivität des GM-CSF durch die Anhängung des Antigens nicht beeinträchtigt wurde, was in früheren Studien bereits gezeigt werden konnte [136;137]. In aufgereinigter Form behielt es ebenso die Fähigkeit, FDCP-1 Zellen zur Proliferation anzuregen, wie die Generation von Dendritischen Zellen aus Knochenmark- Vorläufern zu bewirken. Nachdem APC mit dem Fusionsprotein inkubiert wurden, induzierten diese eine verstärkte Proliferation antigenspezifischer CD8 + T-Zellen. Dies zeigt, dass durch die Fusion eine Antigenpräsentation über MHC I-Moleküle erfolgen kann, die für ein lösliches rekombinantes Ovalbumin nur nach Einsatz einer 10-fach höheren Konzentration detektiert wurde. Somit stellt die Antigenaufnahme über GM-CSF-Rezeptoren möglicherweise eine alternative Strategie zur zielgerichteten Antigenbeladung von DZ in vivo dar, wie es für z.b. die C-Typ Lektin Rezeptoren beschrieben ist [ ; ]. Dennoch induzierten die GM-OVA exprimierenden Vektoren, sowohl die Plasmid-DNA als auch der adenovirale Vektor, weder nach einer einzelnen Injektion noch nach kombinierten Prime/Boost-Immunisierungen eine stärkerer CTL-Antwort als die OVA-exprimierenden Vektoren. Unabhängig von der Art des Vektors erhöhte die Expression des Fusionsproteins das IgG1/IgG2a-Verhältnis im Vergleich zu dem Antigen allein, was ein Indiz für eine stärkere Induktion der T H 2-Helferantwort sein mag [95]. In dem hier eingesetzten OVAspezifischen Tumormodell vermittelten jedoch alle Impfansätze eine verzögerte Progression des Tumorwachstums. Dies bestätigt Ergebnisse, die in DNA-Immunsierungen mit GM-CSF- TAA Fusionsproteinen erzielt wurden [137]. Es konnte jedoch keine Korrelation zwischen den induzierten Immunantworten und dem reduzierten Tumorwachstum hergeleitet werden. Dies war aufgrund der sehr unterschiedlichen CTL-Antworten unerwartet. Es wurden auch zu Zeitpunkten der fortschreitenden Tumorprogression in den imunnisierten Mäusen noch hohe OVA-spezifische T-Zellantworten detektiert werden. Dies lässt vermuten, dass andere Mechanismen der Immunantwort für die Kontrolle des Tumorwachstums verantwortlich sind. 79

2 Dennoch erschien eine einzelne DNA-Injektion weniger effektiv zu sein als die einmalige Injektion adenoviraler Vektoren bzw. Prime/Boost-Immunisierungen. In den Prime/Boost-Immunisierungen induzierten hingegen die Vektoren, die GM-OVA exprimieren, geringere CD8 + T-Zellantworten als es für OVA-exprimierende Vektoren zu beobachten war. Die antigenspezifischen T-Zellen besitzen in beiden Fällen ähnliche Funktionalitäten hinsichtlich ihrer Zytokinproduktion (IFN-γ/IL-2) und ihrer Expression von CD107a, einem Marker für Degranulation [168]. Zeitgleich mit der Reduktion der CTL werden jedoch neutralisierende α-gm-csf Autoantikörper in den Tieren detektierbar, die die GM-OVA exprimierenden Vektoren injiziert bekamen Diese können eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung darstellen. Diese Autoimmunität gegen GM-CSF wurde bereits nach Proteinimmunisierungen mit rekombinantem GM-CSF oder GM-CSF-Fusionsproteinen sowohl im Mausmodell als auch im humanen System beobachtet werden [137; ]. Da die rekombinanten Proteine zumeist in E.coli oder Hefen hergestellt wurden, sind Unterschiede in der posttranslationalen Modifizierung der Proteine (z.b. Glykosylierungen) als mögliche Ursache für das Entstehen solcher Autoimmunreaktionen postuliert worden [174;176]. Betrachtet man hingegen die Induktion dieser autoreaktiven Antikörper nach genetischen Immunisierungen mit Antigen-Fusionsproteinen, muss ein alternativer Mechanismus zugrunde liegen, da die GM-CSF Proteine von der Wirtszelle selbst produziert werden. In diesem Fall könnten kreuzreaktive T-Helferzellen für die klonale Expansion von GM-CSFspezifischen Plasmazellen verantwortlich sein. So könnten B-Zellen, deren Immunglobuline spezifisch für körpereigenes GM-CSF sind, das Fusionsprotein aufnehmen und degenerierte OVA-Peptide auf MHC-II Molekülen präsentieren. Die OVA/MHC-II Komplexe würden nun von OVA-spezifischen T-Helferzellen erkannt, wodurch die Aktivierung der B-Zelle und somit die Produktion GM-CSF-spezifischer Antikörper erfolgen kann. Dies stünde im Einklang mit einer früheren Hypothese zur Entstehung von autoreaktiven Antikörpern [177] und Beobachtungen aus Experimenten mit anderen zellulären Fusionsproteinen [178;179]. Die Konsequenzen dieser α-gm-csf Autoantikörper für den Wirt sind nicht vollständig bekannt. So erfolgte in Mäusen die Rekonstitution weißer Blutzellen nach einer Knochenmarks-Transplantation in unveränderter Weise trotz vorhandener Autoantikörper. Ebenso entwickeln diese Tiere eine normale Immunantwort gegen einen Proteinimpfstoff [180]. Dennoch haben Studien an GM-CSF -/- Knock-out Mäusen gezeigt, dass die Induktion einer CD8 + T-Zellantwort gegen eine Peptid-basierte Vakzine inhibiert ist. In diesem Modell wurde auch eine verzögerte Produktion von IgG2a Antikörpern detektiert [138]. 80

3 Obwohl diese Beobachtungen mit den OVA-spezifischen Immunantworten der GM-OVA behandelten Tieren übereinstimmten, konnte keine generelle Beeinträchtigung durch die Vakzin-induzierten Autoantikörper auf den Verlauf nachfolgender Infektionen bestimmt werden. Der Infektionsverlauf des hier eingesetzten murinen Retrovirus (FV) war ebenso unabhängig von der Präsenz der neutralisierenden α-gm-csf Antikörper wie die induzierte virus-spezifische, zelluläre Immunantwort. In Krebspatienten konnten bislang ebenfalls keine pathologischen Veränderungen mit dieser Autoimmunität assoziiert werden [174]. Dennoch können Langzeitfolgen nicht ausgeschlossen werden, so wird beispielsweise die pulmonale Alveolarproteinose auf eine Autoimmunität gegen GM-CSF zurückgeführt[181;182]. Da die hier eingesetzten und andere Fusionsproteine zwischen körpereigenen und Fremdproteinen [178;179] zeigen, dass es möglich ist, die immunologische Toleranz zu durchbrechen, sollte deren Einsatz in genetischen Impfstoffen kritisch hinsichtlich möglicher Konsequenzen durch Autoimmunitäten betrachtet werden. Durch den Einsatz eines bicistronischen Vektors konnte diese Autoimmunität umgangen werden. Obwohl die GM-CSF-Aktivität von diesem Vektor sogar erhöht ist im Vergleich zur GM-CSF-Aktivität des Fusionsproteins (~10-fach), konnten keine αgm-csf Autoantikörper detektiert werden. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Fusion für den Verlust der Toleranz verantwortlich ist, und die OVA-spezifischen T-Helferzellen die αgm-csf- Produktion stimulieren. Lima et al. [137] konnten ebenfalls zeigen, dass eine Koexpression von GM-CSF und TAA nicht zu einer Autoimmunität führt, während die entsprechenden Fusionsproteine es taten. Somit scheint nicht allein die Überexpression des Zytokins für die Induktion der Autoantikörper verantwortlich zu sein. Die bicistronische Expression von GM-CSF beeinflusst im Gegensatz zu den Fusionsproteinen nicht das Verhältnis der OVA-spezifischen Antikörper. Im Vergleich zu den OVA-exprimierenden Vektoren sind sowohl die IgG1- als auch IgG2a-Titer kaum verändert. Aufgrund früherer Studien waren diese Beobachtungen unerwartet. So führt die Koexpression von GM-CSF und dem Amyloid-beta Protein von intranasal verabreichten adenoviralen Vektoren zu einer verstärkten humoralen und T H 2 Antwort [183]. Des weiteren bewirkte die Koexpression von GM-CSF in zahlreichen DNA-Immunisierungen einen Anstieg der antigenspezifischen Antikörperproduktion [40;42; ;177]. Diese unterschiedlichen Ergebnisse zeigen, dass die immunmodulatorischen Eigenschaften von GM-CSF von der Form des Antigens, der Injektionsroute und der Art des verwendeten Vektors abhängig sein können. Daher sind auch die Ergebnisse hinsichtlich der Aktivierung von CD8 + T-Zellantworten durch GM-CSF-Koexpression sehr unterschiedlich. 81

4 So zeigen einige Studien zu DNA-Immunisierungen eine erhöhte CTL-Aktivierung [41;184], während andere kaum einen Einfluss detektieren konnten [127;185]. In dieser Studie induziert die bicistronische Expression von GM-CSF nach dem Prime/Boost Protokoll eine erhöhte CTL-Antwort im Vergleich zum Antigen allein. Aufgrund der Beschaffenheit des bicistronischen Promotors liegt die OVA-Expression unterhalb derer, die von den anderen Vektoren beobachtet werden. Dennoch ist der Anteil der induzierten CTL- Antwort mit ca. 25 % OT-I spezifischer CD8 + T-Zellen deutlich höher als für die OVAexprimierenden Vektoren (ca.11 %) und ist in dieser Höhe zuvor noch nicht beschrieben worden. Die GM-CSF Koexpression führt auch zu einer verstärkten Aktivierung der polyfunktionalen CD8 + T-Zellen, die neben IFN-γ und dem cytotoxischen Marker CD107a auch das proliferations-stimulierende Zytokin IL-2 produzieren. Dieser Zellpopulation wird eine wichtige Bedeutung bei der Ausbildung langlebiger Gedächtnisantworten zugeschrieben. Die Kontrolle chronischer, viraler Infektionen, wie CMV, EBV oder in HIV LTNP scheint von diesen ebenfalls abhängig zu sein [45]. Es konnte gezeigt werden, dass es diesbezüglich von Vorteil ist, die bicistronischen Vektoren sowohl in der initialen DNA-Injektion als auch in der adenoviralen Boost-Immunisierung einzusetzen. Verwendet man sie nur in einem der Immunisierungsschritte und ersetzt sie in dem anderen durch OVA-exprimierende Vektoren, ist die Induktion der polyfunktionalen CD8 + T-Zellen geringer. Diese Beobachtung geht mit einer erhöhten Aktivierung IFN-γ produzierender CD4 + T-Zellen einher. Nach Injektion der bicistronischen Vektoren und einer TCR-spezifischen in vitro-restimulation ist der Anteil der zytokinproduzierenden CD4 + T-Zellen höher als nach Injektion der OVA-exprimierenden Vektoren. Dies lässt auf eine verstärkte T H 1-Helferantwort schließen, die wiederum die Entwicklung und Qualität der CTL-Antworten beeinflussen kann, wie es bereits für andere Immunreaktionen beschrieben ist [ ]. Somit scheint GM-CSF ein geeignetes Adjuvants für Prime/Boost-Strategien mit Plasmid- DNA und adenoviralen Vektoren zu sein, was die Induktion polyfunktionaler T-Zellen begünstigt. Hingegen führt der Einsatz der Fusionsproteine nicht zu der erwarteten Immunogenitätssteigerung. Die beobachtete Suppression der CTL-Antwort ist dabei offenbar eine Konsequenz der biologischen Aktivität des Fusionsproteins, da dieses Phänomen für ein nicht aktives Fusionsprotein, basierend auf rhesusgm-csf, nicht zu beobachten ist. Ebenso induziert die nicht-aktive Variante keine Verschiebung des IgG1/IgG2a-Verhältnisse, obwohl die beiden Fusionsproteine denselben strukturellen Aufbau besitzen und in vergleichbarer Stärke exprimiert werden. Demnach resultieren diese Phänomene entweder aus der induzierten Autoimmunität oder durch die rezeptorvermittelte Antigenaufnahme in vivo 82

5 kommt es zu einer veränderten Antigenpräsentation, die wiederum eine Verschiebung der induzierten Immunantwort in Richtung T H 2 zur Folge hat. Obwohl die GM-OVA Fusionsproteine in vitro eine erhöhte Aktivierung von OT-Ispezifischen CD8 + T-Zellen induzierten, führte diese Strategie zur zielgerichteten Antigenaufnahme in vivo zu gegensätzlichen Ergebnissen. Daher wurde ein alternativer Ansatz zur zielgerichteten Antigenaufnahme im adenoviralen System untersucht. In dieser Studie wurde ein Einzelkettenantikörper, der gegen den DZ-Rezeptor DEC205 gerichtet ist, an das Ovalbumin fusioniert. Analog zu den GM-OVA Fusionsproteinen führten diese in vitro im Vergleich zu einer DZ-unspezifischen Isotypkontrolle des Einzelkettenantikörpers zu einer gesteigerten Antigenpräsentation durch DZ und einer anschließenden Aktivierung transgener OT-I spezifischer T-Zellen. Dass Fusionsproteine aus DEC205-spezifischen Antikörpern und Antigenen zu einer Präsentation auf MHC I Molekülen in vitro und in vivo führen, wurde bereits für die vollständigen Immunglobuline [ ], aber auch für Einzelkettenantikörper gezeigt [120]. Letztere zeigten auch nach Expression von Plasmid- DNA eine erhöhte Induktion zellulärer und humoraler Immunantworten im Vergleich zu unfusionierten Antigenen oder Fusionsproteinen deren Antikörperanteil gegen CD11c, ein weiteres Oberflächenprotein von Dendritischen Zellen, gerichtet ist [120]. Es bleibt jedoch festzuhalten, dass in der zitierten Studie keine Aufspaltung in CD4 + oder CD8 + -Antworten erfolgte und nur die Gesamtmenge an IgG-Antikörpern bestimmt wurde. Im Gegensatz dazu, induzieren in dieser Studie die adenoviralen Vektoren, die die Fusionsproteine aus der unspezifischen Isotypkontrolle und dem Antigen exprimieren, eine stärkere CTL-Antwort als es für die DEC-OVA exprimierenden Vektoren zu beobachten war. Dies zeigt deutlich die Abhängigkeit der Immunantwort von der gewählten Applikationsform der Vakzine. Als Proteinimpfstoff induziert die Isotypkontrolle sogar in Gegenwart starker DZ-Aktivatoren (αcd40-antikörper plus Poly IC) keine detektierbare CTL-Antwort, während die zielgerichtete Form des Antigens eine starke zelluläre Immunantwort auslöst [117;118]. Der adenovirale Vektor hingegen ist selbst so immunogen [62;63], dass er zusammen mit der resultierenden endogenen Antigenexpression eine starke CD8 + T- Zellantwort auslösen kann [189]. Möglicherweise wird dadurch der eigentlich positive Effekt, den man von der zielgerichteten Antigenaufnahme aufgrund der Proteinstudien erwartet, abgeschwächt. Dennoch bewirkt die Fusion an den DEC205-spezifischen Einzelkettenantikörper eine veränderte Immunreaktion gegen das Antigen. 83

6 Neben der reduzierten CTL-Antwort ist auch die Verteilung der antigenspezifischen Antikörper zu einem erhöhten IgG1/IgG2a-Verhältnis verschoben, was wiederum auf eine verstärkte T H 2-Antwort schließen lässt. Diese Beobachtungen sind analog zu den Ergebnissen der genetischen Immunisierungen mit den GM-OVA Fusionsproteinen, die ebenfalls in vitro eine zielgerichtete Antigenaufnahme vermittelten. Daher tritt möglicherweise in beiden Fällen eine veränderte Antigenaufnahme der sezernierten Proteine in vivo auf, die zu einer veränderten T-Zellaktivierung (T H 2) führen. Des Weiteren könnte die zielgerichtete Antigenaufnahmen auch zur Induktion von regulatorischen T-Zellen führen, die somit der CTL-Antwort entgegen wirken würde [98]. Es müssen auch die Wahl des Vektorsystems und die Applikationsroute berücksichtigt werden, die sich von den bisherigen Studien unterscheiden. Fehlende Kostimulatoren, wie αcd40-antikörper oder TLR-Liganden, haben in Studien mit derartigen Proteinimpfstoffen gezeigt, dass eine periphere Toleranz gegen das Antigen induziert werden konnte [83]. Daher sollte untersucht werden, ob die simultane Expression von Immunmodulatoren, scd40l oder GM-CSF, einen Einfluss auf die oben beschriebenen Effekte hat. Keiner dieser Kostimulatoren zeigte einen Einfluss auf die Polarisation der induzierten Immunantwort in Richtung einer T H 2-Helferantwort. In beiden Fällen war eine reduzierte CTL-Antwort für die zielgerichtete Antigenvariante zu beobachten und die dominante IgG1- Antikörperproduktion blieb erhalten. Die Koexpression des scd40l zeigte keine Effekte hinsichtlich der Induktion der zellulären Immunantworten (CD4 + als auch CD8 + ). Dies wiederum steht im Gegensatz zu Beobachtungen früherer DNA-Immunisierungen, wo die Koexpression eines löslichen CD40L-Trimers zu einer verbesserten zellulären als auch humoralen Immunantwort führte [152]. In dieser Studie war lediglich die humorale Immunantwort geringfügig erhöht, wobei dies unabhängig von der Wahl des Antigenfusionsproteins war. Diese Unterschiede könnten wiederum auf die eingesetzten genetischen Vektoren zurückzuführen, die unterschiedlich hohe Mengen des kostimulatorischen Moleküls in vivo produzieren können. Ein weiterer Unterschied besteht in der Form des scd40l. Während der hier eingesetzte lediglich aus einer Exportsequenz und dem Anteil der extrazellulären Domäne des CD40Liganden (AS ), enthält das DNA-Konstrukt zusätzlich einen so genannten Leucin-Zipper, der die Stabilität des Trimers erhöhen soll [152]. Die Stabilität dieser Trimere scheint entscheidend für die Verstärkung der induzierten Immunantworten zu sein. In diesem Zusammenhang zeigen auch stabilere Formen des CD40Liganden, darunter Dimere oder Tetramere des Trimers, eine stärkere Aktivierung als es für einfache Trimere beobachtet wird [157;190]. 84

7 Daher sind diese Konstrukte eine mögliche Alternative zu dem hier eingesetzten scd40l und sollten in weiteren Studien hinsichtlich ihrer Adjuvantwirkung im adenoviralen System untersucht werden. Im Gegensatz zu dem sc40l konnte mit der Koexpression von GM-CSF eine Verstärkung der Immunantworten gezeigt werden. In dieser Studie zeigte sich allerdings kein qualitativer Unterschied in der antigenspezifischen CD8 + T-Zellantwort. Dennoch war der Anteil der polyfunktionalen CD8 + und CD4 + T-Zellen erhöht, wie es auch im ersten Teil der Arbeit zu beobachten war. Dies galt unabhängig von der Spezifität des Fusionsproteins. Insgesamt bestätigt diese Arbeit, dass Prime/Boost-Immunisierungen mit Plasmid-DNA und adenoviralen Vektoren sehr effizient zelluläre und humorale Immunantworten induzieren. Dies wurde bereits gezeigt für das Mausmodell, nicht-humane Primaten und das humane System. Eine weitere Verbesserung dieses System durch den Einsatz des genetischen Adjuvants GM-CSF ist daher eine interessante Beobachtung. Da gezeigt wurde, dass gerade die polyfunktionalen T-Zellen ein entscheidendes Maß für die Qualität der Immunantwort bei chronischen Infektionen darstellen [45], ist die Anreicherung dieser Zellpopulation nach GM-CSF Koexpression von besonderer Bedeutung. Des Weiteren stellt die verstärkte Aktivierung der CD4 + T-Zellen eine Verbesserung da, die hinsichtlich einer präventiven Vakzinierung gegen HIV vorteilhaft sein kann. In diesem Zusammenhang wird es interessant zu sehen sein, ob ebenfalls das Spektrum der Epitope, die von CD4 + und CD8 + T-Zellen nach Immunisierung erkannt werden, erweitert ist. Aufgrund der Variabilität des Virus ist dies ebenfalls von großem Interesse [71;191]. Die zielgerichtete Antigenaufnahme, sowohl durch GM-CSF Fusionsproteine als auch über fusionierte Einzelkettenantikörper, führte nicht zu der erhofften Verstärkung der CTL- Antwort, lieferte dennoch eine starke detektierbare zelluläre Immunantwort. Zusätzlich lässt sich an Hand der Antikörperverteilung eine verstärkte T H 2-Helferantwort vermuten. In diesem Fall gilt es zu untersuchen, ob die Effekte der zielgerichteten Antigenaufnahme bei weniger immunogenen Vektoren oder geringeren Dosen anders sind und eher den berichteten Studien entsprechen [ ]. Insgesamt ist die unterschiedliche Qualität der hier induzierten Immunantworten in geeigneten Infektionsmodellen zu bestätigen, wobei auch die Anforderungen für verschiedene Infektionen zu berücksichtigen sind. So könnte die zielgerichtete Antigenaufnahme, wie sie hier eingesetzt wurde, für Impfstoffe gegen parasitäre Infektionen geeignet sein, deren Schutz auf einer guten T H 2-Antwort oder auf IgG1-Antikörpern basiert [192;193]. 85

8 In weiteren Studien sollen nun die Auswirkungen der hier vorgestellten Ansätze zur Verbesserung der Immunogenität genetischer Impfstoffe in einem SIV-Modell untersucht werden Dies soll sowohl im Maus- als auch im Primatenmodell getestet werden, um möglicherweise bessere Korrelationen für den Einsatz bei einer HIV-Vakzinierung zu erhalten. 86