Facharbeit. Restriktionsverdau am Plasmid puc 18 mit verschiedenen Enzymen

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1 Bernhard Strigel Gymnasium Kollegstufe/ Jahrgang: 2007/ 2009 Memmingen Leistungskurs: Biologie Kollegiat: Stefanie Funk Facharbeit Restriktionsverdau am Plasmid puc 18 mit verschiedenen Enzymen Abgegeben am: Bewertung: Facharbeit: Note: Punkte: Mündliche Prüfung: Note: Punkte: Gesamtergebnis: Note: Punkte: Datum und Unterschrift des Kursleiters:

2 - 2 - Inhaltsverzeichnis Einleitung Material Verwendete Chemikalien Verwendete Laborgeräte Plasmidisolation Allgemeines zu Plasmiden Isolation der Plasmide mit Hilfe eines QIAprep Miniprep Nachweis der isolierten Plasmide durch die Agarosegelelektrophorese Restriktionsendonuklease Verdau Allgemeines zum Restriktionsverdau Ergebnisse der jeweiligen Enzyme EcoRI Hind SalI PvuI Cfr9I oder XmaI TaqI ApaLI ScrFI SpeI Fehleranalyse Literaturverzeichnis Selbstständigkeitserklärung Anhang

3 1. Einleitung Auf der Suche nach dem Thema für meine Facharbeit kamen wir auf die Idee, eine Testreihe mit den im Biotechnologie-Labor vorhandenen Restriktionsenzymen (EcoR, Hind3, SalI, PvuI, Cfr9I oder XmaI, TaqI, ApaLI, ScrFI und SpeI) zu machen. Dazu wird das Plasmid puc 18 (2686 bp) aus E. coli Bakterien isoliert und danach jeweils mit einem der Restriktionsenzyme zusammengegeben. Meine Aufgabe ist es, die Schnittstellen der Restriktionsenzyme zu überprüfen, d. h. zu kontrollieren ob sie an den richtigen Stellen schneiden und ob sie bei puc 18 überhaupt schneiden, also noch funktionsfähig sind. Der Vergleich, ob die Schnittstellen richtig sind ist möglich, durch Vorgaben aus dem Internet ( Obwohl ich nicht an dem von Herrn Schmitt geleiteten Praktikum in unserem Biotechnologie- Labor teilgenommen habe, hat mich die Mikrobiologie als Facharbeitsthema interessiert. Mir war klar, dass es schwierig werden würde, da es in der Mikrobiologie wichtig ist, sehr genau zu sein. Jedoch überwog die Neugier darauf einfach mal genauer zu sehen, wie die Laborarbeit funktioniert. Die nachfolgenden Seiten lassen tiefer in meine Laborarbeit blicken. Beginnend mit der Präparation der Plasmide bis zu dem Versuchsaufbau und den Ergebnissen des Restriktionsendonuklease-Verdaus. 2. Material 2.1 Verwendete Chemikalien QIAprep- Miniprep Restriktionsenzyme (EcoR, Hind3, SalI, PvuI, Cfr9I oder XmaI, TaqI, ApaLI, ScrFI und SpeI)

4 - 4 - Gelladungspuffer Elektrophoresepuffer (TAE- Puffer) DNA Größenstandard Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM Ethidiumbromidlösung 2.2 Verwendete Laborgeräte sterile Eppendorfgefäße Pipetten mit passenden, sterilen Spitzen Heizblock Schüttler Vortexer Zentrifuge Autoklav Gelkammer Laborwaage Spannungsquelle UV-Leuchttisch sterile Reagenzgläser Kühlschrank Gefrierschrank Reinigungssäule 3. Plasmidisolation 3.1 Allgemeines zu Plasmiden Informationen zu den Plasmiden fand ich unter a. Plasmide sind wichtige Werkzeuge der Biochemie, Molekularbiologie und der Genetik. Es sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die mehrere Gene enthalten können. Aufgrund ihrer Größe (zwischen 1 und 25 kbp) ist es, beispielsweise für Versuche im Labor, einfacher die

5 - 5 - Plasmide aus Bakterien zu isolieren, anstatt deren chromosomale DNA, weil diese im Vergleich zu den Plasmiden ziemlich groß ist. Außerdem sind die Informationen in der chromosomalen DNA nicht so kompakt verpackt wie in den Plasmiden, was für einen weiteren Vorteil der Plasmide, speziell bei der Isolation spricht. Abbildung 1: puc 18 Abbildung 2: chromosomale DNA & Plasmid 3.2 Isolation der Plasmide mit Hilfe eines QIAprep Miniprep Die Plasmidisolation wird auch alkalische Lyse genannt. Im Wesentlichen besteht sie aus der alkalischen Lyse und der Reinigung der Plasmid-DNA. Hierbei werden die Zellwände der Bakterien mit einer alkalischen Lösung (Natriumdodecylsulfat) aufgeschlossen und denaturiert. Die brauchbare Plasmidlösung erhält man dann, indem man die Bakterien vom Medium abzentrifugiert und somit die chromosomale DNA und die restlichen Zellbestandteile auf den Boden des Reagenzglases gelangen und nicht mehr mit der Plasmidlösung vermengt sind. Zu Beginn wird ein LB-Flüssigmedium aus 6 ml demineralisiertem Wasser und 0,12 g LB- Zubereitung hergestellt. Dann wird das Flüssigmedium mit Bakterien angeimpft. Es wird eine Übernacht-Kultur hergestellt. Dazu werden 3 ml von dem LB-Flüssigmedium und 5 µl Ampicilin in ein steriles Reagenzglas gegeben. Das Ampicilin wird dazu gegeben, weil das Plasmid puc18 eine Ampicilinresistenz vorweist und somit gewährleistet ist, dass in dem Medium nur puc18 wächst und keine anderen Kulturen. Zu dem Flüssigmedium und dem Ampicilin werden dann noch E. coli Bakterien (kommen im menschlichen und tierischen Darm vor)

6 - 6 - gegeben. Dazu wird eine sterile Pipettenspitze kurz in die Stammkultur eingetaucht und danach wird sie mit Hilfe des Abwerfers in das Reagenzglas geworfen. Das Reagenzglas wird anschließend für 37 C über Nacht in den Schüttler gestellt, dass die Bakterien wachsen können. Mit der Übernacht-Kultur und einem QIAprep Kit (www1.qiagen.com) wird nun die Plasmidisolation durchgeführt. Es werden 1,5 ml von der Bakterienlösung in ein Eppendorfgefäß gegeben und danach 5 Minuten lang zentrifugiert. Anschließend pipettiert man den Überstand heraus, so dass nur der weiße, feste Rest am Boden des Eppendorfgefäßes übrig bleibt. Das übriggebliebene Pellet wird mit 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Man muss das Eppendorfgefäß auf den Rüttler halten, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar sind. Danach werden noch 250 µl Puffer P2 dazugegeben. Man muss das Eppendorfgegäß jetzt vier- bis sechsmal vorsichtig drehen. Vorsichtig drehen deshalb, weil ansonsten die chromosomale DNA zerrissen werden kann und dies eventuell zu Problemen bei der Identifizierung der Plasmide führt. Jetzt werden 350 µl vom Puffer N3 hinzugegeben. Das Eppendorfgefäß muss nun erneut vier- bis sechsmal vorsichtig gedreht werden, um die Flüssigkeiten zu vermischen, ohne die chromosomale DNA zu beschädigen. Die Lösung sollte jetzt trüb werden. Diese Lösung wird dann für zehn Minuten bei rpm zentrifugiert, so dass ein weißes, festes Pellet am Boden des Eppendorgefäßes entsteht. Der flüssige Überstand (ca.850 µl), der nach dem Zentrifugieren in dem Eppendorfgefäß ist, wird in eine Reinigungssäule (vorher in ein Eppendorfgefäß stecken) des QIAprep Kits pipettiert. Danach wird die Lösung nochmals s zentrifugiert und der Rückstand der sich nach dem Zentrifugieren im Eppendorfgefäß befindet wird verworfen. In die Reinigungssäule werden nun 0,5 ml des Puffers PB pipettiert. Diese Lösung muss wieder für s in die Zentrifuge gegeben werden. Um die Reinigungssäule zu reinigen, muss man 0,75 ml Puffer PE dazugeben und erneut für s zentrifugieren. Der Rückstand der sich nach diesen Schritten im Eppendorfgefäß befindet wird verworfen und die Reinigungssäule wird danach für eine Minute zentrifugiert, um den restlichen

7 - 7 - Reinigungspuffer zu entfernen. Jetzt muss die Reinigungssäule in ein neues, steriles Eppendorfgefäß gesteckt werden. Um die DNA schließlich aus der Säule zu lösen, werden 50 µl demineralisiertes Wasser dazugegeben. Hier benutzen wir Wasser anstatt dem vorgegebenen Puffer EB, weil der Puffer bei den späteren Schritten mit den Enzymen stören könnte. Die Reinigungssäule mit dem demineralisiertem Wasser wird nun für eine Minute stehen gelassen und anschließend muss sie für eine Minute zentrifugiert werden. Der enstandene Rest, der sich nach dem Zentrifugieren im Eppendorfgefäß befindet, ist die Plasmidlösung Im Anhang befindet sich eine bildliche Darstellung der Plasmidisolation. 3.3 Nachweis der isolierten Plasmide durch die Agarose-Gelelektrophorese Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine molekularbiologische Methode, um Nukleinsäure- Stränge (RNA oder DNA) nach ihrer Größe zu trennen. ( Hierbei wird ein Gel als Trägermedium verwendet. Das Gel wirkt bei der Elektrophorese wie ein Sieb. Das heißt, dass die kurzen DNA-Stücke schneller zur Anode wandern, als die langen und ringförmigen DNA-Stücke. Auch kann man die Porengröße des Gels durch die Konzentration von Agarose festlegen. Die Agarose-Gelelektrophorese wird in einer Gelkammer durchgeführt, die man nach dem Beladen mit der zu identifizierenden DNA an eine Stromquelle anschließt. Da die DNA-Fragmente negativ geladen sind wandern sie immer von der Kathode zur Anode. Zur Identifizierung der DNA-Bruchstücke lässt man in dem Gel einen Marker (z. B. von Fermentas) mitlaufen.

8 - 8 - Abbildung 3: Legende zum verwendeten Größenstandard Zur Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese habe ich mich an das Durchführungsprotokoll von Herrn Schmitt gehalten. Weitere Informationen zur Gelelktrophorese fand ich im Internet unter d. Man beginnt mit der Herstellung eines 1%-igen Agarosegels. Hierzu werden 0,2 g Agarose in eine Schraubdeckelflasche gegeben und mit 20 ml TAE-Puffer aufgegossen. Der TAE-Puffer hat einen leicht alkalischen ph-wert und soll eine Denaturierung der DNA verhindern. Danach gibt man einen Rührfisch in die Flasche und kocht das Gel unter Beobachtung in der Mikrowelle auf. Man muss aufpassen, dass kein Siedeverzug entsteht und beim Rausnehmen der Flasche aus der Mikrowelle unbedingt Lederhandschuhe tragen, weil das Gel sehr heiß wird. Jetzt wird das heiße Gel vorsichtig in die Gelkammer gegossen und man muss den Kamm einsetzen, solange das Gel noch flüssig ist. Nach dem Abkühlen des Gels (es wird milchig-trübe) wird der Kamm entnommen. Anschließend beginnt die Vorbereitung der Plasmide für die Gelelektrophorese. Dazu werden 5 µl der Plasmidlösung mit 2 µl Gelladungspuffer gemischt. Der Gelladungspuffer besteht aus Glycerin und zwei Farbstoffen und sorgt durch das Glycerin dafür, dass die Proben, die in die Geltaschen pipettiert werden nicht wieder heraus diffundieren. Die Farbstoffe wandern parallel zu der Mischung aus Plasmidlösung und Gelladungspuffer und dienen zur Kontrolle während der Elektrophorese. Vor dem Beladen der Taschen wird TAE-Puffer in die Gelkammer gegossen bis das Gel leicht bedeckt ist. Nun beginnt das Befüllen der Geltaschen.

9 - 9 - Man pipettiert zuerst 5 µl des Markers Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM in die rechte äußere Tasche. Dann kommen die zu identifizierenden Plasmidstämme in das Gel und schließlich in die linke äußere Tasche nochmals 5 µl des oben genannten Markers. Hierbei darauf achten, dass man die Reihenfolge der Proben vor dem Lauf des Gels schriftlich festhält. Schließlich wird der Gelelelktrophoreseapparat an eine Spannungsquelle angeschlossen (Polung beachten). Dann wird die Spannungsquelle eingeschaltet. In unserem Fall waren es ca. 100 Volt. Danach lässt man das Gel für ungefähr 1, 5 Stunden laufen, bis die blaue Bande fast das Ende des Gels erreicht hat. Um das Gel auszuwerten wird es von einer Lehrkraft in einer Ethidiumbromidlösung gefärbt und anschließend auf einen UV-Leuchttisch gelegt. Diese Arbeit übernimmt ein Lehrer, weil Ethidiumbromid krebserregend ist. Das UV-Licht macht die Banden der gewanderten Plasmidstämme und des Markers sichtbar. Abbildung 4: Gelelektrophorese 4. Restriktionsendonuklease Verdau 4.1 Allgemeines zu Restriktionsendonuklease-Verdau Restriktionsenzyme werden auch als Restriktionsendonukleasen bezeichnet. Sie sind DNAspaltende Enzyme und werden aus Bakterien gewonnen. Dort schützen sie den Mikroorganismus vor zum Beispiel Bakteriophagen, indem sie die Phagen-DNA

10 zerschneiden, bevor sie repliziert wird. Heute sind sie aber auch ein wichtiges Werkzeug der Molekularbiologie. Zur Durchführung des Versuches hielt ich mich an das Durchführungsprotokoll von Herrn Schmitt und zusätzliche Informationen fand ich auf der Internetseite: c. In diesemversuch soll das isolierte Plasmid puc 18 mit den Restriktionsenzymen EcoR, HindIII, SalI, PvuI, Cfr9I oder XmaI, TaqI, ApaLI, ScrFI und SpeI verdaut werden. Anschließend wird durch eine Gelelektrophorese festgestellt, ob der Verdau erfolgreich war. Die Abläufe, die nun folgen, müssen insgesamt mit jedem Enzym einzeln gemacht werden. In ein steriles Eppendorfgefäß werden 16 µl steriles, demineralisiertes Wasser, 1 µl Plasmidlösung, 2 µl 10-fach Puffer und 1 µl von der jeweiligen Restriktionsenzymlösung gegeben. Man muss darauf achten, dass man bei jedem Enzym den richtigen Puffer benutzt. Diese Informationen findet man unter für EcoRI den Puffer EcoRI für Hind III den Puffer R für SalI den Puffer O für PvuI den Puffer R für Cfr9I oder XmaI den Puffer Cfr9I für TaqI den Puffer TaqI für ApaLI den Puffer Tango für ScrFI den Puffer O Das Enzym SpeI konnte nicht getestet werden, da dieses Restriktionsenzym puc 18 nicht schneidet. Nach dem Zusammengeben der verschiedenen Flüssigkeiten werden alle befüllten Eppendorfgefäße bis auf das mit dem Restriktionsenzym TaqI für 50 Minuten bei 37 C in den Inkubator gegeben. Auf die Mischung mit TaqI wird vor dem Inkubieren eine Paraffin-Öl- Schicht gegeben, weil sie zwar auch für 50 Minuten in den Inkubator muss, jedoch stellt sich bei dieser Restriktionsendonuklease die Enzymaktivität erst bei 65 C ein und somit würde die Flüssigkeit ohne diese Öl-Schicht verdampfen. Zur Überprüfung, ob der Restriktionsverdau funktioniert hat, macht man wie bei der Plasmidisolation eine Gelelektrophorese. Für diese Gelelektrophorese muss man ein 0,8%iges

11 Agarosegel herstellen. Dazu benötigt 0,16 g Agarose, die man dann mit TAE-Puffer auf 20 ml aufgießt. Diese Mischung kocht man wieder unter Beobachtung in der Mikrowelle. Beim Rausnehmen darauf achten, Lederhandschuhe zu tragen, weil das gekochte Gel nun sehr heiß ist. Das heiße, flüssige Gel wird nun in die Gelkammer gegossen und sofort danach wird der Kamm eingesetzt. Wenn das Gel milchig-trübe wird ist es kühl und der Kamm kann wieder entfernt werden. Jetzt muss man wieder den Marker( Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM ) links und rechts außen in die Taschen füllen und zwischen die zwei mit dem Marker gefüllten Taschen kommen die vorbereiteten Lösungen mit den Restriktionsenzymen. Danach wird die Gelkammer wieder an eine Stromquelle angeschlossen und die Restriktionsenzyme werden für ca. eine Stunde bei 100 V laufen gelassen. Die nachfolgende Abbildung zeigt eine schematische Darstellung, wie die Enzyme im Gel laufen sollen. Abbildung 5: Gelsimulation mit allen verwendeten Enzymen 4.2 Ergebnisse der jeweiligen Enzyme Als Ergebnis des Restriktionsverdaus müssen folgende Schnittstellen sichtbar sein:

12 EcoRI Abbildung 6: Schnittstelle von EcoRI Bei EcoRI gibt es eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 450 und 451 Basenpaaren HindIII Abbildung 7: Schnittstelle von HindIII Bei HindIII gibt es eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 399 und 400 Basenpaaren SalI Abbildung 8: Schnittstelle von SalI Bei SalI gibt es eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 417 und 418 Basenpaaren.

13 PvuI Abbildung 9: Schnittstellen von PvuI Bei PvuI gibt es zwei Schnittstellen. Sie befinden sich zwischen den Basenpaaren und Es entsteht ein Fragment aus 896 Basenpaaren und eins aus 1790 Basenpaaren Cfr9I oder XmaI Abbildung 10: Schnittstelle von XmaI Bei XmaI entsteht eine Schnittstelle. Sie befindet sich zwischen 434 und 435 Basenpaaren TaqI Abbildung 11: Schnittstellen von TaqI Bei TaqI gibt es vier Schnittstellen. Sie befinden sich zwischen den Basenpaaren , , und Es entstehen Fragmente der Länge 30, 458, 754 und 1444 Basenpaare.

14 ApaLI Abbildung 12: Schnittstellen von ApaLI Bei ApaLI gibt es drei Schnittstellen. Sie befinden sich zwischen den Basenpaaren , und Es entstehen Fragmente der Länge 497, 943 und1246 Basenpaare ScrFI Abbildung 13: Schnittstellen von ScrFI Bei ScrFI gibt es zwölf Schnittstellen: Basenpaare Basenpaare Basenpaare Basenpaar Basenpaare Basenpaare Basenpaare Basenpaare Basenpaare Basenpaare Basenpaare Basenpaare

15 SpeI Von SpeI konnten bei dem Plasmid puc 18 keine Schnittstellen gefunden werden, weil es puc 18 wahrscheinlich gar nicht schneidet. 5. Fehleranalyse Bei der ersten Übernacht-Kultur sind keine Bakterienstämme gewachsen. Mögliche Fehlerquellen hierbei können sein, dass wir entweder unsauber gearbeitet haben und zum Beispiel die Pipettenspitze verschmutzt war, oder die tiefgefrorenen Bakterien, die wir benutzt haben, waren tot. Daraufhin haben wir erneut eine Übernacht-Kultur hergestellt, diesmal aber mit anderen Bakterien. Diese Bakterien haben wir dann auch für die Plasmidisolation und den Restriktionsverdau verwendet. Dabei kam dieses Ergebnis heraus: Abbildung 14: Ergebnis des Restriktionsverdaus im Labor Auf diesem Foto kann man eigentlich nur die Marker rechts und links am Rand gut erkennen. Die Bahnen der Restriktionsenzyme sind kaum sichtbar und haben beim Vergleich mit den vorgegebenen Schnittstellen(www. zu keinem sinnvollen Ergebnis geführt. Jedoch stellte sich nach dem Restriktionsverdau heraus, dass wir einen Fehler bei der Plasmidisolation gemacht haben. Wir haben erst den Puffer PE und dann PB in die Reinigungssäule gegeben. Dies ist aber die falsche Reihenfolge. Es wird erst PB und dann PE hineingegeben. Daraufhin haben wir nochmals eine Übernacht-Kultur gemacht. Diesmal mit einer höheren Ampicilinkonzentration, so dass wirklich nur puc 18 wachsen

16 konnte. Mit dieser Übernacht-Kultur haben wir dann eine Plasmidreihenuntersuchung (Cracking Methode) durchgeführt, um zu prüfen, ob die Bakterien kaputt waren, also das Plasmid nicht funktioniert. Die Informationen für diesen Versuch habe ich unter b gefunden. Dazu zentrifugiert man 50 µl von der Bakterienlösung. Der Überstand wird verworfen und dann werden 75 µl Aufschlusspuffer dazugegeben und alles für 5 Minuten bei 70 C ind den Heizblock gegeben. Jetzt werden die Proben 5 Minuten in einem Eisbad abgekühlt und nach dem Abkühlen werden die Ansätze 5 Minuten lang zentrifugiert. Nun ist es wichtig mit dem Überstand weiter zu arbeiten. Es werden 8 µl Überstand und 2 µl Gelladungspuffer zusammengegeben und dann wird mit den Proben eine Gelelektrophorese gemacht. Bei dieser Gelelektrophorese kam heraus, dass die Bakterien entweder kaputt waren, oder zu wenig Plasmide hatten. Abbildung 15: Cracking-Methode im Labor Eine weitere Fehlerquelle kann das Kit sein. Jedoch haben wir für die Cracking-Methode ein neues, noch nie benutztes Kit benutzt, was heißt, dass es nicht daran liegen kann, weil es noch nicht verschmutzt gewesen ist. Die letzte Fehlerquelle, die noch in Betracht gezogen werden muss, ist das demineralisierte Wasser, das wir verwendet haben. Es hatte wahrscheinlich nicht den richtigen ph-wert.

17 6. Literaturverzeichnis MÜLHARDT, Cornel, 2003: Der Experimentator-Molekularbiologie/Genomics, Spektrum akademischer Verlag Heidelberg, 4. Auflage, ISBN SCHMITT Patrick, 2008: Einführung in die Grundarbeitstechniken der Molekularbiologie Internetquellen [Stand: ] www. [Stand: ] a: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] b: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] c: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] d: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ]

18 QIAGEN, 2003: Qiagen MinElute Handbook, MinElute Gel Extraction Kit Protocol using a microcentrifuge [Stand: ] www1.qiagen.com vom Abbildungen Abbildung1:pUC18 ( ucleicacids/img/npuc18_19.gif) Abbildung 2: chromosomale DNA & Plasmid ( Abbildung 3: Legende zum verwendeten Größenstandard ( Abbildung 4: Gelelektrophorese ( Abbildung 5: Gelsimulation mit allen verwendeten Enzymen, zusammengestellt mit www. Abbildungen 6-13: Schnittstellen der Enzyme www. Abbildung 14: Quelle; Schmitt; Patrick: Persönliche Mitteilung Abbildung 15: Quelle: Schmitt; Patrick: Persönliche Mitteilung

19 7. Selbstständigkeitserklärung Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe. Bad Grönenbach, den (Unterschrift des Kollegiaten)

20 8. Anhang

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22 = Zentrifuge = Eppendorfgefäß = Puffer = Reinigungssäule