Fortbildung für Biologen an der Oranienschule

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1 Fortbildung für Biologen an der Oranienschule Am fand die erste ganztägige schulinterne Lehrerfortbildung für Biologen an der Oranienschule unter der Leitung von Frau Dr. Wismar und Herrn Bender statt. Herr Bender konnte für diese Veranstaltung Frau Dr. Wismar von der Immanuel-Kant-Schule in Rüsselsheim gewinnen, die über langjährige Berufserfahrung auf dem Gebiet der Molekularbiologie verfügt. Im Zentrum standen zunächst einfache Versuche für die Schule zur Isolierung genomischer DNA aus Zwiebeln, Banane, Tomate und menschlicher Mundschleimhaut. Hiernach konnten bakterielle Plasmide aus Sicherheitsstämmen isoliert und anschließend wie die isolierte genomische DNA einer Restriktion unterzogen werden. Die Restriktionsfragmente wurden anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt und angefärbt. Da sich diese Versuche auch fächerübergreifend im Rahmen biologischer und chemischer Projekte einsetzen lassen, wurde der Teilnehmerkreis im Vorfeld für die Lehrer im Vorbereitungsdienst der Fachdidaktikseminargruppe von Herrn Bender erweitert. Es ist geplant die schulinterne Fortbildung im jährlichen Rhythmus fortzusetzen. Nachfolgend ist das Tagesprogramm einschließlich der durchgeführten Versuchsansätze angefügt. Viel Vergnügen beim Nachkochen! Peter Bender

2 2 Tagesablauf Fortbildung Gentechnologie 9:00 Begrüßung 9:15 Vorstellung Methode Isolierung genomischer DNA aus Pflanzenzellen Isolierung genomischer DNA aus Mundschleimhaut Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien Phosphat- und Zuckernachweis für DNA 9:45 praktische Ausführung einer Methode (GA) 10:45 Pause 11:00 praktische Ausführung einer weiteren Methode (GA) 12:00 Besprechung Restriktionsverdau und Gelelektrophorese 12:15 Durchführung Restriktionsverdau 12:45 Herstellung der Agarosegele 13:30 Mittagspause 14:30 Beladen der Agarosegele 14:50 Theorie Auswertung von Agarosegelen Herstellung einer Restriktionskarte 15:20 Färben der Agarosegele 15:50 Entfärben der Agarosegele und Auswertung 16:15 Abschlussbesprechung

3 3 Versuch: DNA-Isolierung Zeitaufwand: Vorbereitung 10 min; Durchführung 30 min Materialien: Messer, Mörser, Reagenzglas, Feinsieb, Trichter, Wasserbad, Teelöffel, Glasstab, zwei 100 ml Bechergläser, Stopfen, Kaffeefilter Zwiebel, Tomate, Banane o.ä. Chemikalien: Ethanol 98%, Spülmittel,, Kochsalz, Feinwaschmittel, Wasser Durchführung: In ein Becherglas gibt man 30 ml Wasser, _ Teelöffel Salz (erhöht die Löslichkeit der DNA) und 2-3 Teelöffel Spülmittel (bricht die Zellmembranen auf) und mischt gut. Ein mittelgroße Zwiebel (alternativ Tomate oder Banane) wird halbiert, möglichst klein geschnitten und in den Mörser gegeben. Die Stücke werden im Mörser unter Zugabe der vorbereiteten Lösung (je nach Mörsergröße diesen Schritt evtl. in zwei Hälften durchführen) vorsichtig zerrieben (DNA zerreißt sonst). Das entstandene Mus wird durch ein Feinsieb in ein frisches Becherglas umgefüllt. Das Filtrat wird nach Zugabe einiger Körner Feinwaschmittel für 10 Minuten in ein 60 C Wasserbad gestellt, um die DNA unter Einwirkung des Spülmittels aus den Kernen freizusetzen und gleichzeitig die DNasen zu denaturieren. Danach wird die Lösung kurz abgekühlt, in ein Reagenzglas filtriert (max. 1/3 gefüllt) und mit gleichem bis doppeltem Volumen Ethanol 98% überschichtet. Man verschließt das Reagenzglas mit einem Stopfen und kippt es vorsichtig einige Male hin und her. Beobachtung: Nach Zusatz von Ethanol und vorsichtigem Mischen beobachtet man zunächst eine Schlierenbildung. Dann wird die Lösung langsam klar und eine fadenförmige, ausgefranste, unlösliche Struktur wird sichtbar die DNA. Mit einem feinen gebogenen Glasstab (z.b. zu einem Haken geschmolzene Pasteurpipette) kann die DNA entnommen, in 70% Ethanol gewaschen und in dest. Wasser gelöst werden und steht für weitere Versuche zur Verfügung. Material für den Unterricht: Arbeitsblätter der Fachdidaktik Uni Bonn

4 4 Zucker-Nachweis aus der DNA-Lösung Zeitaufwand: Vorbereitung 10 min ; Durchführung 35 min Geräte: Pipette Material: DNA-Lösung Reagenzglas, Becherglas, Bunsenbrenner, Abzug, Chemikalien: Dische Reagenz (0,1g Diphenylamin, 0,25 ml konz. Schwefelsäure, 9,75 ml konz. Essigsäure, vom Lehrer anzusetzen) Durchführung: 1 ml DNA-Lösung wird in ein Reagenzglas gegeben und mit 2 ml Dische-Reagenz versetzt. Das Gemisch wird unter dem Abzug in ein Becherglas mit Wasser gestellt und für zehn Minuten gekocht (Hydrolyse der DNA). Beobachtung: Eine deutliche Blaufärbung zeigt die Anwesenheit von Zucker. Erklärung: Bei dieser Nachweisreaktion erfolgt zunächst Oxidation von Diphenylamin zu Tetraphenylhydrazin, das unter dem Einfluss der Schwefelsäure eine Benzidin-Umlagerung erfährt. Das so entstehende Zwischenprodukt wird dann zum blauen N,N -Diphenyldiphenochinondiiminsulfat oxidiert.

5 5 Phosphatnachweis in der DNA-Lösung Zeitaufwand: Vorbereitung 5 min; Durchführung 10 min Geräte: Reagenzgläser, Becherglas, Bunsenbrenner, Dreifuss, Abzug Material: DNA-Lösung, 2%ige Natriumphosphatlösung Chemikalien: konz. Salpetersäure, 2%ige Ammoniummolybdatlösung Durchführung: 2 ml DNA-Lösung werden mit 2 ml konz. Salpetersäure versetzt. Als Positivkontrolle werden 2 ml der Natriumphosphatlösung mit 2 ml konz. Salpetersäure versetzt. Beide Reagenzgläser werden unter dem Abzug in ein Becherglas mit Wasser gestellt und für zehn Minuten gekocht (Hydrolyse der DNA). Nach dem Erkalten werden 2 ml der Ammoniummolybdatlösung zugegeben. Beobachtung: Es bildet sich bei der Phosphatlösung ein gelber Niederschlag,. Im Reagenzglas mit der DNA- Lösung ist ebenfalls ein Niederschlag (schwach gelb) zu beobachten, der die Anwesenheit von Phosphat in der DNA-Lösung beweist. Erklärung: Ammoniummolybdatlösung fällt aus phosphathaltiger salpetersaurer Lösung das gelbe Ammoniumsalz der 12-Molybdo-1-phosphorsäure aus. Da auf 12 Atome Molybdat nur 1 Atom Phosphorsäure kommt, muss Molybdat im Überschuss zugegeben werden. Empfehlung: Lehrerdemonstrationsversuch

6 6 Isolierung von eigener genomischer DNA Zuerst wird 2 ml Spüli/Kochsakz-Lösung in ein Schnappdeckelglas pipettiert. Zur Isolierung unserer genomischen DNA werden Zellen der Mundschleimhaut verwendet. Hierzu ist es notwendig, dass der Mund möglichst trocken ist. Spucke herunterschlucken und dann ca. _ Minute bei leicht geöffnetem Mund durch die Nase atmen. Im Anschluss mit einem Holzstäbchen oder Q-tip die Innenseiten beider Backen sowie die Unterseite der Zunge etwa zwei Minuten sanft abreiben. Es sollen dabei möglichst viele Zellen gewonnen werden. Je mehr man reibt und je weniger Spucke sich im Mund befindet desto größer ist die Ausbeute. Die gesammelten Zellen werden in die Lösung I im Schnappdeckelglas überführt. Hierzu verbleibt das Stäbchen im Glas und es wird ca. 1 Minute leicht gerührt. Das Spülmittel sorgt für das Aufbrechen der Zellmembranen und das Salz erhöht die Löslichkeit der freigesetzten DNA. Die Lösung wird für 10 Minuten in einem C warmen Wasserbad (Becherglas) inkubiert. Dies inaktiviert die ebenfalls im Zelllysat vorhandenen DNasen. Nur wird eine kleine Spatelspitze Feinwaschmittel zugegeben. Die im Feinwaschmittel enthaltenen Proteasen zerstören die Proteine. Abschließend werden 4 ml eiskalter Ethanol zugegeben. Hierdurch fällt die hochmolekulare genomische DNA flockig aus. Die gewonnenen DNA kann in dieser Form aufbewahrt, den Schülern z.b. in Eppendorf-Caps mitgegeben oder für PCR-Versuche wie beim Fingerprinting verwendet werden.

7 7 Lösungen und Puffer 50 x TAE 2 M Tris Base 0,5 M Eisessig 0,05 M EDTA ad 100 ml mit deionisiertem Wasser 10 x TBE 10,8 g Tris Base 6 g Borsäure 2 mm EDTA ad 100 ml mit deionisiertem Wasser Alkalische Lyse (Plasmid-DNA Präparation) Lösung I Lösung II Lösung III LB-Medium 50 mm Glucose 25 mm Tris HCl (ph 8,0) 10 mm EDTA 0,2 M NaOH 1 % SDS 3 M Kaliumacetat 11,5 ml Eisessig 88,5 ml dest. Wasser 10 g Casein-Pepton 5 g Hefeextrakt 10 g Natriumchlorid aufgefüllt auf 1 Liter mit deionisiertem Wasser ph bei Bedarf mit NaOH auf 7,5 einstellen nach dem Aufkochen (Sterilisieren) auf 50 C abkühlen und 50 mg Ampicillin zugeben. LB-Agar wie LB-Medium, aber incl. 15 g Agar-Agar Restriktionsverdau und Gelelektrophorese Bam HI 10U/µl Sal I 10U/µl 10 x One phor all restriction buffer Pharmacia loading buffer 0,7 1,5 % Agarose (je nach gewünschtem optimalen Trennbereich) in 1 x TAE oder TBE Azur Blau Chlorid - Lösung

8 8 Restriktionsverdau und Gelelektrophorese I Restriktionsverdau Es werden folgende Ansätze zusammen pipettiert: A genomische DNA 1 µl Bam HI 1 µl Dest. Wasser 7 µl C Plasmid DNA 1 µl Bam HI 1 µl dest. Wasser 7 µl B Kontroll-Plasmid 1 µl Bam HI 1 µl dest. Wasser 7 µl D Plasmid DNA 1 µl Sal I 1 µl dest. Wasser 7 µl E Plasmid DNA w 1 µl Bam HI 1 µl Sal I 1 µl dest. Wasser 6 µl Alle Ansätze werden für 1 Stunde in ein 37 C Wasserbad gestellt. Der Verdau kann anschließend auf Eis oder auch mehrere Wochen bei 20 C aufbewahrt werden. II Vorbereitung der Gele Für die 4 Gelkammern wird gemeinsam die Agaroselösung in Blaudeckelflaschen angesetzt. Für die ersten zwei Kammern 0,8 g Agarose in 100 ml Elektrophorese-Puffer, für die zweiten 2 Kammern 1,2 g Agarose in 100 ml Elektrophoresepuffer. Die beiden Ansätze werden ca. 2 Minuten bei mittlerer Intensität in der Mikrowelle erhitzt. Lösung mit einem Tuch oder Handschuh entnehmen, umschwenken und sofern noch Schlieren zu sehen sind erneut erhitzen. Sobald eine klare Lösung erreicht ist, wird diese in einem Becherglas mit kaltem Wasser auf C abgekühlt und DNA die Gele in der Gelkammer gegossen. III Gelelektrophorese Für jede Gruppe steht eine separate Gelkammer zur Verfügung. Sobald das Gel erstarrt ist, können die Keile entfernt und die Kammern mit Elektrophoresepuffer gefüllt werden. Hierbei muss das Agarosegel vollständig mit Puffer bedeckt sein. Nun werden die Kämme vorsichtig entfernt. Zu den 10 µl Reaktionsansatz werden 2 µl Loading Puffer (blau) gegeben. Der Ansatz wird komplett in eine Tasche des Gels pipettiert. Folgende Reihenfolge wird empfohlen:

9 1. genomische DNA unverdaut 2. genomische DNA verdaut 3. Kontroll-Plasmid unverdaut 4. Kontroll-Plasmid Bam HI 5. DNA Marker 6. Plasmid DNA Bam HI 7. Plasmid DNA Sal I / Bam HI 8. Plasmid DNA Sal I 9. Plasmid DNA unverdaut 9