Auswirkungen von Hyperoxie auf die Physiologie humaner Hautzellen

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1 Auswirkungen von Hyperoxie auf die Physiologie humaner Hautzellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades des Departments Biologie der Fakultät der Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Universität Hamburg vorgelegt von Nils Peters aus Pinneberg Hamburg 2005

2 Inhaltsverzeichnis I.Einleitung Sauerstoff - Charakter und Bedeutung für Lebensformen Sauerstoff und seine Derivate Darstellung der physikalischen und chemischen Sauerstoffaktivierungen Kurzer Überblick über biologisch relevante Sauerstoff -und Stickstoffspezies Oxidativer Stress - Definition, Konzentration, Adaptation und Wirkung Exogene freie Radikale Endogene freie Radikale Enzymatische ROS-Generierung Die NADPH-Oxidase Die Xanthinoxidase Weitere Superoxidanion generierende Enzyme Das Superoxidanion - eine spezielle reaktive Sauerstoffform Antioxidative Schutzmechanismen Glutathion und Glutathion-Peroxidasen Die Haut als Organ Morphologie der Haut Die kutane Aufnahme atmosphärischen Sauerstoffs Die Hyperbare Oxygenation (HBO) - Die Bedeutung von Sauerstoff für die Wundheilung Kollagen und Prokollagen Mitogen aktivierte Proteinkinasen (MAP-Kinasen) Der programmierte Zelltod Material und Methoden Zellisolierung und -pflege Hyperoxische und normoxische Bedingungen Bestimmung der Esteraseaktivität Bestimmung des ROS-Status durch Messung des zytoplasmatischen Peroxidstatus Bestimmung von Superoxidanionen durch Dihydroethidium (HE) 33

3 2.6 Bestimmung der relativen Zellzahl durch Ethidiumhomodimer-1 (EthD-1) Bestimmung der Zellproliferation (BrdU) Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Bestimmung der Glutathion-Peroxidase Aktivität Bestimmung von GSH/GSSG mittels LC-MS/MS Hemmung der NADPH Oxidase Bestimmung der Apoptose durch ELISA Kollagenassay - Die Bestimmung von Prokollagen Proteinbestimmung mit dem BCA-Test Bestimmung der Phosphoproteine JNK, ERK und p 38 MAPK am BIO-PLEX Western- Blot Analyse SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese(SDS-PAGE) Verwendete Lösungen Halb-Trocken-Blot Immunchemische Detektion Verwendete Lösungen Messung der O2-Konzentration mit Hilfe des "Needle Type Fiber-Optic Oxygen Microsensor" Der Oxidative-BurstAssay Weitere Chemikalien Ziele der Arbeit Ergebnisse Bestimmung der (^Sättigung im Medium Definition von Hyperoxie Folgeeffekte unterschiedlicher Hyperoxie-Inkubationszeiten Auswirkungen unterschiedlicher Hyperoxie-Inkubationszeiten auf die Generierung Reaktiver Sauerstoffspezies Veränderung der Proliferation unter Hyperoxie Auswirkungen der Hyperoxie auf die Membranintegrität der Plasmamembran von Fibroblasten Bestimmung der Membranintegrität mittels Ethidiumhomodimer Auswirkungen unterschiedlicher Hyperoxie- Inkubationszeiten auf die Esteraseaktivität 57

4 4.3.5 Aktivist der Glutathion-Peroxidase (GPx) unter Hyperoxie Zusammenhang zwischen Hyperoxie und apoptotischem Zelltod Anstieg der Prokollagensynthese durch Hyperoxie Hyperoxie-induzierte Proliferationssteigerung an Keratinozyten Einfluss von Hyperoxie auf Endothelzellen Anstieg der Zellzahl bei Fibroblasten in vitro Reaktion des Glutathion-Antioxidanssystems auf Hyperoxie Aktivierung von MAP-Kinasen durch kurze Hyperoxie- Inkubationen an dermalen Fibroblasten Bestimmung der MAP-Kinase Erk 1/2 unter hyperoxischen-bedingungen mittles Western-Blot Analyse Auswirkung kurzer Hyperoxie-Inkubationen auf die MAP-Kinasen epidermaler Keratinozyten Untersuchung einer durch Superoxidanionen induzierten Trigger-Funktion von Fibroblasten Hemmung der NADPH-Oxidase mittels Diphenylene lodonium (DPI) Hemmung der NADPH-Oxidase durch Apocynin Gegenübersteilung der ROS-Marker Dihydroethidium (HE) und Dichlorodihydrofluorescein- Diacetat (DCF) Auswirkungen der NADPH-Oxidase durch Apocynin in Bezug auf die Prokollagensynthese Auswirkung von Apocynin auf die Signaltransduktion Messung desapocynin-einflusses auf die Erk 1/2 Aktivierung unter Hyperoxie durch Western-Blot Analyse Auswirkungen des O2' - Scavengers Trolox auf dermale Fibroblasten unter Hyperoxie Auswirkungen des 02'- Scavengers Trolox in Bezug auf die MAP-Kinase Erk 1/2 unter Hyperoxie Steigerung der Proliferation durch Paraquat Auswirkung unterschiedlicher Paraquat Konzentrationen auf die Aktivierung von MAP-Kinasen MAP-Kinase-Aktivierung durch H2O Hemmung der Xanthin-Oxidase durch Allopurinol 83

5 4.9 Bestimmung der ROS-Generierung unter Hyperoxie durch Chemilumineszenz Diskussion Sauerstoffdosis-Inkubationszeit und O2-Konzentration Auswirkungen kurzer Hyperoxie-Inkubationszeiten Auswirkungen langer Hyperoxie-Inkubationszeiten Hyperoxie und Apoptose Das prooxidative / antioxidative Gleichgewicht Initiierung von MAP-Kinasen über ROS Enzymatische ROS-Generierung unter Hyperoxie Hemmung der Xanthin-Oxidase (XOD) 5.8 Auswirkungen des Superoxidanion-Scavengers 92 Trolox auf dermale Fibroblasten unter Hyperoxie Steigerung der Proliferation durch Paraquat Aktivierung von MAP-Kinasen durch H 2 O Zusammenfassung g8 6.1 Fazit der Arbeit Literatur Danksagung. 107