Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Genbezeichnung. 1. Einleitung 1

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1 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Genbezeichnung VI VIII X 1. Einleitung Das Plastom Transkription in Chloroplasten Die plastidäre Transkriptionsmaschinerie NEP (nucleus encoded polymerase) PEP (plastid encoded polymerase) Transkriptionsfaktoren in Chloroplasten Sigmafaktor-Gene in Arabidopsis thaliana Promotoren in Plastiden PEP-spezifische Promotoren NEP-spezifische Promotoren Unterteilung der plastidären Gene in Klassen Ribosomen-vermittelte Translation in Chloroplasten Dominant-Negative Effekte Zielsetzung Material & Methoden Material Chemikalien und Enzyme Chemikalien Enzyme Pflanzenmaterial 19 i

2 3.1.3 Bakterienstämme Plasmide Klone Oligonukleotide Antikörper Nährmedium Medien zur Anzucht von Arabidopsis thaliana Gele, Puffer und Lösungen Verwendete Geräte Internetadressen Computergestützte Bildbearbeitung Methoden Kultivierung der Organismen Wachstum von Bakterien in Flüssigkultur Wachstum und Selektion von Bakterien auf LB-Platten Anzucht von Arabidopsis thaliana Analytik Bestimmung des Chlorophyllgehalts Bestimmung der Zelldichte von E.coli Isolierung von Protoplasten Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung genomischer Desoxyribonukleinsäuren Isolierung von bakteriellen Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren Isolierung von Ribonukleinsäuren aus Arabidopsis thaliana Isolierung Polysomen-assoziierter mrna Herstellung DIG-markierter RNA-Sonden durch in-vitro Transkription Trennung von Nukleinsäuren Trennung von Ribonukleinsäuren Trennung von Desoxyribonukleinsäuren Northern-Transfer von Ribonukleinsäuren Hybridisierung und Detektion von Nukleinsäuren Amplifizierung von Nukleinsäuren 31 ii

3 Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA-Sequenzierung Elution von DNA Fragmenten Isolierung von Gesamtproteinen aus Arabidopsis thaliana Affinitätsaufreinigung von TAP-tag markierten Proteinen Bestimmung des Proteingehalts Gelelektrophorese von Proteinen (Bis-Tris-PAGE) Elektropheretische Transfer von Proteinen und Immunodetektion Agrobakterium-vermittelte Transformation β-estradiol induzierte Expression Gateway-spezifische Klonierung Gateway-kompatible PCR-Produkte BP-Clonase Reaktion LR-Clonase Reaktion Ergebnisse Konstitutitve Überexpression eines Teilbereichs von SIG Konstrukte und mittels RT-PCR verifizierte Überexpression Charakterisierung der visuellen Phänotypen Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I und class II) zur Überprüfung eines DNE Analyse eines überexprimierten Volllängenkonstrukts Expressionsanalyse des nativen Sig6 und des verkürzten crsig6 in der DNE-Linie Mikroskopischer Nachweis der Lokalisation des CRSIG RT-PCR Expressionsanalyse auf RNA-Ebene aller Mitglieder der Sigmafaktor-Familie in der DNE-Linie Erweiterte Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I, class II und class III) in der DNE-Linie 46 iii

4 4.1.9 Analyse der Expression ribosomaler RNAs in der DNE-Linie Analyse Polysomen-assoziierter mrna in der DNE-Linie Analyse Polysomen-assoziierter ribosomaler RNAs in der DNE-Linie Immunologische Analyse plastidärer Proteine Chemisch induzierbare Überexpression des CRSIG Konstrukte, Induzierung und Expressionsnachweis mittels RT-PCR Analyse plastidärer Zielgene nach induzierter Überexpression Analyse ribosomaler RNAs nach induzierter Überexpression Affinitätschromatographische Isolierung eines TAP-tag versehenen SIG Konstrukte und mittels RT-PCR verifizierte Überexpression Charakterisierung visueller Sig6-TAP Phänotypen Northern-Blot Analyse plastidärer Zielgene (class I und class II) in Sig6-TAP-Linien Immunologische Analyse plastidärer Proteine in Sig6-TAP-Linien Lasermikroskopische Aufnahme der Chlorophyll-Autofluoreszenz von Protoplasten in Sig6-TAP-Linien Wachstumsanalyse auf MS-Medium ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle von Sig6-TAP-Linien Aufreinigung und immunologische Detektion des SIG6-TAP Proteins Diskussion Plastidärer Transkriptions-DNE in Arabidopsis thaliana Funktionelle Charakterisierung eines konstitutiv exprimierten Sigmafaktor-Teilbereichs Induzierte Überexpression des CR-Anteils des SIG Hypothetische Funktion des CRSIG6 als DNE Affinitätschromatographische Isolierung eines TAP-getagten SIG Zusammenfassung Summary 89 iv

5 8. Literaturverzeichnis Anhang Lebenslauf Erklärung 113 v