Warum molekulargenetische Hunde-Forschung teuer ist und so lange dauert
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- Fritz Baumgartner
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1 Warum molekulargenetische Hunde-Forschung teuer ist und so lange dauert Jörg T. Epplen, Regina Kropatsch Humangenetik, Ruhr-Universität Bochum, Germany Erfolge der molekulargenetischen Forschung werden teilweise überschwänglich gefeiert, mitunter sogar auch in der Laienpresse. Schlagzeilen wie Hunde-Genom entschlüsselt, Gentherapie-Erfolge und genetische Peep-Show ins Hunde-ich verleiten manchmal zu unrealistischen Hoffnungen und Erwartungen bzgl. schneller Forschungserfolge im gesamten genetischen Forschungsspektrum. Andererseits müssen in der Realität praktisch alle experimentellen Ergebnisse beinhart erarbeitet werden, und sie erfordern neben guten Ideen, Einsatz und Hartnäckigkeit der Forscher auch teilweise umfangreiche finanzielle Mittel. Vorläufige Ergebnisse zur schnellen Information der interessierten Hundehalter können vorab mitgeteilt werden (s.a. Katrin Streitberger et al. 2008), wenngleich die vollendete wissenschaftliche Veröffentlichung in einer international anerkannten Fachzeitschrift dann meist noch einige Zeit auf sich warten lässt. Anhand zweier Projekt-Beispiele und den eigenen Erfahrungen sollen einige Zusammenhänge zwischen Forschung, Finanzen und Zeitbedarf hier etwas intensiver beleuchtet werden. Wir konzentrieren uns seit einigen Jahren auf monogen bedingte Augenerkrankungen des Hundes, die unter Tierärzten und Hundezüchtern zusammengefasst als (generalisierte) progressive Retinaatrophie (PRA) bekannt sind. Grundvoraussetzung für derartige Forschungsprojekte ist die exakte klinische (Differential-)Diagnose der Erkrankung durch den Tierarzt. Der Dortmunder Ophthalmologen-Kreis (DOK; Leiter Dr. Brahm) hat durch gezielte Weiterbildung einer Reihe von Veterinären hierfür sehr gute Ausgangsbedingungen geschaffen. Allerdings hängt die Durchführung derartiger Forschungsprojekte zuallererst von der Bereitstellung der Proben, also der wohlwollenden Kooperation der Hundehalter ab. Leider ist das Engagement der Halter nur bei ganz wenigen Rassen so breit und so ausgeprägt wie in den beiden nachfolgend geschilderten Beispielen der PRAbetroffenen Schapendoes, der Irish Glen of Imaal sowie Airedale Terrier und Löwchen. Zur PRA-Mutation bei Schapendoes ein langes Stück in mehreren Akten Mit der Blut-Probensammlung der vorher sorgfältig ausgewählten Schapendoes- Familien war bereits Mitte 2003 intensiv begonnen worden; leider kann man für langfristige genomweite Forschungsprojekte nicht auf viel einfacher zu gewinnende Schleimhautabstriche vertrauen, da die isolierte DNA-Menge vergleichsweise gering ist und die DNA-Qualität bei Lagerung auch zu schnell abnimmt. Die letzte Einsendung der 57. Blut-Probe bestimmte den Projektbeginn im März 2004, auch wenn vorher alles andere monatelang bereit steht und die Mitarbeiter es kaum erwarten können, endlich die Experimente einzuleiten. Alle benötigten molekularbiologischen Reagenzien werden so kostengünstig wie möglich im Rahmen von Großkundenvereinbarungen erstanden, die natürlich nicht nur auf das Hundeprojekt beschränkt sind. Man kann in molekulargenetischen Projekten davon ausgehen, dass ein Doktorand bzw. ein wissenschaftlicher Mitarbeiter pro Jahr mindestens an reinen Verbrauchsmaterialkosten für Chemikalien etc. ohne Geräte- und Raumnutzung verbraucht, die Arbeitsleistung
2 nicht eingerechnet. Nach knapp 16 Monaten intensiven praktischen Experimentierens und Auswertens konnten wir einen großen Chromosomenabschnitt beim Schapendoes identifizieren, in dem die PRA-Mutation mit hoher Sicherheit lokalisiert sein musste. Bereits kurz danach war das erste und aussichtreichste sog. Kandidaten-Gen in dieser Region von der Doktorandin Tanja Lippmann charakterisiert, leider ohne den kritischen Erbsprung, die verantwortliche PRA- Mutation, identifiziert zu haben. Diese Zwischenergebnisse wurden später im Februar 2007 in der angesehenen Fachzeitschrift Molecular Vision veröffentlicht, ein vergleichsweise nur kleiner Erfolg für die Anstrengungen aller Beteiligten nach beinahe 5 Jahren nach Projektbeginn. 2 ½ Jahre später, also Anfang 2008, knallten aber dann die Sektkorken richtig: Im 11. untersuchten Kandidaten-Gen in der fraglichen Chromosomenregion konnte die ursächliche Abweichung endlich dingfest gemacht werden. Hinweise auf die Existenz dieses Gens waren bislang nur im Rahmen der Gesamtgenom-Sequenzierungsprojekte von Mensch, Maus und Hund erhalten worden, das betreffende Gen und sein hierin verschlüsseltes Proteinprodukt sind ansonsten bislang gänzlich unbekannt. Neulich konnten wir auch das abgeleitete Protein in der Retina nachweisen, ein weiterer Meilenstein auf dem lngen Weg zur vollen Beweisführung, dass wir auf der richtigen Spur sind, um ggf. auch experimentelle Therapieversuche einzuleiten. Zur Abklärung der Eigenschaften und der Funktionen des neuen Proteins wurde ein unabhängiges Forschungsprojekt zur Förderung bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft eingereicht. Nach dieser Entdeckung wollten wir einerseits den Schapendoes-Freunden die Möglichkeit der direkten Mutationsdiagnostik unmittelbar anbieten, andererseits bedarf es weiterer Forschungsarbeiten mit weiterführenden Methoden, um diese Ergebnisse umfassend und überzeugend auf höchstem wissenschaftlichem Niveau zu veröffentlichen. Daher wurde die exakte Bezeichnung der PRA-Mutation beim Schapendoes noch nicht offiziell mitgeteilt. Allerdings wurden an die 1000 in der Zucht befindliche Schapendoes auf die Mutation getestet, sodass die Züchter homozygot betroffene Welpen auf jeden Fall durch gezielte Anpaarung vermeiden können. Um molekulargenetische Hundeforschungsprojekte so kostengünstig wie möglich zu gestalten wird vor allem auch an den Personalmitteln besonders gespart: Anstelle eines erfahrenen, promovierten Wissenschaftlers werden Doktoranden im Rahmen ihrer wissenschaftlichen Ausbildung eingesetzt, die sozusagen nur ein halbes Wissenschaftler-Gehalt beziehen, andererseits zum Erreichen des Doktortitels nach drei Jahren besonders angestrengt und lange arbeiten. Zum Berufsethos des molekulargenetischen (Hunde-)Forschers gehört demnach zumeist gehörige Geduld und Hartnäckigkeit verbunden aber mit unbedingtem Einsatzwillen. Genomscreen in drei Hunderassen Fortsetzung folgt Analog zum PRA-Projekt beim Schapendoes sollen seit Projektbeginn in 2007 die Mutationen in drei weiteren Rassen durch die hiesige Zweitautorin abgeklärt werden: Irish Glen of Imaal Terrier (GIT), Airedale Terrier (AT) und Löwchen (Lö). Eine vergleichsweise schlechtere Ausgangssituation als bei den Schapendoes besteht bei diesen drei Rassen allerdings darin, dass nur Material von wenigen Hunden aus nicht so umfangreichen Stammbäumen als DNA zur Verfügung steht. Dies hat zur Folge, dass der Informationsgehalt der für diese drei Rassen vorliegenden Stammbäume bezüglich der mendelnden Erbkrankheit PRA geringer ist, da der Stammbaum- Informationsgehalt von der Anzahl betroffener Hunde und deren direkter Verwandten
3 abhängig ist. Diese Ausgangssituation ist jedoch keinesfalls auf mangelnde Kooperationsbereitschaft der betreffenden Zuchtverbände zurückzuführen. Vielmehr ist der Grund dafür bei den fehlenden Eltern- bzw. Großelterngenerationen zu suchen, die zum Zeitpunkt der Stammbaummaterial-Rekrutierung bereits verstorben waren. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkung hinsichtlich der Stammbauminformation musste eine Strategie gefunden werden, das genomweite Screening für diese drei Rassen zu optimieren und so die Erfolgsquote einer Markerkopplung zu erhöhen. Daher wurden zu dem bestehenden Marker-Set zusätzliche Mikrosatellitenmarker ausgewählt und typisiert. Auf diese Weise sollten einerseits die Abstände zwischen den Markern verringert und damit auch eine mögliche Rekombinationswahrscheinlichkeit minimiert werden. Andererseits sollten so wichtige Retina-spezifische sowie Retinitis pigmentosa (RP)-assoziierte Genregionen abgedeckt werden. RP ist die zur PRA homologe Erkrankung beim Menschen, daher sind mutierte Gene bei der RP besonders interessante Kandidaten für die Mutationssuche bei der caninen PRA. Trotz dieser Maßnahmen ist nach 2 Jahren intensivster Arbeit aber immer noch kein sicheres Land in Sicht. Denn leider bleibt trotz gut durchdachter Strategie stets ein gewisses Restrisiko, die Region, in der sich der gekoppelte Marker befindet, dennoch zu verpassen. Bisher wurde davon ausgegangen, dass beim Hund relativ große Haplotypblöcke von mehreren Megabasen (Mb) vorliegen und daher ein Markerset bestehend aus 325 Markern mit einem durchschnittlichen Abstand von 9 Mb (~9 cm) verteilt über das Hundegenom für eine erfolgreiche Kopplungsanalyse ausreichend ist. Diverse Simulationsstudien belegen diese Annahme. Obwohl wir nun durch zusätzliche Marker den durchschnittlichen Abstand auf etwa 5 Mb verkleinert und so auch eine mögliche Rekombinationswahrscheinlichkeit verringert haben, konnte dennoch kein Marker eindeutig PRA-gekoppelt identifiziert werden. Demzufolge ist anzunehmen, dass die Haplotypblöcke in einigen chromosomalen Bereichen kleiner sind als vermutet und Rekombinationen zwischen untersuchtem Marker und Mutationsort stattgefunden haben. Vergleichende Analysen des caninen Genoms mit dem des Menschen haben gezeigt, dass einige Sequenzabschnitte sogenannte hot spot Regionen mit überproportional hohen Rekombinationsfrequenzen aufweisen. Die überwiegende Anzahl aller Rekombinationen findet in solchen lokal begrenzten hot spots zwischen Haplotypblöcken statt. Hot spots besitzen einen erhöhten GC-Gehalt und werden beim Hund vor allem an den Telomeren (= Chromosmenenden) aber auch in anderen chromosomalen Bereichen vermutet. Allerdings gibt es bisher keine Angaben über deren genaue Lokalisationen, was für die Erweiterung des Markersets durch zusätzliche Marker von Vorteil gewesen wäre. In den meisten Hunderassen ist die PRA eine monogene Erkrankung, was bedeutet, dass eine Mutation in nur einem Gen ursächlich für PRA ist. Bei einigen Rassen wie z.b. Zwergschnauzern, Kuvasz, Golden Retrievern u.a. sind PRA ursächliche Mutationen bereits bekannt. Allerdings konnte Optigen diese Mutationen nicht für alle PRA-betroffenen Hunde der o.g. Rassen als Ursache bestätigen. Somit müssen in diesen Rassen mehrere Mutationen in unterschiedlichen Genen PRA verursachen. Eine mögliche Erklärung wäre, dass eine Rasse wie beispielsweise die GITs nicht nur im Ursprungsland sondern in unterschiedlichen Ländern (Deutschland, Niederlande, England, Finnland) gezüchtet wird. Je nachdem wie früh diese geographische Trennung erfolgte, könnten die ländereigenen Züchtungen als eigenständige Populationen angesehen werden, die sich unabhängig voneinander entwickelt haben und somit unterschiedliche PRA verursachende Mutationen hervorgebracht haben. Für die GIT, AT und Lö dürfte dies eigentlich nicht gelten, da diese Rassen sehr eng gezüchtet sind und sich ihre Gründung nur auf wenige
4 Gründertiere stützt. Angenommen aber es würde für besagte drei Rassen zutreffen, könnte dies eine Erklärung für die bisher erfolglose Suche sein. Ein anderer aber doch eher unwahrscheinlicher Ansatzpunkt könnten trotz gut geschulter Ophthalmologen bzw. Tierärzte fehldiagnostizierte PRA-Hunde sein. Leidet ein Hund beispielsweise zusätzlich an einer begleitenden Augenerkrankung (wie z.b. Glaukom), ist möglicherweise eine eindeutige Beurteilung der Diagnose PRA erschwert und kann so zu einer Fehleinschätzung des untersuchten Hundes führen. Da wir jedoch von der Richtigkeit der gestellten PRA-Diagnosen überzeugt sind, möchten wir die Suche nach der PRA ursächlichen Mutation in besagten drei Rassen mit einer alternativen Methode fortsetzen der modernen SNP-Mikroarray- Technologie. Wesentlicher Vorteil dieser Technik gegenüber der Mikrosatellitenbasierenden Genotypisierungsmethode ist die parallele Analyse von mehreren tausend Markern in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials. Zudem enthält solch ein Mikroarray ~ SNPs verteilt über das gesamte Hundegenom, was einer genomischen SNP Abdeckung von 1 SNP pro ~0,1Mb entspricht und damit eine wesentlich höhere Markerdichte aufweist als unser erweitertes Marker Set mit durchschnittlich 1 Mikrosatellit pro 5 Mb (!). Wir hoffen, dass diese Methode somit eine größere Chance bietet, einen Hinweis auf die PRA-ursächliche chromosomale Region zu erhalten. Da allerdings die neue Strategie der SNP-Mikroarray- Technologie die Anwendung spezieller Chips erfordert, die erst auf Anfrage mittels eines aufwendigen, photolithographischen Verfahren produziert werden, verteuert sich das PRA-Projekt gleich mindestens um an reinen Sachkosten. Ausblick Molekulargenetische Forschung befördert die moderne Hundezucht und kann als solide wissenschaftliche Basis für empirisch entwickelte Zuchtstrategien dienen. Mendelnde, d.h. monogen bedingte Erbleiden können in Rassen mit kooperativen Hundehaltern ausgemerzt werden ohne Verlust an genetischer Vielfalt. Spezifische Tests für mendelnde Exterieur-Merkmale wie z.b. Fellfarben etc. werden bald zunehmend zur Verfügung stehen. Biobanking und genomische Anmarschwege erlauben in nicht allzu ferner Zukunft auch effizientere Untersuchungmöglichkeiten von multifaktoriell bedingten Merkmalen wie die des Verhaltens und der Leistungseigenschaften ebenso wie entsprechender Erkrankungen, z.b. Epilepsie oder Herzerkrankungen. Die finanziellen Aufwendungen hierfür sind sicherlich keineswegs unerheblich aber letztlich sehr sinnvoll im Sinne fortschrittlicher Kynologie investiert. Allerdings ist jegliche moderne Forschung auf die Mitarbeit der Züchter und Halter angewiesen, deren Vereinsführung Informationen zu gesundheitlichen Mängeln nicht unterdrücken oder beschönigen darf. Danksagung: Ohne die Kooperationsbereitschaft zahlreicher Hundehalter können die notwendigen biologischen Materialien wie Blut, Schleimhaut-Abstriche und Gewebeproben nicht untersucht werden. Die Gesellschaft für kynologische Forschung (GKF) unterstützt die Forschung am Hund seit Jahren in besonders effizienter Art und Weise. Literatur: Streitberger K, MS Fischer, O Distl JT Epplen: Molekulargenetische Untersuchung zur genetischen Variabilität in Hunderassen. Unser Rassehund 7: 30-33, 2008.
5 Lippmann T, A Jonkisz, T Dobosz, E Petrasch-Parwez, JT Epplen, G Dekomien: Haplotypedefined linkage region for gpra in Schapendoes dogs. Molecular Vision 13: , 2007
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