Linking Transcription to the Metabolic State

Transkript

1 Towards Systems Biology of the Chloroplast under Stress: Linking Transcription to the Metabolic State Dissertation Zur Erlangung des Akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Fakultat fur Biologie Universitat Bielefeld vorgelegt von Marie-Luise Oelze aus Bielefeld Bielefeld, April 2010

2 I lnhaltsverzeichnis Zusammenfassung AbkCirzungsverzeichnis III 1. Einleitunq Die Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies innerhalb des Chloroplasten Wege der Energiedissipation bei Starklichteinfluss Das antioxidative Schutzsystem des Chloroplasten Retrograde Signalwege Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen Molekularbiologische Methoden RNA-lsolierung durch Phenol-Chloroform-Extraktion RNA-lsolierung mit dem RNeasyOPIant Mini Kit Quantifizierung der RNA mittels Nanodrop OberprUfung des RNA-Zustandes durch Formaldehyd-Gele cdna-synthese Primer Design Polymerase-Kettenreaktion PCR zur Produktamplifikation Semiquantitative RT-PCR Quantitative Real Time RT-PCR DNA-Geielektrophorese Array-Analysen Plastom-Makroarray-Analyse Affymetrix GeneChip Mikroarray-Analyse Generation von proteinspezifischen Antikorpern Proteinbiochemische Methoden Radioaktive in wvo-markierung von Polypeptiden mit [35S]-Methionin 32

3 2.3.2 Isolierung von Proteinen zur Analyse in 2D-Gelen Bestimmung der Einbaurate von [35S]-Methionin Isolierung von Proteinen fur Western Blot-Analysen Bestimmung der Proteinkonzentration mit Amidoschwarz Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bradford Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zweidimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Silberfarbung von Proteingelen Vorbereitung von silbergefarbten Acrylamidgelen for Western Blots Western Blot PonceauS-Farbung von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen Immunchemische Detektion von Proteinen Optische Detektion mit NBT/BCIP Detektion mittels Chemilumineszenz Strippen von Proteintransfermembranen Autoradiographie von 2D-Gelen Physiologische Parameter Bestimmung des Chlorophyllgehalts Bestimmung des effektiven photosynthetischen Quantumyields Ascorbatperoxidase-Aktivitat Dehydroascorbatreduktase-Aktivitat Monodehydroascorbatreduktase-Aktivitat Bestimmung von reduziertem und oxidiertem Ascorbat Bestimmung von reduziertem und oxidiertem Glutathion 4B Visualisierung von reaktiven Sauerstoffspezies Visualisierung von ROS mittels DCF Visualisierung von Superoxidanionen mittels NBT Visualisierung von Peroxiden mit DAB Ergebnisse Die Bestimmung physiologischer Parameter unter dem Einfluss von Liohtintensitatserhohungen Phanotypische Betrachtung der Starklicht-transferierten Pflanzen Chlorophyll a-fluoreszenz Gehalt an Chlorophyll, Gesamtprotein und RNA Ros-Nachweis im Pfianzengeweben 59

4 3.2 Regulationen der Transkript-Ebene unter dem Einfluss von Lichtintensitatserhohungen Gesamt-Genom Array Piastom-Array Transkriptanalyse von ausgewahlten Genen mittels PCR Regulationen auf Ebene der Proteine unter Einfluss von Lichtintensitatserhfihungen Protein-de noi/o-synthese Western Blot-Analysen von ausgewahlten Proteinen Enzym-Aktivitaten Der Einfluss verschiedener Lichtintensitaten auf Metabolit-Gehalte Retrograde Signalwege Diskussion Phanotypische Anzeichen von Schattenwuchs bei den Schwachlicht-adaptierten Pflanzen Schwachlicht-adaptierten Pflanzen erfahren stsrkere Photoinhibition unter Einfluss von Starklicht Normallicht-gewachsene Pflanzen zeigen eine deutliche Akkumulation von ROS Basischarakteristika der Schwachlicht-adaptierten und Normallichtgewachsenen Pflanzen unter Kontroll- und Starklichtbedingungen Schwachlicht-adaptierte Pflanzen zeigen eine wesentlich dynamischere Reaktion auf Ebene des Transkriptoms und der de novo-proteinsynthese Verschiedene Lichtbedingungen zeigen deutliche Regulationen des Water-Water-Cycles auf Transkript- und Proteinebene Der alternative Weg der H202-Detoxifizierung fiber das 2CP ist in den Schwachlicht-adaptierten Pflanzen starker ausgepragt Niedrige photosynthetische Photonenflussraten verursachten niedrigere Konzentrationen an Ascorbat und Glutathion mit einem oxidierteren Redox-Verhaltnis 134

5 4.9 Schwachlicht-adaptierte und Normallicht-gewachsene Pflanzen zeigen einen unterschiedlichen Bedarf an gesteigerten Enzymaktivitaten unter dem Einfluss von Starklicht Beteiligung mbglicher retrograder Signalwege an der Regulation der Water-Water-Cycle Transkripte Verschiedene Wege der Energie-Dissipation fur Schwachlichtadaptierte und Normallicht gewachsene Pflanzen: eine zusammenfassende Betrachtung Literaturverzeichnis Anhanq 167