of chronic skin inflammation

Transkript

1 DISS. ETH NO Identification of new targets and treatment strategies for the therapy of chronic skin inflammation A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by SILVANA ZGRAGGEN MSc. Pharmaceutical Sciences ETH ZURICH, Switzerland Born October 17, 1985 Citizen of Silenen, Uri, Switzerland Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Michael Detmar, examiner Prof. Dr. Dario Neri, co-examiner 2014

2 1 Summary 1.1 Summary Chronic inflammatory disorders such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease and psoriasis affect a big proportion of the world s population. Today, several effective therapies are tested in clinics or are in clinical use already. However, not all approved therapeutics are well tolerated and show efficacy in all patients. Thus, there is still a need to identify new targets and therapies for the treatment of chronic inflammatory diseases. In order to identify novel targets for the treatment of chronic inflammatory diseases, we performed a microarray study comparing inflamed with uninflamed ear skin of hemizygous K14-VEGF-A transgenic mice, an established mouse model of chronic skin inflammation. We found several significantly upregulated genes upon inflammation, among which we selected CXCR4 and MMP-12 for further investigations. CXCR4 was not only found to be upregulated during chronic skin inflammation in hemizygous K14-VEGF-A transgenic mice, but also in human psoriasis as compared to uninvolved human skin. Blockade of CXCR4 by AMD3100, a selective CXCR4 inhibitor, significantly reduced edema formation, inflammation-induced angiogenesis as well as the infiltration of inflammatory cells into the inflamed tissue of hemizygous K14-VEGF-A transgenic mice as well as in the imiquimod-induced skin inflammation mouse model. 1

3 Similar anti-inflammatory effects were observed after treatment with a neutralizing anti- SDF-1 antibody. In the second project we investigated the role of MMP-12 in acute and chronic skin inflammation. MMP-12 was upregulated in the inflamed skin of hemizygous K14-VEGF- A transgenic mice as well as in human psoriasis skin, as compared to uninflamed skin. MMP-12 inhibition using RXP470.1, a selective MMP-12-inhibitor, significantly inhibited edema formation, inflammatory angiogenesis and lymphangiogenesis as well as the infiltration of macrophages into the inflamed tissue. Additionally, acute TPA-induced skin inflammation, in particular edema formation, inflammation-induced angiogenesis and lymphangiogenesis as well as the infiltration of the tissue with macrophages was significantly reduced in MMP-12 knockout mice as compared to wild-type mice. Mechanistically, we found that RXP470.1 inhibited the chemoattractant effect of MMP- 12-generated elastin fragments. Furthermore, we identified MMP-12 to be a VEGF-A target gene in vitro and in vivo. In the third project, we aimed to generate a tool which allows the specific activation of lymphatic vessels at sites of inflammation after a systemic treatment. To this end, we fused VEGF-C and VEGF-C156Ser to the F8 antibody (specific to the alternatively spliced extra-domain A of fibronectin, a marker for angiogenesis). Both fusion proteins were found to act pro-lymphangiogenic in vitro and in vivo. Furthermore, F8-VEGF-C but not F8-VEGF-C156Ser significantly induced vascular leakage. When tested in two different mouse models of skin inflammation, both fusion proteins significantly reduced edema formation and induced lymphangiogenesis at the site of inflammation. Finally, we 2

4 found that F8-VEGF-C significantly accelerated lymphatic clearance as compared to PBS-treated animals. Overall, we identified two novel potential targets for the therapy of chronic cutaneous inflammation as well as a new strategy to activate lymphatic vessels at the site of inflammation. 3

5 1.2 Zusammenfassung Ein grosser Anteil der Weltbevölkerung ist von chronisch entzündlichen Erkrankungen, wie rheumatoider Arthritis, chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Hauterkrankungen wie der Schuppenflechte betroffen. Obwohl verschiedene effektive Therapien in klinischer Anwendung oder Testung sind, profitieren nicht alle Patienten gleichermassen davon oder zeigen unerwünschte Nebenwirkungen. Deshalb besteht ein anhaltendes Interesse an der Identifizierung von neuen therapeutischen Angriffspunkten und strategien für die Behandlung von chronischen Entzündungen. Um neue Angriffspunkte für die Therapie von chronischen Entzündungen zu finden, haben wir unter Verwendung von K14-VEGF-A transgenen Mäusen, ein etabliertes Mausmodel für chronische Hautentzündung, eine Microarraystudie durchgeführt. Aus vergleichenden Analysen von unentzündeter mit entzündeter Haut dieses Mausmodelles identifizierten wir verschiedene signifikant erhöht exprimierte Gene in entzündeten Ohren, wovon CXCR4 und MMP-12 in zwei einzelnen Studien detailliert untersucht wurden. Neben der erhöhten Expression von CXCR4 in der entzündeten Haut von K14-VEGF-A transgenen Mäusen, fanden wir zudem mehr CXCR4 positive Zellen in der Haut von menschlicher Schuppenflechte im Vergleich zu normaler Haut von Patienten. Durch Inhibierung von CXCR4 mit AMD3100, einem selektiven CXCR4 Inhibitor, konnten wir das Ödem, die entzündungs-assozierte Angiogenese sowie die Infiltration von 4

6 Entzündungszellen ins Gewebe von hemizygoten K14-VEGF-A transgenen Mäusen hemmen. Die Testung eines anti-sdf-1 Antikörpers in K14-VEGF-A transgenen Mäusen sowie von AMD3100 in einem zweiten Model für chronische Hautentzündung (wobei die Applikation von Imiquimod eine chronische kutane Entzündung hervorruft), zeigten ähnliche Resultate. Im zweiten Projekt fokussierten wir uns auf die Rolle von MMP-12 in akuter und chronischer Hautentzündung. Sowohl in der entzündeten Haut von K14-VEGF-A transgenen Mäusen als auch in menschlicher Schuppenflechte war die Expression von MMP-12 im Vergleich zu unentzündeter Haut hochreguliert. Selektive Inhibition von MMP-12 mit RXP470.1 führte zu einer signifikanten Reduktion des Ödems, der entzündungs-induzierten Angiogenese und Lymphangiogenese, sowie der Gewebeinfiltration mit Makrophagen. Um die Rolle von MMP-12 in akuter, TPAinduzierten Entzündung zu untersuchen, verwendeten wir MMP-12 defiziente Mäuse, welche im Vergleiche zu Wildtyp-Mäusen eine verminderte akute Entzündungsreaktion mit reduzierter Ödembildung und Makrophageninfiltration aufwiesen. In vitro Untersuchungen haben weiter gezeigt, dass MMP-12 generierte Elastinfragmente einen chemotaktischen Effekt auf Monocyten haben, welcher durch Inhibierung von MMP-12 mit RXP470.1 verschwand. Im weiteren fanden wir, dass die Expression von MMP-12 sowohl in vitro als auch in vivo durch VEGF-A gesteuert wird. Das Ziel im dritten Projekt war es, eine Strategie zu entwickeln, um lymphatische Gefässe am Ort der Entzündung nach einer systemischen Behandlung zu aktivieren. Dafür fusionierten wir VEGF-C und VEGF-C156Ser mit dem F8 Antikörper, welcher spezifisch 5

7 für die alternativ gespleisste Extra-Domäne A von Fibronektin, einem Marker für Angiogenese ist. Für beide Fusionsproteine fanden wir pro-lymphangiogenetische Aktivitäten sowohl in vitro als auch in vivo. F8-VEGF-C, nicht jedoch F8-VEGF- C156Ser, erhöhte zudem die vaskuläre Permeabilität. In vivo Experimente in entzündeten K14-VEGF-A transgenen Mäusen und Imiquimod-behandelten Mäusen führten zu einer anti-entzündlichen Antwort, welche sich in einer signifikanten Reduktion des Ödems zeigte. Im Vergleich zu Kontrollmäusen wiesen F8-VEGF-C behandelte Mäuse eine beschleunigte lymphatische Clearance auf. F8-VEGF-C und F8-VEGF-C156Ser induzierten zudem am Ort der Entzündung Lymphangiogenese. Zusammenfassend identifizieren wir zwei neue Angriffspunkte für die Therapie von chronischer Hautentzündung, sowie eine neue Strategie, um lymphatische Gefässe am Ort der Entzündung spezifisch zu aktivieren. 6