Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen

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1 Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen Neue Methoden der Genetik 7. DGM Fach- und Informationstag für Muskelkranke Juni 2014 Dr. Sabine Uhrig

2 AGENDA 2

3 Menschliche Muskulatur 656 Muskeln 30-50% der Gesamtkörpermasse Arten von Muskulatur glatt (Organe) quergestreift (Herz, Skelettmusk.) Funktion der Skelettmuskulatur Bewegung und Stabilität Wärmehaushalt Bild: 3

4 Menschliche Muskulatur Bild: 4

5 Signalübertragung unteres Motoneuron Bild: 5

6 Chromosomen 22 Autosomenpaare, 2 Geschlechtschromosomen 46, XX 46, XY 6

7 Chromosomen Bild: 7

8 Autosomal rezessiver Erbgang Hintergrund Charakteristik Beide Eltern gesund aber heterozygote Anlageträger 25% der Kinder betroffen 8

9 Autosomal dominanter Erbgang Hintergrund Charakteristik Ein verändertes Allel führt direkt zur Erkrankung Ein betroffener Elternteil, 50% der Kinder krank 9

10 X-chromosomal rezessiver Erbgang Hintergrund Charakteristik Weibliche Familienmitglieder meist gesund aber Trägerin (Fast) nur männliche Familienmitglieder betroffen X Y X X X X X X X Y X Y 10

11 AGENDA 11

12 Muskelbeteiligung bei Muskeldystrophien Bild: 12

13 Vorstellung ausgewählter Krankheitsbilder Muskeldystrophien Duchenne sche Muskeldystropie (DMD) Gliedergürtel-Muskeldystrophien (LGMD) Atrophie Spinale Muskelatrophie (SMA) Myotonie Myotone Dystrophie Typ 1 (Morbus Cruschmann-Steinert) 13

14 Duchenne sche Muskeldystropie (DMD) 1/3 Krankheitsbeginn: Frühe Kindheit Symptome: Progressiver Muskelschwund Leichte intellektuelle Beeinträchtigung (~ 30 %) Gelenkkontrakturen Charakteristische Haltung Pseudohypertrophie der Waden Gowers Zeichen Verlust Gehfähigkeit: oft vor dem 13. Lebensjahr Bilder: und 14

15 Duchenne sche Muskeldystropie (DMD) 2/3 Statistik: ~1 : (Jungen) Vererbung: X-chromosomal-rezessiv de-novo Mutationen Genetik: Genort DMD-Gen: Xp21.2 großes Gen mit 79 Exons > Mutationen beschrieben 60 % Deletionen 5-10 % Duplikationen % Punktmutationen 15

16 Duchenne sche Muskeldystropie (DMD) 3/3 Bild: nach Torella et al, JMD

17 Gliedergürtel-Muskeldystrophien (LGMD) 1/3 Krankheitsbeginn: variabel meist Jahre Symptome: proximal betonte Paresen Schwierigkeiten beim Aufstehen Progredienz der Paresen über 2 Jahrzehnte Verlust Gehfähigkeit: variabel; oft langsamer Verlauf mit Verlust der Gehfähigkeit Bild: A. Ferbert&W. Kress; medgen 2009, 21:

18 Gliedergürtel-Muskeldystrophien (LGMD) 2/3 Statistik: 1: : Vererbung: autosomal-dominant autosomal-rezessiv Genetik: Heterogen 24 Gene bekannt zusätzlich mehr als 25 Genorte LGMD1 autosomaldominant LGMD2 autosomalrezessiv In der Regel Punktmutationen bzw. kleinere Deletionen die durch Sequenzanalyse detektiert werden können 18

19 Gliedergürtel-Muskeldystrophien (LGMD) 3/3 autosomal-dominant autosomal-rezessiv 19

20 Spinale Muskelatrophie (SMA) 1/3 Krankheitsbeginn: ab 1. Monat (Typ I) bis > 30 Jahre (Typ IV) Symptome: Typ I Sitzen nicht möglich, Muskelhypotonie gutes Kontaktverhalten, differenzierte Fein-Motorik, fehlende Reflexe, respiratorische Insuffizienz, Skoliose Typ II Sitzen möglich, kein freies Laufen Typ III Freies Laufen möglich Typ IV variable Progredienz Verlust Gehfähigkeit: keine Gehfähigkeit erlernt (Typ I) bis zu normaler Gehfähigkeit (Typ IV) Bild: S. Rudnik-Schöneborn & K. Zerres; medgen :

21 Spinale Muskelatrophie (SMA) 2/3 Statistik: 1 : : Heterozygotenfrequenz 1 : 50 Vererbung: autosomal-rezessiv Genetik: Genort SMN1-Gen: 5q % Deletionen von Exon 7 und 8 des SMN1- Gens 3-4 % Punktmutationen im SMN1-Gen 21

22 Spinale Muskelatrophie (SMA) 3/3 22

23 Myotone Dystrophie Typ 1 (Morbus Cruschmann-Steinert) 1/2 Krankheitsbeginn: variabel, vorgeburtlich (congenital) spätes Alter, klassische Form LJ Symptome: Muskelschwäche Myotonie (= Muskelsteifigkeit) Facies myopathica Stirnglatze Katarakt Herzbeteiligung Endokrine Störungen Intelligenzminderung Wesensänderungen Verlust Gehfähigkeit: variabel Bild: 23

24 Myotone Dystrophie Typ 1 (Morbus Cruschmann-Steinert) 2/2 Statistik: 1 : : Vererbung: autosomal-dominant Genetik: Genort DMPK-Gen: 19q13.2-q13.3 CTG-Trinukleotid-Repeat* Antizipation Erhöhung der Kopienzahl in der Keimbahn bei maternaler Übertragung, d.h. früheres Auftreten der Erkrankung in Folgegenerationen * 5 34 Kopien gesunde Normalpersonen; Kopien gesunde Personen, aber instabil (Keimbahn!); Kopien sorgen für milde Zeichen der MD; Kopien zeigen klassische Form der MD; über Kopien kongenitale MD 24

25 Warum ist der Nachweis der Mutation so wichtig? 1 Sicherung der Diagnose beim Betroffenen: Möglichkeit genauere Prognose zu erstellen Möglichkeit auch andere Organe (Herz / Auge etc.) in Vorsorgeuntersuchungen einzubeziehen Art der Mutation kann für gentherapeutische Ansätze wichtig sein Aussage über Wiederholungsrisiko bei Kinderwunsch des Betroffenen 2 Familienabklärung dadurch möglich : Möglichkeit auf Testung hinsichtlich Anlageträgerschaft (auch prädiktive Testung - d.h. Testung bevor Krankheitszeichen auftreten) Vorsorgeuntersuchungen von Familienangehörigen (z.b. entwickeln bei DMD ~ 20% Konduktorinnen Herzrhythmusstörungen/ Kardiomyopathien) je nach Erbgang Aussage über Wiederholungsrisiko bei weiterem Kinderwunsch bei aut-rez Erbgang Testung des Partners bei Kinderwunsch möglich 25

26 AGENDA 26

27 Die aktuelle Diagnostik verzichtet größtenteils auf die Genetik Symptome Diagnose Ursache Therapie 27

28 Diagnostik bei Muskeldystrophien 1. Anamnese 2. Labor (CK) 3. Elektromyografie (EMG) 4. Muskelbiopsie (Immunhistochemie) 5. Genetik Bild: 28

29 Unsere Vision Jeder Patient wird zu Beginn der Diagnostik genetisch untersucht 29

30 Die genetische Diagnose kann eine verbesserte Therapie ermöglichen Symptome umfassende Diagnose Ursache gezielte Therapie 30

31 Die Fragestellung bestimmt das passende Werkzeug der Diagnostik Einzelgen-Diagnostik [Sanger] Panel-Diagnostik [NGS] Etablierte Methode Nur für einzelne Gene möglich Zeit- und Kostenintensiv Geringe Chance die genetische Variante zu finden Paralleles Sequenzieren aller Genen die mit einer Krankheit assoziiert sind Hohe Qualität Zeit- und Kosteneffizient Hohe Wahrscheinlichkeit die ursächliche Variante zu finden Häufige Updates 31

32 Sanger Sequenzierung Bild: aus Shendure and Ji (2008) Nat Biotech 26:

33 Grenzen der Einzelgendiagnostik Vorteile am Beispiel des NMD-Panels 229 Gene Diagnostik- Panel NMD Einzelgendiagnostik (Theorie) Einzelgendiagnostik (Praxis) Untersuchte Gene 229 Gene (parallel) 229 Gene (nacheinander) 2-3 Gene Erfolgsrate ~ 30% ~ 30% < 10% Kosten Bearbeitungszeit 2-4 Monate Jahre 2-4 Monate 33

34 Die Fragestellung bestimmt das passende Werkzeug der Diagnostik Einzelgen-Diagnostik [Sanger] Panel-Diagnostik [NGS] Etablierte Methode Nur für einzelne Gene möglich Zeit- und Kostenintensiv Geringe Chance die genetische Variante zu finden Paralleles Sequenzieren aller Genen die mit einer Krankheit assoziiert sind Hohe Qualität Zeit- und Kosteneffizient Hohe Wahrscheinlichkeit die ursächliche Variante zu finden Häufige Updates 34

35 Diagnostische Routine: Arbeitsablauf einer Panel-Analyse Schritt 1 Schritt 2 Schritt 3 Schritt 4 Schritt 5 Labor Bioinformatik Diagnostik Labor Diagnostik Probenvorb. und Sequenzierung aller relevanten Gene De-Multiplexing Mapping, Variant calling, Annotation Auswahl der wahrsch. ursächlichen Varianten Validierung von Varianten Befundung 35

36 Schritt 1: Aktuellste Sequenziertechnik im Hochdurchsatz-Labor Sequenzierung der Patienten-DNA in hochspezialisiertem, zunehmend automatisiertem Labor Arbeitsinhalte Routine: DNA-Isolierung Anreicherung der gesuchten Gene Sequenzierung Forschung & Entwicklung: Protokoll-Weiterentwicklung Inputmengen optimieren optimale Anreicherung 36

37 Schritt 2: Bioinformatische Auswertung Bioinformatische Auswertung der Sequenzierdaten in einem vollautomatisierten Prozess Arbeitsinhalte De-Multiplexing Mapping Variant Calling Annotation Variantenliste für Diagnostik Feedback an das Labor (Qualität) Erhebung statistischer Daten Interpretation der Daten (R&D) 37

38 Schritt 3: Biologisch-medizinische Interpretation der Daten Interpretation der Variantenlisten durch ein Expertenteam Arbeitsinhalte Auswertung der genetischen Varianten Beurteilung im medizinischen Kontext Auftrag zur Validierung an Sanger-Labor ggf. Anforderung von Segregationen 38

39 Schritt 4: Bestätigung von Varianten durch zweite biotechn. Methode Validierung von pathogenen Varianten durch ein unabhängiges Verfahren (Sanger-Sequenzierung) Arbeitsinhalte Design von variantenspezifischen Primern Sanger-Sequenzierung Auswertung / Abgleich mit NGS-Daten ggf. Anfordern einer weiteren möglichen pathogenen Variante?! 39

40 Schritt 5: Erstellung eines medizinischen Befundes Abschließende Interpretation der validierten Varianten und Erstellung eines medizinischen Befundes Arbeitsinhalte Auswertung der bestätigten Varianten Erstellung eines med. Befundes 8-Augen-Prinzip verständlicher Befund an Arzt (2-3 Seiten) Research & Development: Panel-Design Panel-Updates Veröffentlichungen! 40

41 CeGaT bietet derzeit Panel-Diagnostik für 9 NMD-Krankheitsbilder an Panels Neuromuskuläre Erkrankungen NMD01: NMD02: NMD03: NMD04: NMD05: NMD06: NMD07: NMD08: NMD10: Spinale Muskelatrophie (21 Gene) Charcot-Marie-Tooth und sensorische Neuropathien (71 Gene) Kongenitale und distale Myopathien (55 Gene) Gliedergürtel-Muskeldystrophien (26 Gene) Muskeldystrophien (31 Gene) Kongenitale myasthene Syndrome und Arthrogryposis (29 Gene) Myotonien (11 Gene) Metabolische Myopathien (27 Gene) Walker-Warburg-Syndrom (13 Gene) 41

42 Statistik NMD Panels (einzelne Subpanels) NMD-02 (Charcot-Marie-Tooth und sensorische Neuropathien) positiv unklar negativ NMD-03 (kongenitale und distale Myopathien) positiv unklar negativ 23% 26% 61% 16% 53% 21% NMD-04 (Gliedergürtel- Muskeldystrophien) positiv unklar negativ Gesamt: 111 NMD-05 (Muskeldystrophie) positiv unklar negativ Gesamt: 53 39% 40% 36% 50% 21% 14% Gesamt: 38 Gesamt: 14 42

43 Statistik NMD-Panels (gesamt) NMD (alle) positiv unklar negativ positiv 91 28% unklar 66 20% negativ % 28% gesamt % 20% 43

44 CeGaT GmbH Paul-Ehrlich-Str. 17 D Tübingen Tel: / Fax: /

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