Kern. Replikation von DNA-Viren. Wo: Cytoplasma oder Kern? Wann? M G2 G1. > Transkription > DNA-Replikation

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1 Replikation von DNA-Viren Wo: Cytoplasma oder Kern? Wann? Kern M G2 G1 > Transkription > DNA-Replikation S-Phase angewiesen auf S-Phase Induktion von S-Phase S

2 DNA-Replikation DNA-abhängige DNA-Polymerasen semikonservative Replikation Initiation: origin of replication = ori (Replikationsursprung) + Elongation: bidirektionale Replikation Replikationsgabeln bidirektionale Wanderungsrichtung der Replikationsgabel Replikationsblasen

3 DNA-Replikation keine de-novo-synthese! RNA-Primer DNA-Synthese durch Anheftung von Nucleotiden an das 3'-OH-Ende der RNA-Primer Template (Matrize) und Primer (Starter) Direktionalität: Kettenverlängerung in 5'-> 3'-Richtung Molecular Cell Biology, 2004 dsdna: Stränge komplementär und antiparallel Polymerisationsrichtung = Wanderungsrichtung der Replikationsgabel >kontinuierliche Synthese (leading strand, Leitstrang, Vorwärtsstrang) Polymerisationsrichtung gegenläufig zur Wanderungsrichtung >diskontinuierliche Synthese (lagging strand, Folgestrang, Rückwärtsstrang)

4 Initiation der DNA-Replikation 1. SV40 T-Ag Zelle ORC T-Ag T-Ag Cdc6/ Cdt1/ ORC MCM 4. T-Ag Cdc6/ Cdt1/ ORC

5 DNA-Replikation SV40 Ziel: viele neue Virusgenome T-Antigen Chromosom Ziel: Verdopplung! origin licensing + origin-aktivierung ORC (origin recognition complex, 6 Proteine) CDC6, CDT1 MCM2-7 CDC7, S-CDKs, CDC45

6 DNA- Replikation von SV40 ori bidirektionale Replikation 4 4 Fareed et al., 1972 Molecular Cell Biology, 1999

7 DNA-Replikation von SV40 Bindung von T-Antigen (doppeltes Hexamer) an ORI lokales Entwinden der Doppelhelix (Helicase-Aktivität von T-Antigen) Öffnen des Doppelstrangs (benötigt ATP + RFA als ssdbp) Bindung von Primase-Polymerasealpha Synthese der Primer durch Primase Bindung von RFC stimuliert die Leitstrang-Synthese Molecular Cell Biology, 1999

8 DNA-Replikation von SV40 Molecular Cell Biology, 1999 Bindung von PCNA > Inhibition und Verdrängung von Polα > Unterbrechung der Leitstrang- Synthese Bindung von Polδ an PCNA/RFC > erhöhte Prozessivität > Synthese des Leitstrangs Bindung von Polα-Primase (+ RFC) an Folgestrang-Template Synthese des Folgestrangs > Okazaki-Fragmente ( Nucl.) Entfernen der RNA-Primer durch 5 >3 -Exonuclease-Aktivität von Polα Auffüllen und Ligation der Fragmente Wanderung der Replikationsgabel: durch T-Antigen erleichtert Trennung der beiden Tochtermoleküle: Topoisomerase II

9 Molecular Cell Biology, 2004

10 Struktur des SV40 ori minimaler ori: ca. 65 bp, 3 essentielle Elemente T-Ag-Bindungsstelle II inverted repeat, bp, GC-reich T-Bindungsstellen G-A/G-G-G-C AT-reiche Sequenz (15-20 bp) early imperfect palindrome Principles of Virology, 1999, 2004

11 SV40: T-Ag und origin Hexamer-Bildung von T-Ag Bindung an LT-BS II Strukturveränderung von early palindrome (EP) Bindung von RFA (RpA) Entwinden der DNA-Stränge Stabilisierung durch RFA Principles of Virology, 1999, 2004

12 SV40 DNA-Replikation Präinitiationskomplex: ori + T-Ag + RFA Initiationskomplex: (ori + T-Ag + RFA) + Primase-Polα Principles of Virology, 1999, 2004 Bildung des Initiationskomplexes bestimmt den engen Wirtsbereich von Polyomaviren

13 SV40 DNA-Replikation Topoisomerasen Decatenation Principles of Virology, 2004

14 Papillomaviruses Different modes of DNA replication 1. Establishment replication Limited amplification: copies/cell 2. Maintenance replication (1+2: bidirectional replication) 3. Productive replication (rolling circle replication) Principles of Virology, 2004

15 Rolling-circle replication Principles of Virology, 1999

16 Initiation der DNA-Replikation bei Papillomviren 1. Kooperative Bindung von E1 und E2 an ori. 2. ATP-abhängige Bindung von weiteren E1-Molekülen und Verdrängung von E2

17 Das Enden-Replikationsproblem bei linearen DNA-Genomen Principles of Virology, 1999

18 Problem: Replikation der Genomenden Problemlösungen eukaryote Chromosomen Telomere / Telomerase Bakteriophage T7 Bakteriophage T4 Adenoviren Herpesviren Bakteriophage Lambda Pockenviren Parvoviren terminale Redundanz (tr) tr, zirkuläre Permutation Protein-Primer Zirkularisierung self priming, hairpin loops self priming

19 Bakteriophage T7 Virion: polyedrischer Kopf (Durchmesser 30 nm) kurzer, nicht kontraktiler Schwanz Familie Podoviridae Genom: ds-dna, linear, ca. 40 kb Sequenzwiederholungen an den Enden (160 bp): > terminale Redundanz Bakterienviren, 1992

20 Bakteriophage T7: DNA-Replikation origin bei ca. 15% am linken Genomende bidirektionale Replikation (RNA-Primer) unvollständige Replikation des Folgestrangs > einzelsträngige 3 -Enden wegen terminaler Repeats: überstehende 3 -Enden komplementär Zusammenlagerung zu Dimeren Auffüllen der Lücken durch DNA-Ligase sequenzspezifische versetzte Spaltung durch Endonuclease gp3 > überstehende 5 -Enden Auffüllen der Einzelstrang-Enden > vollständige Genome mit terminalen Repeats bei weiterer Replikation: Bildung von Konkatemeren (bis ca. 100 Kopien) durch Stranginvasion (strand invasion)

21 Bakteriophage T7: DNA-Replikation 5 -ATTCAT 3 -TAAGTA ori ATTCAT-3 TAAGTA-5 5 -ATTCAT ATTCAT-3 3 -TAAGTA -5 + bid. Replikation 5 - ATTCAT-3 3 -TAAGTA TAAGTA-5 a b 5 -ATTCAT 3 -TAAGTA a ATTCAT TAAGTA Zusammenlagerung Ligation b ATTCAT-3 TAAGTA-5

22 Bakteriophage T7: DNA-Replikation 5 -ATTCAT 3 -TAAGTA a ATTCAT- TAAGTA- b ATTCAT-3 TAAGTA-5 5 -ATTCAT 3 -TAAGTA 5 -ATTCAT 3 -TAAGTA a a 5 -ATTCAT 3 -TAAGTA TAAGTA-5 5 -ATTCAT + Spaltung durch gp3 b b + ATTCAT-3 TAAGTA-5 Auffüllen der Enden ATTCAT-3 TAAGTA-5 ATTCAT-3 TAAGTA-5

23 Bakteriophage T4 Virion: elongierter polyedrischer Kopf (111 nm x 78 nm) langer kontraktiler Schwanz Familie Myoviridae, geradzahlige T-Phagen Genom: ds-dna, linear, ca. 166 kb Genom in Virionen ca. 171 kb, wegen: Sequenzwiederholungen an den Enden (ca 5 kb): terminale Redundanz zirkuläre Permutation Viren, 1993

24 Bakteriophage T4: DNA-Replikation mehrere origins frühe Replikation: bidirektionale Replikation > unvollständige Enden späte Replikation: Konkatemerbildung durch Rekombination (recombination-dependent DNA replication) Invasion der 3 -Enden in homologe ds-dna (strand invasion) > komplexes Netzwerk von replizierender Virus-DNA Verpackung des Genoms in Phagenkopf: head full -Mechanismus Verpackungslänge größer als Genomlänge > terminale Redundanz, zirkuläre Permutation

25 Bakteriophage T4: DNA-Replikation Terminale Redundanz und zirkuläre Permutation A Z A Z A Z A Z A Z A Z A Z A Z A Z A Z A Z A ABCD...YZA BCDE...YZAB CDEF...YZABC

26 T4 + T7: Virale Replikationsfaktoren T4 DNA-Polymerase (gp43) Helikase, Primase (gp41 + gp61) Einzelstrang-bindendes Protein gp32 ca. 30 virale Genprodukte insgesamt T7 DNA-Polymerase (gp5) Helikase, Primase (gp4) Endonuclease (gp3) DNA-Ligase >> autonomer viraler Replikationsapparat mit allen notwendigen Komponenten

27 Adenoviren 1953 aus Rachenmandeln (adenoids) isoliert Erkrankungen der Atemwege, des Gastrointestinalbereichs, der Augenbindehaut >100 Adenovirus-Typen bei Wirbeltieren Viruspartikel: Ikosaeder (Durchmesser nm) 252 Capsomere (240 Hexone, 12 Pentone) Viren, 1993 Adenoviren als Modellsysteme: effiziente Vermehrung in Zellkultur Genexpression: Splicing DNA-Replikation Onkogenese, Zelltransformation Vektoren

28 Adenoviren: Genom lineare doppelsträngige DNA, kb inverted terminal repeats (ITRs, bp) Molekulare Virologie, 2003 terminales Protein TP kovalent an 5 -Enden Interaktion der TPs > quasizirkulärer Zustand der DNA Strangtrennung: ITRs > Hybridisierung der komplementären Sequenzen > Pfannenstiel-Strukturen

29 Adenoviren: Initiation TP 80 kd TP 55 kd Molekulare Virologie, 2003 Bindung von ptp + Pol an terminalen ORI Bindung von NF-1 und Oct-1 an ORI kovalente Bindung von dcmp an Serin-OH: TP-C (Protein-Primer) TP-C komplementär zu 3 -terminalem G Initiation der DNA-Synthese an TP-C Bindung von ssdbp an verdrängten Einzelstrang

30 Adenoviren: Elongation Phase I: kontinuierliche Leitstrang -synthese Strangverdrängung (strand displacement) Phase II: verdrängter Strang: ITR >Pfannenstielstruktur Gegenstrangsynthese Virale Replikationsproteine: Pol, ptp, ssdbp Molekulare Virologie, 2003

31 Herpesviren große umhüllte Viren (Durchmesser nm) Envelope durch Knospung an innerer Kernmembran lytische Infektion Etablierung von latenten Infektionen (> Viruspersistenz) Reaktivierung Genom: lineare ds-dna ( kb) im Virus-Core Viren, 1993 spulenförmig um Proteinmatrix gewickelt Enden werden zusammengehalten unique (U L und U S ) und repetitive Sequenzen Molekulare Virologie, 2003

32 Herpesviren beim Menschen Herpes-simplex-Virus: Genom ca. 150 kb HSV1: Herpes labialis (Lippenbläschen) HSV2: Herpes genitalis Varizellen-Zoster-Virus (VZV): Genom ca. 125 kb Varizellen = Windpocken: Primärinfektion Zoster = Gürtelrose: Rezidiv Cytomegalievirus (CMV): Genom ca. 230 kb inapparente Infektionen bei Immunsupprimierten schwere Verläufe Epstein-Barr-Virus (EBV): Genom ca. 172 kb infektiöse Mononucleose (Pfeiffer sches Drüsenfieber) Burkitt-Lymphom (B-Zell-Lymphom), Afrika Nasopharynx-Karzinom, Südchina

33 Herpesviren beim Menschen Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6): 1986 entdeckt Exanthema subitum (Rubeola infantum, Dreitagefieber) Humanes Herpesvirus entdeckt, verwandt mit HHV-6 Humanes Herpesvirus 8: Genom ca. 270 kb 1994 entdeckt Kaposi-Sarkome bei AIDS-Patienten

34 Herpesviren: DNA-Replikation Zirkularisierung der DNA rolling-circle-mechanismus > head-to-tail-konkatemere Spaltung der Konkatemere und Verpackung: miteinander verbundene Prozesse (virales cleavage-packaging protein) head full -Mechanismus

35 Rolling-circle replication Principles of Virology, 1999

36 Herpesviren HSV-kodierte Enzyme für DNA-Replikation Proteine für virale origin-abhängige DNA-Replikation DNA-Polymerase Helicase-Primase origin-bindendes Protein ssdna-bindendes Protein Prozessivitätsfaktoren Enzyme für Nucleinsäuremetabolismus

37 Bakteriophage Lambda Genom: dsdna, linear, bp überstehende 5 -Enden (m, m, cos) (12 Nucleotide, komplementär) Infektion: Ringschluss ori, O-Protein, P-Protein 1. Bidirektionale Replikation 2. Rolling Circle -Replikation Concatemere > Encapsidierung > Spaltung durch Terminase (GenA+GenNu1) an cos(m/m ) Molekulare Genetik, 2001

38 Pockenviren große, komplex aufgebaute Viruspartikel (350 x 270 nm) im Lichtmikroskop sichtbar Virusreplikation: im Cytoplasma, in factory areas (Virusfabriken) in kernlosen Zellen möglich Beginn der DNA-Replikation: ca 1-2 h p.i. Produktion: ca Genomkopien/Zelle ca. 50 % werden verpackt Viren, 1993 Molekulare Virologie, 2003

39 Pockenviren Variolavirus Erreger der Pocken (variola: scheckig) im 6. Jh. von Asien nach Europa eingeschleppt Höhepunkt der Pockenepidemie in Europa: 18. Jh. Variola major: schwarze Blattern (hämorrhagische Pocken), Letalität 5-40% Variola minor: weiße Blattern, Letalität ca. 1 % Ausrottung der Pocken 1977 durch weltweites Impfprogramm der WHO

40 Pockenviren Virale Faktoren für DNA-Replikation DNA-Replikation: im Cytoplasma: keine Verwendung zellulärer Faktoren möglich alle Replikationsfaktoren vom Virusgenom codiert Enzyme für Nucleotidmetabolismus (um genügend große Mengen an dntps für DNA-Replikation herzustellen): Thymidinkinase Thymidylatkinase Ribonucleotidreductase dutpase

41 Pockenviren Genom: lineare ds-dna kb Kodierungskapazität: Gene hairpin loops an den Enden + inverted terminal repeats (ITRs) ITR-Länge: 725 bp (Variola) bis 12 kb (Vaccinia) Vacciniavirus ITR Molekulare Virologie, 2003

42 Pockenviren DNA-Replikation Priming: Setzen eines Nicks: self-priming (i.e. DNA-Primer) Rückfalten der ITRs kein definierter ori Elongation: Strand displacement (i.e. keine lagging strand-synthese) Concatemer-Bildung Auflösung der Concatemere in unit-length-moleküle (Monomere) erfordert Synthese von späten Proteinen

43 Pockenviren nicks >self-priming nick inverted repeats >hairpin loops concatemers Fields Virology, 2001

44 Parvoviren kleine nicht umhüllte DNA-Viren (Durchmesser nm) (parvus = klein) Genom: lineare ss-dna, ca Basen Parvovirinae (Vertebraten), Densovirinae (Insekten) felines Panleukopenievirus (Katzenseuche) Minute virus of mice (MVM) Aleutian mink disease virus (Aleuten-Nerzvirus) B19: Erythema infectiosum (Ringelröteln) Dependovirus (helferabhängige Viren): AAV 1-5 Helferfunktionen für AAV Adenoviren: frühe Genprodukte > Induktion von S-Phase keine direkte Interaktion von Ad-Proteinen mit AAV-Genom Herpesviren: HSV-Replikationsproteine

45 Parvoviren DNA-Replikation Genom: lineare einzelsträngige DNA, ca Basen Palindromsequenzen am 5'- und 3'-Ende: > hairpin-strukturen 3'-Palindrom: ca 100 Basen, 5'-Palindrom: Basen DNA-Replikation: im Kern, notwendig: S-Phase Parvoviren können S-Phase nicht induzieren >Parvoviren sind die am stärksten von zellulären Funktionen abhängigen Viren Primer: terminale 3'-Sequenzen der Genom-DNA single strand displacement (model) unidirektionale Leitstrangsynthese rolling hairpin -Synthese Virales Protein für Replikation: NS-1 nukleäres Phosphoprotein, sequenz-spezifische DNA-Bindung, Helicase, an 5'-Ende von replikativer DNA (+ Virion-DNA)kovalent gebunden

46 Parvoviren DNA-Replikation AAV-2 replication intermediate 3 -terminaler hairpin > primer-template Initiation Nick (Rep) > Elongation self-priming, Rückfaltung der Termini strand displacement, rolling hairpin genomic DNA Principles of Virology, 1999

47 Genomreplikation von DNA-Viren Viren Genom Polyoma 5 kb Replikationsproteine viral zellulär T-Ag Primase Polymerase SSBP (RF-A) RF-C (Bel.faktor) Priming RNA Elongation bidirektionale Replikation Papillom 8 kb PCNA (Proz.faktor) Topo II E1 wie Polyoma E2 RNA bid. Replikation

48 Genomreplikation von DNA-Viren Viren Genom Replikationsproteine viral zellulär Adeno 35 kb ptp Initiation: Pol NFI DBP NFIII/Oct1 Elongation: NFII (Topo) für Elongation >9000 bp Priming Protein (ptp) Elongation strand displacement

49 Genomreplikation von DNA-Viren Viren Genom Replikationsproteine viral zellulär Herpes 150 kb DNA-Pol. U L 30 ssdbp U L 29 ori-bind. Protein U L 9 Proz.faktor U L 42 Primase/Helicase: U L 5, 8, 52 Priming RNA Elongation rolling circle head-to-tail- Konkatemere Spaltung in Monomere

50 Genomreplikation von DNA-Viren Viren Genom Pocken kb Replikationsproteine viral zellulär DNA-Polymerase???? Resolvase Replikation im Cytoplasma! Priming Elongation self-priming Rückfaltung der Termini strand displacement rolling hairpin Parvo 5 kb NS1 DNA-Pol. self-priming Rückf. der Termini strand displacement rolling hairpin