Karyotypanalysen durch Chromosomen-Färbungen an HeLa-Zelllinien

Transkript

1 Karyotypanalysen durch Chromosomen-Färbungen an HeLa-Zelllinien Sonja Prohaska A441 1 Einleitung HeLa-Zellen sind Zervixkarzinom-Zellen, die ihre begrenzte Teilbarkeit, wie sie für differenzierte, tierische Zellen üblich ist, verloren haben. Den Namen HeLa haben sie nach den Initialien der Spenderin. Wegen ihrer Teilungsfreudigkeit und einfachen Kultivierung wurden sie von Labor zu Labor weitergegeben und sind heute weltweit für wissenschaftliche Zwecke in Verwendung. Im Laufe der Zeit haben die Zelllinien eine Reihe von Mutationen angehäuft, wesshalb sie sich durch einen stark veränderten Karyotyp auszeichnen. Zur Beschreibung der ausgehändigten HeLa-Zelllinie sollen die Teilungsfreudigkeit (Mitoseindex), die Anzahl der Chromosomen und die Anzahl der NORtragenden Chromosomen bestimmt werden. Zur Erleichterung der Analyse werden unterschiedliche, chromosomale Strukturen sichtbar gemacht, wofür verschiedene Färbemethoden benutzt werden. 1.1 Verwendete Färbemethoden GIEMSA Die GIEMSA Färbung macht eine Bänderung der Chromosomen sichtbar, die mit der Variablität und Aktivität der DNA-Abschnitte zusammenhängt Silberfärbung Die Färbung mit Silber ist im Grunde ein Proteinfärbung. Es erfolgt eine Reduktion von zweiwertigem Silber zu elemetarem Silber (schwarz) die quan- Übungen zur Zellgenetik SS April 2003

2 titativ mit der Anwesenheit der Transkriptionsmaschinerie in chromosomalen Abschnitten correliert, die vor der letzten Mitose stark aktiv waren. Der genaue Prozess ist unklar. Es entstehen konstante Färbemuster. Dabei sind NOR-Regionen (nucleolar organizing regions) am stärksten gefärbt. Darauf folgen die Centromerregionen und zuletzt das ganze Chromosom. Das Silber gefärbte Präparat muss mit GIEMSA gegegefärbt werden DAPI DAPI steht für 4-6-Diamino-2-phenylindol und ist ein DNA-Fluoreszenzfarbstoff. Er bindet über die kleine Furche an AT-reiche Regionen der DNA. Da solche Regionen häufig und gleichverteilt auftreten, resultiert aus der DAPI-- Färbung eine relativ unspezifische Visualisierung von DNA (in allen Lebenslagen). Der Fluorophor wird mit Licht der Wellenlänge 355nm-360nm angeregt und hat sein Fluoreszenzmaximum bei 450nm DAPI/Distamycin A Distamycin A ist ein Peptidantibiotikum, das an AT-reiche Regionen bindet, deren Basen nicht alternierend sind. Es zeigt stärkere Affinität zu diesen Regionen als DAPI und verdrängt dieses somit in einer Kombinations-Färbung. Die daraus resultierenden Bänder sind sind aus alternierenden AT-Paaren zusammengesetzt und entsprechen gewissen heterochromtischen C-Bändern Immunfluoreszenzfärbung Wie andere Farbstoffe, können markierte Antikörper (oder Kombinationen) zur Färbung spezieller, chromosomaler Strukturen herangezogen werden. Die primären Antikörper sind dabei gegen DNA bindende Proteine gerichtet. Die sekundären Antiköprer tragen einen Fluoreszenzfarbstoff, der im Fluoreszenzmikroskop unter definierten Bedingungen zum Fluoreszieren angeregt werden kann FISH FISH ist die Abkürzung für Fluoreszenz in situ Hybridisierung. Dabei werden fluoreszenz-markierte DNA-Sonden mit den Chromosomen hybridisiert. DNA Regionen, die in der Sequenz mit der Sonde identisch sind leuchten dadurch auf. 2

3 2 Material und Methoden HeLa-Zellen wurden mit Colchizin behandelt, das den Aufbau der Spindel hemmt. Die Chromosomen kondensieren wie gewohnt, liegen aber frei in der Zelle vor. Die Zellen werden so in der Metaphase arretiert. HeLa-Zellen wurden in hypotonischer Lösung suspendiert und aus 1m Höhe auf Objektträger getropft. Das bringt sie zum Platzen und spreitet die Chromosomen. Die Proben wurden getrocknet und gefärbt. 2.1 GIEMSA Mit 3% GIEMSA in 1xPBS ph = 6.8 5min. färben, waschen und anschliessend trocknen. An Hand dieser Präparate wurde der Mitoseindex errechnet. 2.2 AgNO 3 /GIEMSA In Boratpuffer 10min. vorinkubieren, dann trocknen. Das mit 100µl AgNO 3 - Lösung und einem Neylonnetzchen bedeckte Präparat wird in der feuchten Kammer bei 60 C getrocknet. Die Präparate wurden zur Bestimmung der Anzahl von Chromosomen insgsamt und der NOR-tragenden Chromosomen verwendet. 2.3 DAPI Präparat für 10min. 20µl DAPI aussetzen, dann abspülen. Nach Auftropfen von 10µl Antifade-Puffer mit einem Deckglas bedecken. 2.4 DAPI/Distamycin A Präparat mit 20µl Distamycin A 10min. inkubieren. Nach Waschen mit Puffer 10min. in 10µl DAPI inkubieren. Mit Wasser waschen, Antifade-Puffer auftropfen und ordnugsgemäß versiegeln. 3

4 3 Ergebnisse 3.1 Mitoseindex Der Mitoseindex gibt den Anteil der Zellen an, die sich zum Zeitpunkt der Betrachtung in der Metaphase befinden (Table 1). Er wird verwendet um die Vitalität von Zellpopulationen zu bestimmen. Da die verwendeten Zellen mit Colchicin arretiert wurden (inhibiert den Aufbau der Spindel und somit das Trennen der Chromosomen), könnte es zu einer Anreicherung von Zellen mit kondensierten Chromosomen kommen, wenn der Eintritt in die M-Phase unbeeinträchtigt bleibt. In diesem Fall wäre der Mitoseindex ein Maß für die Qualität des Arrests. Table 1 Mitoseindex Colchicin-arretierter HeLa-Zellen, Zählergebnisse des gesamten Kurses. M-Phase Interphase Mitoseindex % 3.2 Chromosomenaberrationen in HeLa-Zellen In einer diploiden, menschlichen Zelle befinden sich 46 Chromosomen. Wie in Fig. 2a zu sehen ist, variiert die Anzahl von Chromosomen in einer HeLa- Zelle stark. Im Mittel beträgt die Anzahl 61 Chromosomen. Die stark unterschiedliche Zahl von Chromosmen ist am ehesten durch Polyploidisierung mit darauffolgender Ungleichverteilung und Verlust von einzelnen Chromosomen zu erklären. Fig. 1. Silberfärbung einer Colchizin-arretierten HeLa-Zelle. 4

5 A B frequency 4 3 frequency # chromosomes # NORs Fig. 2. Chromosomenaberrationen in HeLa-Zellen. (A) Verteilung der Chromosomenanzahl in 44 ausgezählten Zellen. (B) Verteilung der Anzahl an NORs in 8 dieser Zellen. Eine diploide Wildtyp-Zelle hat 10 NORs, lokalisiert an den kurzen Armen der akrozentrischen Chromosomen 13, 14, 15, 21, und 22. In den ausgezählten 8 Zellen betrug die Anzahl an NORs im Mittel 8.75 (Fig. 2b) und liegt damit unter der erwarteten Anzahl von NORs. Die niedrige Anzahl an NORs kann durch zufällige Verluste der NOR-tragenden Chromosomen sowie durch Translokationen erklärt werden, bei denen die kurzen Arme verloren gehen. In manchen Präparaten waren an einigen Chromosomen die Centromerregionen stark gefärbt, was ebenfalls auf Translokationen hindeutet. 3.3 DAPI/DA Färbung Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Erklärungen sind in der Bildbeschriftung zu finden. 3.4 Immunfluoreszenzfärbung Die Ergebnisse sind in Fig. 4 bis Fig. 7 dargestellt. Erklärungen sind den Bildbeschriftungen zu entnehmen. 5

6 Fig. 3. (A) DAPI-Färbung vom Methaphasechromosomen. Die Färbung der Chromosomen ist deutlich und gleichmässig. (B) DAPI/Distamycin A-Färbung von kondensierten Chromosomen. Distamycin verdrängt DAPI auf der gesamten Länge der Chromosomen ausser an den repetitiven, heterochromatischen Regionen rund um die Kinetochore, die zu mehr als 50% aus alternierenden AT-Paaren bestehen. Fig. 4. (A) DAPI-Färbung der Chromosomen zweier Zellen. Oben, Kern in der Interphase; Unten, Chromosomen in der Metaphase. (B) Färbung mit Antikörper A. Nur die kondensierten Chromosomen in der Metaphase werden angefärbt. Es handelt sich um AK gegen Methaphase-spezifische Strukturen. In diesem Fall um AK gegen phosphoryliertes Histon H3, das speziell in der Metaphase (und geringfügig an stark transkriptionell aktiven Abschnitten auch in der Interphase (siehe Protokoll Teil Miller) auftritt. 6

7 Fig. 5. (A) DAPI-Färbung der Chromosomen zweier Zellen. Rechts, Kern in der Interphase; Mitte, Chromosomen in der Metaphase. (B) Färbung mit Antikörper B. Sowohl die kondensierten Chromosomen in der Metaphase als auch der Interphasekern werden gleichmässig angefärbt. Es handelt sich um AK gegen Phasen-unspezifische Strukturen. In diesem Fall um AK gegen Histon H1, das immer mit der DNA assoziiert ist. Fig. 6. (A) DAPI-Färbung kondensierter Chromosomen. (B) Färbung mit Antikörper C. Das Bild zeigt diskrete Punkte, die immer paarweise auftreten. Durch Vergleich mit der Chromosomenfärbung in A lässt sich erkennen, dass diese Punkte mit den Centromerregionen zusammenfallen. Es handelt sich daher um AK des CREST-Serums, welche mit CENP-A, einem Kinetochorprotein, reagieren und die Kinetochore anfärben. 7

8 Fig. 7. (A) DAPI-Färbung zweier Kerne. Mitte, Metaphasechromosomen in der Aufsicht auf die Metaphaseplatte; Links unten, Interpasekern mit Aussparung der Färbung, wo die Nukleoli liegen. (B) Färbung mit Anti-Tubulin-Antikörpern. Die sternförmige Struktur in der Mitte entspricht einer mitotischen Spindel in der Aufsicht auf den Pol. Die verschiedenen Typen von Fasern können in diesem Bild nicht unterschieden werden. Links unten sind weniger fasrige Tubulin-Strukturen zu erkennen, die um den Interphasekern herum diffus verteilt sind. Fig. 8. FISH-Färbung der Telomere. Bei genauer Betrachtung ist zu erkennen, dass gepaarte Punkte auftreten, die im Gegensatz zur CREST-Färbung an den Ende der Chromosomen liegen. Einem Chromosom können 4 Punke zugeordnet werden, die den beiden Enden zweier Schwesterchromatiden entsprechen. 8