Verzeichnis der Abkürzungen Einleitung... 9

Transkript

1 Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abkürzungen Einleitung Probiotika Definition und Historisches Klinische Bedeutung probiotisch wirksamer Bakterienstämme Eigenschaften probiotisch wirksamer Bakterienstämme Das Probiotikum E. coli Nissle Besonderheiten des Stammes E. coli Nissle Lipopolysaccharid (LPS) Allgemeine Merkmale des bakteriellen LPS Wirkung des LPS Molekulare Struktur des LPS am Beispiel von E. coli Nissle Mikroarrays Methodisches Prinzip der Mikroarray- Hybridisierung Methodik Material

2 2.1.1 Verwendete Chemikalien Verwendete Kits und Enzyme Verwendete Bakterienstämme Verwendete Lipopolysaccharide (LPS) Verwendetes Spenderblut Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe zur cdns- Markierung Verwendete Mikroarrays Medien und Lösungen Methoden Herstellung der Bakterienrohlysate Vergleichende Wachstumskurvenanalyse der Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W Herstellung von Bakterienlysaten durch Ultraschallbehandlung Bestimmung der Proteinkonzentration im Bakterienlysat nach Bradford Zellpräparation Gewinnung von venösem Vollblut und autologem Plasma Isolation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMZ) Zellzahlbestimmung der PBMZ Inkulturnahme und Stimulation der PBMZ PBMZ- Kulturen PBMZ- Kulturen für die Zytokin- Konzentrationsbestimmung mittels ELISA Vitalitätsprüfung der PBMZ RNS- Präparation Isolation von Gesamt- RNS aus kultivierten PBMZ Denaturierende RNS- Gelelektrophorese mrns- Isolierung aus Gesamt- RNS Bestimmung der Konzentration und Reinheit der mrns

3 Synthese und Markierung von cdns Quantifizierung der in cdns integrierten Menge an Cy-3 bzw. Cy Hybridisierung der Mikroarrays Kompetetive Hybridisierung von Cy-3- und Cy-5- markierter cdns auf Mikroarrays Auslesen der hybridisierten Mikroarrays Auswertung der Mikroarray- Daten Normalisierung der im Mikroarray gemessenen Daten Quantitative real- time PCR Reverse Transkription von mrns in cdns Amplifikation und relative Quantifizierung genspezifischer cdns durch real- time PCR Quantitative Zytokinbestimmung mittels ELISA IL-6- ELISA IL- 10- ELISA IL-12p40- ELISA Ergebnisse Vergleichende Analyse des Wachstumsverhaltens der Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W Etablierungsschritte der Mikroarraymethodik zur Analyse von Genexpressionsprofilen humaner PBMZ nach Stimulation mit bakteriellen Komponenten Ermittlung der benötigten PBMZ- und daraus gewonnener Gesamtbzw. mrns- Menge Bestimmung und Ausgleich unterschiedlicher Markierungsraten von Cy-3 und Cy-5 in cdns für die Mikroarray- Hybridisierung Überprüfung der Angleichung der unterschiedlichen Markierungsraten 3

4 von Cy-3 und Cy-5 durch Mikroarray- Hybridisierung Kontrolle der Spezifität der Mikroarray- Hybridisierung durch den Nachweis stimulus- spezifischer Genexpressionsmuster in PBMZ Genexpressionsanalysen mittels 10K- Mikroarrays Vergleichende Analyse der Genexpressionsmuster in PBMZ induziert durch LPS Nissle, LPS W536 oder LPS S. min Analyse des in PBMZ durch LPS Nissle induzierten Genexpressionsmusters Analyse des Genexpressionsmusters nach Stimulation mit LPS Nissle im Vergleich zu LPS W Vergleich der Genexpressionsmuster von PBMZ nach Stimulation mit LPS S.min. und LPS Nissle Vergleichende Analyse der Genexpressionsmuster von Nissleund W536- Lysat Analyse des in PBMZ durch Nissle- Lysat induzierten Genexpressionsmusters Vergleich der Genexpressionsmuster von PBMZ nach Stimulation mit LPS Nissle im Gegensatz zur Stimulation mit Nissle- Lysat Analyse des durch Nissle- Lysat induzierten Genexpressionsmusters im direkten Vergleich zu W536- Lysat real- time PCR ausgewählter Gene zur genaueren Bestimmung der Genexpression von IL-10, IL-12p40 und CCL Quantifizierungen der Zytokinproduktion nach Stimulation der PBMZ aus Zellkulturüberständen mittels ELISA IL-6- Freisetzung aus PBMZ nach Stimulation mit LPS oder Lysat IL-10- Freisetzung nach Stimulation mit LPS oder Lysat

5 3.5.3 IL-12p40- Freisetzung nach Stimulation mit LPS oder Bakterienlysat Quotient aus den Konzentrationen für IL-12p40 und IL Einfluss einer Hitzebehandlung von LPS und Bakterienlysat auf die Freisetzung von IL-12p40 und IL-10 aus PBMZ Zusammenfassung der Ergebnisse Diskussion Genexpressionsanalyse mittels Mikroarray Einfluss der verkürzten O- spezifischen Kette von LPS Nissle auf die Genexpression von PBMZ Vergleichende Analyse der Rohlysate von E. coli Nissle 1917 und E. coli W Quantitative Analyse der CCL24-, und IL-12p40- Expression Quantitative Analyse der IL-10- Freisetzung Literatur Anhang