SOP-Doku PVP-ASA- 15/1-SSA. Probenvorbereitungen. Proteinfällung mit Sulfosalicylsäure. Version 1.3 /

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1 SOP-Doku PVP-ASA- 15/1-SSA Probenvorbereitungen Version 1.3 / SYKAM Chromatographie Vertriebs GmbH Carl-von-Linde-Straße 2 D Fürstenfeldbruck

2 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 1 of 16 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung: Chemikalien: Sulfosalicylsäure DL Norleucin (IS) ,1 N Salzsäure Amino Acid Calibration Solution PHS Probenverdünnungspuffer Demineralisiertes Wasser Gerätschaften Zentrifuge für Eppendorf Reaktionsgefässe Eppendorf Reaktionsgefässe 2 ml Kühlschrank (7 C) Gefrierschrank (- 15 C) Variable Pipetten Messkolben Analysenwaage (0,1 mg) Vortexer Laborschüttler Schraubdeckelflaschen Glas 1,5 ml Angesetzte Reagenzien mmol/l Norleucin Stammlösung Fällungsreagenz A 30 % SSA Fällungsreagenz B 10 % SSA Fällungsreagenz A 30 % SSA mit IS (1,8 µmol/ml NorLeu) Fällungsreagenz B 10 % SSA mit IS (0,5 µmol/ml NorLeu) AS Kalibrierlösung mit IS Norleucin Kontrolllösung für Fällungsreagenz A Kontrolllösung für Fällungsreagenz B Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz A Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz B Probenvorbereitung mit Proteinfällung Probenvorbereitung bei hoher Proteinkonzentration (ca. 10 %) Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäß mit Fällungsreagenz A (4.9) aus der Gefriereinheit entnehmen leicht antauen lassen (ca. 5 Minuten) und öffnen µl Probenmaterial (z.b. Serum) zudosieren und verschliessen Mehrmals intensiv auf einem Vortexer durchmischen Minuten im Kühlschrank bei 7 C lagern Minuten bei bis U/min zentrifugieren µl Überstand abheben und in ein Probengeber Schraubdeckelglas (1,5 ml) geben Mit 500 µl PVP (2.5) versetzen, kurz vortexen und 30 Minuten im Kühlschrank lagern Probengefässe optisch auf Niederschlag kontrollieren und klare Lösungen in Probenaufgeber überführen Der Interne Standard liegt in der injizierten Probe mit 90 nmol/ml vor... 11

3 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 2 of Probenvorbereitung bei niedriger Proteinkonzentration ( bis ca. 2 %) Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz B (4.10) aus der Gefriereinheit entnehmen leicht antauen lassen (ca. 5 Minuten) und öffnen µl Probenmaterial (z.b. Urin) zudosieren und verschliessen Mehrmals intensiv auf einem Vortexer durchmischen Minuten im Kühlschrank bei 7 C lagern Minuten bei bis U/min zentrifugieren µl Überstand abheben und in ein Probengeber Schraubdeckelglas (1,5 ml) geben Mit 600 µl PVP (2.5) versetzen, kurz vortexen und 30 Minuten im Kühlschrank lagern Probengefässe optisch auf Niederschlag kontrollieren und klare Lösungen in Probenaufgeber überführen Der Interne Standard liegt in der injizierten Probe wie in der Kalibrierlösung mit 100 nmol/ml vor Mitgeltende Unterlagen Historie Genehmigungsprotokoll Erstellt/bearbeitet: K.-H. Jansen/GF Formale Überprüfung: M.Jansen/IL Fachliche Überprüfung: M.Hornung/TS QS-Überprüfung + : Dr. M. Lappé/LQS Doku-: M.Jansen/IL Prüfung auf Aktualität: K.-H. Jansen/GF Anhang... 16

4 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 3 of 16 1 Zusammenfassung: Die Methode ist generell geeignet zur Vorbereitung von flüssigem, proteinhaltigem Probenmaterial wie: Liquor, Serum/Plasma, Urin, Fermentations- und Kulturmedien und Ähnlichem für die Analyse von freien Aminosäuren mit physiologischen Programmen. Die Anleitungen sind spezifisch optimiert für die Analyse mit den SYKAM Aminosäureanalysatoren S 433. Die Vorbereitung beinhaltet eine Proteinfällung mit Sulphosalicylsäure, Zentrifugation des Niederschlages und Aufnahme/Lagerung in einem Li-Citrat Probenvorbereitungs-puffer unter Kühlung. Diese Prozedur sollte direkt nach der Probennahme durchgeführt werden und stabilisiert das Probenmaterial für die physiologischen Aminosäuren für mindestens 4 Tage bis auf die bekannten, kritischen instabilen Aminosäuren*: Glutamin (zu Glutaminsäure), Asparagin (zu Asparaginsäure), Phosphoethanolamin (zu Ethanolamin und Phosphat). Darüber hinaus erhöhen sich bei nicht konsequenter Kühlung von -20 C bis -80 C die Werte für: Tryptophan, Gammaaminobuttersäure, Taurin. Sowie ein leichter Anstieg von: Methionin, Tyrosin, Ornithin, Lysin, Histidin, kann auch öfters auftreten. *ERNDIM : EU BIOMED 2-project, BMH RECOMMENDATIONS TO IMPROVE THE QUALITY OF DIAGNOSTIC QUANTITATIVE ANALYSIS OF AMINO ACIDS IN PLASMA AND URINE USING CATION-EXCHANGE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH POST COLUMN NINHYDRIN REACTION AND DETECTION

5 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 4 of 16 2 Chemikalien: 2.1 Sulfosalicylsäure 5-Sulfosalicylic acid dihydrate, Lieferant: SIGMA-ALDRICH Katalog Nr.: M 254, DL Norleucin (IS) DL Norleucine Lieferant: SIGMA-ALDRICH Katalog Nr.: N 1398 Sigma M 131, ,1 N Salzsäure Salzsäure 0,1 mol/l (0,1 N), gebrauchsfertig Lieferant: Merck Millipore Formel: HCl MW: 36,46 g/mol Dichte: 1,004 g/cm³ (25 C) Katalog Nr.: Amino Acid Calibration Solution PHS 29 Aminosäuren zwischen 0,5 µmol/ml und 1 µmol/ml in 5 ml 0,1 N HCl/0,1 % Phenol Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.:

6 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 5 of Probenverdünnungspuffer Probenverdünnungspuffer/Li, 0,12 N, ph 2,2 Lieferant: SYKAM Chr.Vertr. GmbH Katalog Nr.: Demineralisiertes Wasser Steril filtriert, Leitfähigkeit > 0,1 µs

7 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 6 of 16 3 Gerätschaften 3.1 Zentrifuge für Eppendorf Reaktionsgefässe 3.2 Eppendorf Reaktionsgefässe 2 ml 3.3 Kühlschrank (7 C) 3.4 Gefrierschrank (- 15 C) 3.5 Variable Pipetten 3.6 Messkolben 3.7 Analysenwaage (0,1 mg) 3.8 Vortexer Laborschüttler 3.9 Schraubdeckelflaschen Glas 1,5 ml

8 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 7 of 16 4 Angesetzte Reagenzien mmol/l Norleucin Stammlösung 262,3 mg Norleucin (2.2) werden mit ca. 50 ml 0,1 N HCl (2.3) in ein 100 ml Becherglas überführt und bis zur vollständigen Löslichkeit auf einem Magnetrührer mit einem Magnetfisch gerührt. Die Lösung wird vollständig in einen 100 ml Messkolben überführt und mit 0,1 N HCl bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung entspricht 20 mmol/l (2,62 g/l) DL Norleucin. Überführt in eine Braunglasflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil. 4.2 Fällungsreagenz A 30 % SSA 30 g Sulfosalicylsäure werden in einem Becherglas auf ca. 80 ml mit demineralsiertem Wasser aufgefüllt und auf einem Magnetrührer bis zur vollständigen Löslichkeit mit einem Magnetfisch gerührt. Die Lösung wird in einen 100 ml Messkolben überführt und bis zur Marke mit demineralisiertem Wasser aufgefüllt. Überführt in eine Kunststoffflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil. 4.3 Fällungsreagenz B 10 % SSA 10 g Sulfosalicylsäure werden in einem Becherglas auf ca. 80 ml mit demineralsiertem Wasser aufgefüllt und auf einem Magnetrührer bis zur vollständigen Löslichkeit mit einem Magnetfisch gerührt. Die Lösung wird in einen 100 ml Messkolben überführt und bis zur Marke mit demineralisiertem Wasser aufgefüllt. Überführt in eine Kunststoffflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil.

9 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 8 of Fällungsreagenz A 30 % SSA mit IS (1,8 µmol/ml NorLeu) 9 ml Norleucin Stammlösung (4.1) werden in einem 100 ml Messkolben mit Fällungsreagenz A (4.2) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung entspricht 1,8 mmol/l DL Norleucin. Überführt in eine Braunglasflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil. 4.5 Fällungsreagenz B 10 % SSA mit IS (0,5 µmol/ml NorLeu) 2,5 ml Norleucin Stammlösung (4.1) werden in einem 100 ml Messkolben mit Fällungsreagenz B (4.3) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung entspricht 0,5 mmol DL Norleucin. Überführt in eine Braunglasflasche ist diese Lösung bei 7 C 1 Jahr stabil. 4.6 AS Kalibrierlösung mit IS Norleucin 1 ml AS Standardlösung PHS (2.4) werden in einen 10 ml Messkolben überführt. 500 µl Norleucin Stammlösung (4.1) werden zudosiert. Mit PVP-Lösung (2.5) wird bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung enthält Aminosäuren im Konzentrationsbereich zwischen 50 bis 100 nmol/ml (Harnstoff 1 µmol/ml) und eine interne Standardkonzentration von 100 nmol/ml Norleucin. Diese Lösung ist direkt zur Analyse/Kalibrierung einsetzbar und 8 Wochen gekühlt (7 C) haltbar.

10 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 9 of Kontrolllösung für Fällungsreagenz A 200 µl AS Standardlösung PHS (2.4) werden mit 800 µl PVP (2.5) versetzt. Diese Probe wird zur Kontrolle der Wiederfindung mit Fällungsreagenz A eingesetzt und soll exakt 90 % der Kalibrierlösung entsprechen. Korrektur durch Internen Standard gleich 100 %. 4.8 Kontrolllösung für Fällungsreagenz B 500 µl AS Standardlösung PHS (2.4) werden mit 500 µl PVP (2.5) versetzt. Diese Probe wird zur Kontrolle der Wiederfindung mit Fällungsreagenz B eingesetzt und soll exakt 100 % der Kalibrierlösung entsprechen. 4.9 Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz A In ein 1,5 ml Polypropylen Mikroreaktionsgefäss (Eppi-Cap) mit Dichtkonus werden 100 µl Fällungsreagenz A (4.4) 30 % SSA mit IS (1,8 µmol/ml NorLeu) pipettiert und verschlossen. Die Reaktionsgefässe werden aufrecht bei -15 C gelagert und können 3 Monate zur Probenvorbereitung verwendet werden Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz B In ein 1,5 ml Polypropylen Mikroreaktionsgefäss (Eppi-Cap) mit Dichtkonus werden 500 µl Fällungsreagenz B (4.5) 10 % SSA mit IS (0,5 µmol/ml NorLeu) pipettiert und verschlossen. Die Reaktionsgefässe werden aufrecht bei -15 C gelagert und können 3 Monate zur Probenvorbereitung verwendet werden.

11 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 10 of 16 5 Probenvorbereitung mit Proteinfällung Es werden beispielhaft 2 Probenvorbereitungen für unterschiedliche Matrices vorgestellt. Einmal für Probenmaterial mit hoher Proteinkonzentration (ca. 10 %, z.b. Serum/Plasma) und geringer Aminosäurekonzentration, d.h. geringer Verdünnungsfaktor und einmal geringer Proteinkonzentration mit höherer AS Konzentration und Salzfracht (z.b. Urin). Die beiden Methoden unterscheiden sich in der Konzentration des Fällungsreagenzes und den Dosiervolumina der einzelnen Lösungen zueinander. Zielsetzung ist in beiden Fällen, eine standardähnliche Aminosäurenkonzentration (5 bis 10 nmol je AS) auf die Säule aufzugeben. Die so vorbereiteten Proben können sowohl mit externer Standardkalibration, wie auch mit interner Standardkalibration ausgewertet werden.

12 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 11 of Probenvorbereitung bei hoher Proteinkonzentration (ca. 10 %) Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäß mit Fällungsreagenz A (4.9) aus der Gefriereinheit entnehmen leicht antauen lassen (ca. 5 Minuten) und öffnen µl Probenmaterial (z.b. Serum) zudosieren und verschliessen Mehrmals intensiv auf einem Vortexer durchmischen Minuten im Kühlschrank bei 7 C lagern Minuten bei bis U/min zentrifugieren µl Überstand abheben und in ein Probengeber Schraubdeckelglas (1,5 ml) geben Mit 500 µl PVP (2.5) versetzen, kurz vortexen und 30 Minuten im Kühlschrank lagern Probengefässe optisch auf Niederschlag kontrollieren und klare Lösungen in Probenaufgeber überführen Der Interne Standard liegt in der injizierten Probe mit 90 nmol/ml vor und ergibt dann korrigiert auf 100 nmol/ml (Kalibrierlösung) einen Verdünnungsfaktor von 2. Bei einer externen Kalibrierung müssen die Konzentrationen durch 0,45 (45 µl Serum in 100 µl Aufgabelösung) dividiert werden.

13 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 12 of Probenvorbereitung bei niedriger Proteinkonzentration ( bis ca. 2 %) Konfektioniertes Mikroreaktionsgefäss mit Fällungsreagenz B (4.10) aus der Gefriereinheit entnehmen leicht antauen lassen (ca. 5 Minuten) und öffnen µl Probenmaterial (z.b. Urin) zudosieren und verschliessen Mehrmals intensiv auf einem Vortexer durchmischen Minuten im Kühlschrank bei 7 C lagern Minuten bei bis U/min zentrifugieren µl Überstand abheben und in ein Probengeber Schraubdeckelglas (1,5 ml) geben Mit 600 µl PVP (2.5) versetzen, kurz vortexen und 30 Minuten im Kühlschrank lagern Probengefässe optisch auf Niederschlag kontrollieren und klare Lösungen in Probenaufgeber überführen Der Interne Standard liegt in der injizierten Probe wie in der Kalibrierlösung mit 100 nmol/ml vor. Sowohl bei internem Standard wie auch bei einer externen Kalibrierung müssen die Konzentrationen durch 0,2 (20 µl Urin in 100 µl Aufgabelösung) dividiert werden.

14 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 13 of 16 6 Mitgeltende Unterlagen Sicherheitsdatenblätter SYKAM AS-Puffer und Reagentien ERNDIM : EU BIOMED 2-project, BMH RECOMMENDATIONS TO IMPROVE THE QUALITY OF DIAGNOSTIC QUANTITATIVE ANALYSIS OF AMINO ACIDS IN PLASMA AND URINE USING CATION- EXCHANGE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH POST COLUMN NINHYDRIN REACTION AND DETECTION Protein Purification Robert K. Scopes. 3th edition. Springer-Verlag, New York Methods in Enzymology. Vol Guide to protein purification ed: Murray P. Deutscher. Academic Press San Diego EUROPEAN PHARMACOPEIA 8.0, AMINO ACID ANALYSIS 01/2010:20256

15 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 14 of 16 7 Historie Revision Datum Änderung Neuerstellung SOP Vorlage Neuerstellung SOP Vorlage Aminosäurenanalytik Ph.Eur Neuerstellung SOP Vorlage Neuerstellung SOP

16 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 15 of 16 8 Genehmigungsprotokoll 8.1 Erstellt/bearbeitet: K.-H. Jansen/GF Datum Änderung/Weitergabe Neuerstellung Weitergabe zur formalen Überprüfung 8.2 Formale Überprüfung: M.Jansen/IL Datum Änderung/Weitergabe Formale Überprüfung V Weitergabe zur fachlichen - + QS - Überprüfung 8.3 Fachliche Überprüfung: M.Hornung/TS Datum Änderung/Weitergabe Fachliche Überprüfung V. 1.3 Weitergabe zur QS - Überprüfung 8.4 QS-Überprüfung + : Dr. M. Lappé/LQS Datum Änderung/Weitergabe QS Überprüfung V. 1.3 Weitergabe zur Prüfung auf Aktualität QS- V.1.3 Weitergabe V 1.3 zur Doku 8.5 Doku-: M.Jansen/IL Datum Änderung/Weitergabe Löschung des Draft-Verfahrens, Doku und Veröffentlichung Version Prüfung auf Aktualität: K.-H. Jansen/GF Datum Änderung/Weitergabe Prüfung auf Aktualität V. 1.3 Weitergabe zur QS -

17 Standard Operating Procedure (SOP) Seite: 16 of 16 9 Anhang Anhang Nr. A 1 A 2 Inhalt