Carnobakterien im Wein- Methoden zur Identifizierung von einem Hefen- und Bakterienisolates an GH140 in der Weinbereitung

Transkript

1 Carnobakterien im Wein- Methoden zur Identifizierung von einem Hefen- und Bakterienisolates an GH140 in der Weinbereitung In Zusammenarbeit mit Katharina Mumm, Alexander Prange

2 Gewinnung des Hefe - Bakterienisolates Natürliche Selektion aus dem Freiland oder Keller Trauben werden angekauft und einzeln in Plastiksäckchen verpackt um Kontaminationen zu vermeiden Im Keller werden Tupferproben oder kleine Fassproben gezogen Weitere Bearbeitung erfolgt im Labor 2

3 Traubenbearbeitung Trauben werden gepresst Saft wird in kleine Gärbehälter abgefüllt und danach wird einfach zugewartet (angären lassen) Alkoholzugabe Schwefelzugabe Nach vollzogener Gärung wird Überstand dekantiert und der Bodensatz nochmals mit pasteurisiertem Most aufgegossen 3

4 Reinselektion Erfolgt auf Nährmedienplatten 100µl der gärenden Substanz werden auf einer Platte ausgestrichen Danach werden die Klononien reinkultiviert 4

5 Praktische Testung von GH140 Gärüberprüfung Biochemische Testung Sensorischer Großversuch Eigene Aromatik (nach Käse) Starker Milchsäureabbau 5

6 Gärüberprüfung Gewicht, CO2-Abgang Schaumbildung Chemische Analysen mittels FTIR Anschließende Verkostung der Proben 6

7 Mikroskopische und molekularbiologische Überprüfung Mikroskopisches Bild von GH140 7

8 Molekularbiologische Überprüfung mittels PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl. Polymerase Chain Reaction = PCR) AC1-AC3Primer 8

9 PCR PCR wird eingesetzt, um einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfältigen. Der PCR-Prozess kann nur relativ kurze DNA-Abschnitte kopieren. Bei einer Standard-PCR können dies bis zu etwa Basenpaare (3 kbp) lange DNA-Fragmente sein. 9

10 PCR Der PCR-Prozess besteht aus einer Anzahl von Zyklen, die in einem Thermocycler durchgeführt werden. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten 10 Dr. Csadek Karin Marion Mandl

11 PCR-Restriktionsfragment- Längenpolymorphismus (RFLP) 1. Schritt: PCR einer konservierten Region 2. Schritt: Restriktionsschnitt des PCR-Produkts mit verschiedenen Enzymen 3. Schritt: Agarose-Gel zur Auftrennung der Banden 4. Schritt: Auswertung Agarose - Gel 11

12 1.000bp ob auf Höhe von ungefähr 950bp ub auf Höhe von ungefähr 900bp Der Foto-Ausschnitt zeigt links und rechts den 100bp DNA-Ladder (0,5µg/µl GeneRuler von Fermentas) und mittig die beiden Banden des Hefen-/ Bakterien-Isolats GH140. GH140 Bakterium (mit den Primern Ac1 und Ac3 ): 12

13 Sequenzierung 13

14 Primer ITS 1- ITS4 14

15 Auflistung der PCR-Produkt-Größen der Typ-Stämme S. bayanus, S. cerevisiae und S. paradoxus sowie deren Fragment-Längen, erhalten durch das Schneiden mit den Restriktionsenzymen CfoI, HaeIII und HinfI (entnommen aus: Esteve-Zarzoso et al., 1999, modifiziert). Art Größe des PCR- Produkts (bp) Größe der Restriktions- Fragmente, geschnitten mit CfoI (bp) Größe der Restriktions- Fragmente, geschnitten mit HaeIII (bp) Größe der Restriktions- Fragmente, geschnitten mit HinfI (bp) S. bayanus , , 220, , 155 S. cerevisiae , , 230, 180, , 155 S. paradoxus , , 230, 180, ,

16 Primer Ac1-Ac3 16

17 Die Gattung Carnobacterium wird, jedoch noch nicht sehr lange, zu den Milchsäurebakterien gezählt. Es sind schmale, grampositive Stäbchen-Bakterien, die einzeln, paarweise oder in kurzen Ketten vorkommen. Carnobakterien sind heterofermentativ und haben ihre optimale Wachstumstemperatur bei 30 C. Man findet sie hauptsächlich in Fleischprodukten und Fisch (Holt et al., 2000). bewegliches grampositives Stäbchen ubiquitär psychrotolerant fakultativ anaerob heterofermentativ halten Druck sehr gut aus 17

18 Herzlichen Dank für ihre Aufmerksamkeit 18